付春 唐易 江納 楊瑤君

摘?要：為了揭示原始小球藻AP2基因家族編碼蛋白的理化特性、分子功能和遺傳進(jìn)化特征，該文對原始小球藻AP2基因家族的蛋白成員進(jìn)行了詳細(xì)的生物信息學(xué)預(yù)測和分析，并利用PrtoParam、Pfam 3.20、Protscale等在線工具分析了原始小球藻AP2家族所包含的8個(gè)蛋白成員。結(jié)果表明：該家族成員含有的氨基酸數(shù)為247 （XP_011395646.1）到715 （XP_011401904.1），理論等電點(diǎn)最大為9.39 （XP_011396011.1）、最小為5.81 （XP_011398158.1）;家族中各個(gè)成員所含有的保守結(jié)構(gòu)域的位置和數(shù)量都各不相同;所有蛋白成員均無信號肽，均不包含跨膜螺旋，不具有跨膜區(qū)域;蛋白成員中最大親水性值為-3.222 （XP_011398158.1），最大疏水性值為2.333 （XP_011401904.1），且所有成員的平均親疏水性值均小于0;成員中有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)值遠(yuǎn)超標(biāo)準(zhǔn)值0.5，最大磷酸化位點(diǎn)值為0.998;該基因家族的蛋白成員二級結(jié)構(gòu)的組分含量從大到小排序均為無規(guī)則卷曲>α-螺旋>延伸鏈>β-轉(zhuǎn)角，推測α-螺旋和無規(guī)則卷曲是其二級結(jié)構(gòu)的主要方式，延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角則分散在所有蛋白成員的氨基酸鏈中;所有成員的三級結(jié)構(gòu)分析中均能觀察到α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角以及N端和C端;系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明，在其余15個(gè)物種中，與原始小球藻親緣關(guān)系最遠(yuǎn)的是金牛介球菌（Ostreococcus tauri），親緣關(guān)系最接近的是小球藻（Chlorella variabilis NC64A）和螺旋孢子蟲（Helicosporidium），較接近的是苦參3號（Picochlorum sp.SENEW3）。該研究較系統(tǒng)地分析了原始小球藻AP2蛋白家族的理化特性、保守基序及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，為進(jìn)一步研究原始小球藻AP2轉(zhuǎn)錄因子功能和互作關(guān)系提供一定參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：原始小球藻， AP2轉(zhuǎn)錄因子， 生物信息學(xué)

中圖分類號：Q943

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-3142（2020）12-1800-16

Abstract：In order to reveal the physicochemical properties， molecular functions and genetic evolution characteristics of AP2 gene family encoded proteins in Auxenochlorella protothecoides， in this study， the protein members of AP2 gene family in A.protothecoides are predicted and analyzed in detail by bioinformatics.Eight protein members of the AP2 family of A.protothecoides were analyzed by online tools such as PrtoParam， Pfam 3.20 and Protscale and so on.The results were as follows：Amino acids numbers of the family members were 247（XP_011395646.1） to 715（XP_011401904.1）， the maximum theoretical isoelectric point was 9.39（XP_011396011.1）， and the minimum was 5.81（XP_011398158.1）; The positions and numbers of conserved domains in each member of the family were different; All protein members had no signal peptide， did not contain transmembrane helix， and did not have transmembrane region; The maximum hydrophilicity value of the protein members was -3.222（XP_011398158.1）， and the maximum hydrophobicity value was 2.333（XP_011401904.1）， and the average hydrophilicity/hydrophobicity values of all members were less than 0; The values of many phosphorylation sites in the members were far beyond the standard value of 0.5， and the maximum value of phosphorylation site was 0.998; The component content of secondary structures of protein members in the gene family was arranged in the order of random coil > alpha-helix > extended strand > β-turn; and it is speculated that alpha-helix and random coil are the main modes of its secondary structure， while extended strand and β-turn are dispersed in the amino acid chain of all protein members; Alpha-helix， β-sheet， β-turn， N-terminal and C-terminal were observed in tertiary structure of all members; Phylogenetic analysis showed that Ostreococcus tauri was the most distant relative to Auxenochlorella protothecoides， the closest relatives were Chlorella variabilis NC64A and Helicosporidium， and the next closest relatives were Picochlorum sp.SENEW3 among the other 15 species.This study systematically analyzed the physicochemical properties， conserved motifs and phylogenetic relationships of AP2 protein family in Auxenochlorella protothecoides.It provides a reference for further study on the function and interaction of AP2 transcription factors in A.protothecoides.

Key words：Auxenochlorella protothecoides， AP2 transcription factor， bioinformatics

原始小球藻（Auxenochlorella protothecoides）是一種生長周期短，易培養(yǎng)，可利用光能光合作用進(jìn)行自養(yǎng)，又能利用有機(jī)碳源進(jìn)行異養(yǎng)培養(yǎng)積累油脂，高附加值產(chǎn)物豐富的微藻（汪桂林，2013），它被認(rèn)為是生物柴油最具潛力的原料之一（桂小華，2017）。原始小球藻生長周期短、適應(yīng)性強(qiáng)、光合效率和含油量高、單位面積產(chǎn)量高，現(xiàn)已被作為生物柴油方面主要能源藻種加以研究開發(fā)（汪桂林等，2013）。AP2是植物所特有的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，起到調(diào)控植物生長發(fā)育的轉(zhuǎn)錄以及逆境脅迫等生理過程的作用（栗麗和佟少明，2016）。Jofuku（1994）從模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）中分離了第一個(gè)AP2基因，且該基因與花發(fā)育有關(guān)（張計(jì)育等，2012），其后又在原核生物和藍(lán)藻中發(fā)現(xiàn)了相同的轉(zhuǎn)錄因子（張麒等，2018），證實(shí)該轉(zhuǎn)錄因子不止只存在于植物中。在不同的植物中含有的AP2/ERF 類轉(zhuǎn)錄因子基因家族成員數(shù)量是不同的（Riccardo et al.， 2010），轉(zhuǎn)錄因子AP2/ERF主要特征是具有高度保守的約60～70個(gè)氨基酸組成的AP2結(jié)構(gòu)域（聞可心和劉雪梅，2010），這是植物轉(zhuǎn)錄因子家族之一，其家族成員均包含保守AP2結(jié)構(gòu)域，人們根據(jù)保守結(jié)構(gòu)域的數(shù)量和識別成員的不同，通常情況下，將AP2/ERF家族劃分為不同的4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子亞家族，分別是AP2、ERF、DREBP、RAV和單獨(dú)成員Soloist（張麒等，2018）。轉(zhuǎn)錄因子AP2基因家族在植物生長發(fā)育中起重要作用，它能調(diào)控植物的細(xì)胞周期、生長發(fā)育以及生物和非生物脅迫相關(guān)基因的表達(dá)（吳麗娟等，2016;郭慧等，2017），也能調(diào)控自身生殖器官（花、胚珠和種子）的生長發(fā)育（張妍和孫豐賓，2011;王莉莉，2016），而且與其他因子相互協(xié)作，參與到復(fù)雜的花發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（劉楊，2009）。雖然關(guān)于藻類AP2基因家族的研究較多，但是未見關(guān)于原始小球藻AP2轉(zhuǎn)錄因子的生物信息學(xué)分析的報(bào)道。本研究通過分析原始小球藻的AP2轉(zhuǎn)錄因子編碼蛋白的理化特性、親疏水性、跨膜域、保守結(jié)構(gòu)域、保守基序、亞細(xì)胞定位以及AP2轉(zhuǎn)錄因子在不同物種中的進(jìn)化起源關(guān)系，為進(jìn)一步研究原始小球藻AP2基因家族的生物學(xué)功能奠定一定的理論依據(jù)。

1?材料與方法

1.1 材料

從plantTFDB （http：//planttfdb.cbi.pku.edu.cn/）數(shù)據(jù)庫中下載原始小球藻（Auxenochlorella protothecoides）AP2基因家族中所有成員的蛋白序列和巖藻（Bathycoccus prasinos）、萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）、小球藻（Chlorella variabilis NC64A）、膠球藻（Coccomyxa subellipsoidea C-169）、鹽生杜氏藻（Dunaliella salina）、胸狀盤藻（Gonium pectorale）、螺旋孢子蟲（Helicosporidium）、細(xì)小微胞藻（Micromonas pusilla CCMP1545）、微單胞藻（Micromonas sp.RCC299）、深藍(lán)單殼縫藻（Monoraphidium neglectum）、透明介球菌（Ostreococcus lucimarinus）、介球菌（Ostreococcus sp.RCC809）、金牛介球菌（Ostreococcus tauri）、苦參3號（Picochlorum sp.SENEW3）以及團(tuán)藻（Volvox carteri）等物種的AP2成員蛋白序列。對原始小球藻的AP2所有成員的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行詳細(xì)的生物信息學(xué)分析，且將原始小球藻與巖藻（Bathycoccus prasinos）等16個(gè)物種AP2蛋白進(jìn)行同源序列比對分析并構(gòu)建進(jìn)化樹，探究16個(gè)物種間的進(jìn)化起源關(guān)系。

1.2 方法

1.2.1 AP2轉(zhuǎn)錄因子基因的蛋白成員的一級結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)分析?用在線程序PrtoParam （https：//web.expasy.org/protparam/）對原始小球藻AP2轉(zhuǎn)錄因子蛋白成員的一級結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)進(jìn)行分析，包括了蛋白成員氨基酸數(shù)目、理論pI、分子量、帶負(fù)電氨基酸殘基、帶正電氨基酸殘基、不穩(wěn)定系數(shù)、脂肪指數(shù)、親疏水性、分子式、原子總數(shù)等方面（韓長志和王娟，2016）。通過在線程序Cell-PLoc 2.0 （http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/ Cell-PLoc-2/）對原始小球藻AP2轉(zhuǎn)錄因子的8個(gè)蛋白成員進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析（徐志軍等，2019），參數(shù)設(shè)置：物種選擇為真核生物。

1.2.2 氨基酸的保守結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)及信號肽分析?用Pfam 3.20 （http：//pfam.xfam.org/）對原始小球藻的蛋白成員進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測（張海燕等，2013），統(tǒng)計(jì)分析蛋白成員氨基酸保守結(jié)構(gòu)域的個(gè)數(shù)及位置。在TMHMM Severv.2.0 （http：//www.cbs.dtu.dk/ services/TMHMM/）在線程序中輸入AP2轉(zhuǎn)錄因子基因蛋白成員，分析跨膜螺旋的數(shù)量以及跨膜結(jié)構(gòu)的區(qū)域，確定基因蛋白成員是否具有跨膜區(qū)域，判斷是否為跨膜蛋白。用SignaIP3.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/）對原始小球藻蛋白成員進(jìn)行信號肽分析（柳燕等，2017）。

1.2.3 氨基酸的親疏水性和磷酸化位點(diǎn)預(yù)測分析?用Protscale （https：//web.expasy.org/protscale/）在線工具，對該轉(zhuǎn)錄因子基因蛋白成員進(jìn)行親疏水性預(yù)測分析，確定最大親水值和最大疏水值及其相對應(yīng)的位置，判斷該基因蛋白成員為親水蛋白還是疏水蛋白。用NetPhos 3.1 Server （http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）在線程序?qū)D(zhuǎn)錄因子基因蛋白成員進(jìn)行潛在磷酸化位點(diǎn)預(yù)測分析，并統(tǒng)計(jì)磷酸化位點(diǎn)種類和數(shù)量。

1.2.4 編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析?用SOPMA （https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）在線程序?qū)υ撧D(zhuǎn)錄因子蛋白成員的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析，統(tǒng)計(jì)該蛋白成員中α-螺旋、無規(guī)則卷曲、延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角相對應(yīng)的百分比。通過同源建模法，利用SWISS-MODEL （https：//www.swissmodel.expasy.org/）在線工具（Schwede et al.， 2003），對該蛋白家族的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析，確定其三級結(jié)構(gòu)的組成和構(gòu)象變化。

1.2.5 保守基序分析?用MEME7.0 （http：//meme-suite.org/）在線工具對原始小球藻AP2轉(zhuǎn)錄因子的蛋白成員進(jìn)行保守基序motif分析，參數(shù)設(shè)置：motif數(shù)目為10個(gè)，其余參數(shù)設(shè)為默認(rèn)值。

1.2.6 同源性分析及進(jìn)化樹分析?在plantTFDB （https：//web.expasy.org/protparam/）在線程序中，將原始小球藻的8個(gè)成員序列，分別和同為綠藻門下的其余15個(gè)物種AP2基因家族的蛋白成員進(jìn)行同源序列的對比，找到相對應(yīng)的其余物種的同源序列，并歸納。用MEGA7.0 （Tamura et al.， 2011）軟件中的ClustalW功能對原始小球藻AP2轉(zhuǎn)錄因子所有成員蛋白對應(yīng)的序列組，分別進(jìn)行多重比對并鄰接法構(gòu)建其系統(tǒng)進(jìn)化樹（李建伏等，2008），對比8個(gè)蛋白成員的同源序列的差距，判斷各個(gè)物種與原始小球藻之間的親緣關(guān)系。

2?結(jié)果與分析

2.1 AP2轉(zhuǎn)錄因子基因成員的一級結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)分析

由表1可知，原始小球藻AP2轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族含有8個(gè)成員，該蛋白家族氨基酸數(shù)目范圍為247～715;等電點(diǎn)范圍為5.81（XP_011398158.1）～9.39（XP_011396011.1），其中，XP_011395646.1、XP_011396011.1、XP_011400319.1和XP_011401904.1，理論等電位點(diǎn)>7，為堿性氨基酸，XP_011396127.1、XP_011401790.1、XP_011400550.1和XP_011398158.1，理論等電位點(diǎn)<7，為酸性氨基酸;該家族成員帶負(fù)電氨基酸殘基數(shù)目范圍為26（XP_011395646.1）～85（XP_011401790.1）;該家族成員帶正點(diǎn)氨基酸殘基數(shù)目范圍為26（XP_011398158.1）～81（XP_011401790.1）;不穩(wěn)定指數(shù)均大于40（不穩(wěn)定系數(shù)<40時(shí)穩(wěn)定）（夏巧玉，2007），推斷為不穩(wěn)定蛋白;脂肪指數(shù)范圍為58.87（XP_011401790.1）～74.26（XP_011400550.1）;原始小球藻AP2蛋白成員進(jìn)行的亞細(xì)胞定位分析中顯示該家族全部成員的亞細(xì)胞都可定位于細(xì)胞質(zhì)（Cytoplasm），其中4個(gè)蛋白成員：XP_011396011.1、XP_011400319.1、XP_011401790.1和XP_011398158.1的亞細(xì)胞只定位于細(xì)胞質(zhì)（表1）。通過氨基酸組成分析可知，在所有蛋白成員中，除了XP_011396011.1（氨基酸的最大含量為甘氨酸15.80%）和XP_011398158.1（氨基酸的最大含量為亮氨酸11.10%）兩個(gè)蛋白家族成員外，其余六個(gè)蛋白家族成員含量最高的氨基酸均為丙氨酸，丙氨酸含量最高的成員為XP_011400550.1（19.70%），含有丙氨酸數(shù)為60，丙氨酸含量最低的成員為XP_011400319.1（11.2%），含有丙氨酸數(shù)為38（圖1）。

2.2 氨基酸保守結(jié)構(gòu)域、信號肽和跨膜域結(jié)構(gòu)分析

蛋白成員中，不同基因蛋白成員的AP2保守結(jié)構(gòu)域的數(shù)量和位置各不相同，其中XP_011396127.1（K38-L96，R118-Y178，F(xiàn)200-E260）和XP_011401790.1（S67-D104，W188-A233，S264-E322）兩個(gè)成員各含3個(gè)保守結(jié)構(gòu)域;XP_011398158.1（Y50-E111）和XP_011400550.1（Y29-E96）兩個(gè)成員中各自都只含有1個(gè)氨基酸保守結(jié)構(gòu)域;余下的XP_011395646.1（Y59-T111，F(xiàn)151-A207）、XP_011396011.1（Q169-A233，S264-G322）、XP_011400319.1（K174-E235，Y265-E326）和XP_011401904.1 （Q258-E333，F(xiàn)363-E426）4個(gè)成員，均包含2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域。保守結(jié)構(gòu)域跨度最大成員是XP_011401904.1（Q258-E333），其氨基酸數(shù)量達(dá)75個(gè)，蛋白成員XP_011401790.1（S67-D104）中保守結(jié)構(gòu)域跨度最小，其氨基酸數(shù)量為37個(gè)（表2，圖2）。各個(gè)蛋白成員的位置和跨度都各不相同，但卻有相似，如XP_011395646.1、XP_011400319.1和XP_011401904.1這3個(gè)成員就含有相似之處（圖2）。信號肽分析表明原始小球藻AP2蛋白均不存在信號肽，屬于非分泌型蛋白。TMHMM跨膜域結(jié)構(gòu)分析表明原始小球藻所有蛋白成員均不含跨膜結(jié)構(gòu)域，推斷該蛋白為非跨膜蛋白。

2.3 氨基酸親疏水性預(yù)測分析

在這8個(gè)蛋白家族成員中，氨基酸疏水性的最大值達(dá)到了2.333 （XP_011401904.1），疏水性最小值為1.389 （XP_011398158.1）;氨基酸親水性最大值達(dá)到了-3.222 （XP_011398158.1），親水性最小值為-2.378 （XP_011396127.1）。該家族成員XP_011401904.1的氨基酸親疏水性差值最大，達(dá)到了5.455，對應(yīng)平均親水指數(shù)（GRAVY）為-0.394 5，其第316位氨基酸表現(xiàn)最大疏水性為2.333，第584、585、586、588、589位氨基酸均表現(xiàn)最大親水性為3.122。所有的AP2蛋白家族成員中的平均親水指數(shù)均小于0，所以該蛋白親水性更強(qiáng)，推斷該原始小球藻AP2轉(zhuǎn)錄因子蛋白為親水

2.4 磷酸化位點(diǎn)分析

經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，在閾值為0.5時(shí)，原始小球藻AP2轉(zhuǎn)錄因子蛋白成員中潛在的磷酸化位點(diǎn)最多的是XP_011401790.1 （77），潛在磷酸化位點(diǎn)最少的是XP_011400550.1 （24）。將同種氨基酸對比分析，在整個(gè)家族中，潛在位點(diǎn)為絲氨酸（S）數(shù)量最多的是XP_011401790.1，達(dá)到了49個(gè)位點(diǎn)，數(shù)量最少的是XP_011395646.1和XP_011400550.1兩個(gè)成員，均含有17個(gè)位點(diǎn);潛在位點(diǎn)為蘇氨酸（T）數(shù)量最多的是XP_011401790.1，達(dá)到了24個(gè)位點(diǎn)，數(shù)量最少的是XP_011400550.1，僅含有4個(gè)位點(diǎn);潛在位點(diǎn)為絡(luò)氨酸（Y）數(shù)量最多的是XP_011396011.1和XP_011401904.1，都達(dá)到了5，數(shù)量最少的是XP_011398158.1，僅1個(gè)位點(diǎn)（表4）。在第4個(gè)分支XP_011400319.1中，第164位、第218位的蘇氨酸，第142位、第160位絲氨酸以及第268位絡(luò)氨酸可能是潛在的磷酸化位點(diǎn)，其中最有可能是潛在磷酸化位點(diǎn)的是第142位和第160位的絲氨酸，其值均已達(dá)到0.998，遠(yuǎn)超標(biāo)準(zhǔn)值0.5，同時(shí)也說明蛋白質(zhì)可能通過絲氨酸磷酸化位點(diǎn)來實(shí)現(xiàn)其功能的調(diào)控（表4）。

2.5 原始小球藻AP2轉(zhuǎn)錄因子編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)主要是指蛋白質(zhì)的多肽鏈中有規(guī)則重復(fù)的構(gòu)象 （曹晨和馬堃，2016），在原始小球藻AP2轉(zhuǎn)錄因子基因蛋白成員中，二級結(jié)構(gòu)中組分含量從大到小排序均為無規(guī)則卷曲>α-螺旋>延伸鏈>β-轉(zhuǎn)角，其中無規(guī)則卷曲和α-螺旋的占比較大，推測其空間結(jié)構(gòu)較小，且受到側(cè)鏈間相互作用較大的影響（王月，2017）。基因二級結(jié)構(gòu)組分中α-螺旋值最大的是XP_011400550.1，占比達(dá)到40.00%，α-螺旋值最小的是XP_011396011.1，其占比為26.04%;該蛋白三級結(jié)構(gòu)組分中延伸鏈占比最大為XP_011400319.1，達(dá)16.22%，其延伸鏈最小占比為XP_011396127.1，達(dá)10.40%;該組分中β-轉(zhuǎn)角值為3.64% （XP_011395646.1）～8.64% （XP_011398158.1）;其結(jié)構(gòu)組分中無規(guī)則卷曲值為40.00% （XP_011400550.1）～54.55% （XP_011401904.1）（表5）。由此可推斷，在原始小球藻AP2基因蛋白成員中α-螺旋和無規(guī)則卷曲是二級結(jié)構(gòu)的主要方式，延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角則分散在整個(gè)基因蛋白成員的氨基酸鏈中（表5，圖4）。

蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析表明原始小球藻AP2家族蛋白成員均含有α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角以及成員的N端和C端等結(jié)構(gòu)，其中最主要的結(jié)構(gòu)是α-螺旋，其次是β-折疊。且XP_011398158.1、XP_011400550.1和XP_011398158.1的三級結(jié)構(gòu)高度相似，而XP_011400319.1和XP_011400319.1的三級結(jié)構(gòu)也同樣高度相似（圖5）。

2.6 保守基序MEME分析

通過分析可知，在原始小球藻AP2轉(zhuǎn)錄因子家族的8個(gè)成員中，motif1只存在于XP_011395646.1和XP_011401904.1中;除XP_011400550.1和XP_011398158.1外，其余6個(gè)成員中均含有motif2和motif4;所有成員均包含motif3和motif5;motif6存在于XP_011395646.1和XP_011396011.1中;motif7存在于XP_011396127.1和XP_011398158.1中;motif8存在于XP_011396127.1和XP_011401790.1中;motif9存在于XP_011400319.1、XP_011396127.1和XP_011398158.1中。該家族成員可分為四類，其中XP_011395646.1和XP_011396011.1為一類，都含有motif2、motif3、motif4、motif5、motif6和motif10;第二類是XP_011400319.1和XP_011401904.1， 都含有motif3、motif4和motif5;第三類是XP_011396127.1和XP_011401790.1，都含有motif2、motif3、motif4和motif8;第四類是XP_011400550.1和XP_011398158.1， 都含有motif3和motif5。在原始小球藻AP2蛋白成員中，含有的主要是motif3、motif5（圖6，圖7）。

2.7 同源性比對及進(jìn)化樹分析

將原始小球藻的8個(gè)成員序列分別在plantTFDB在線程序中，與原始小球藻同為綠藻門下的其余15個(gè)物種AP2基因家族的蛋白成員進(jìn)行同源序列的對比，找到相對應(yīng)的其余物種的同源序列，并分別使用MEGA7.0軟件對8個(gè)蛋白成員序列組進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建，對比8個(gè)蛋白成員的同源序列的差距，判斷各個(gè)物種與原始小球藻之間的親緣關(guān)系。在XP_011396127.1和XP_011396011.1兩個(gè)進(jìn)化樹中親緣關(guān)系最遠(yuǎn)的是金牛介球菌，在XP_011395646.1進(jìn)化樹中最遠(yuǎn)的是團(tuán)藻，在XP_011400319.1進(jìn)化樹中，最遠(yuǎn)的是鹽生杜氏藻，在XP_011401790.1進(jìn)化樹中，最遠(yuǎn)的是萊茵衣藻，在XP_011401904.1進(jìn)化樹中，最遠(yuǎn)的是膠球藻，在XP_011400550.1進(jìn)化樹中，最遠(yuǎn)的是深藍(lán)單殼縫藻，在XP_011398158.1進(jìn)化樹中，最遠(yuǎn)的是微單胞藻，根據(jù)此推斷，16個(gè)物種中與原始小球藻親緣關(guān)系最遠(yuǎn)的是金牛介球菌;在XP_011395646.1、XP_011396011.1、XP_011400550.1和XP_011401904.1這4個(gè)進(jìn)化樹中都是螺旋孢子蟲與原始小球藻的親緣關(guān)系最近，在XP_011396127.1和XP_011398158.1進(jìn)化樹中，親緣關(guān)系最近的是小球藻， 在XP_011401790.1進(jìn)化樹中， 親緣關(guān)系最近的是膠球藻，在XP_011400319.1進(jìn)化樹中親緣關(guān)系最近的是苦參3號。在所有的進(jìn)化樹中，小球藻與原始小球藻親緣關(guān)系在同一大分支中一共有7次，苦參3號有6次，螺旋孢子蟲有7次，膠球藻有3次，鹽生杜氏藻有1次，萊茵衣藻有2次，深藍(lán)單殼縫藻、胸狀盤藻和團(tuán)藻各有1次，根據(jù)此推斷，16個(gè)物種中與原始小球藻親緣關(guān)系最接近的是小球藻和螺旋孢子蟲，較接近的是苦參3號 （圖8） 。

3?討論

通過對原始小球藻AP2基因蛋白成員進(jìn)行詳細(xì)的生物信息學(xué)分析后，可較詳細(xì)地了解原始小球藻AP2基因蛋白成員的各種特性。原始小球藻中含有8個(gè)家族成員，而在擬南芥（Arabidopsis）中為18個(gè)（唐美芳，2007），水稻（Oryza sativa）中為26個(gè)（施楊等，2013），玉米中為31個(gè)（莫曉婷等，2013）。可見，不同物種的AP2家族蛋白成員數(shù)量是不一樣的。原始小球藻屬于植物界、小球藻科、真核生物（吳麗娟等，2016），在系統(tǒng)進(jìn)化中最為原始，該蛋白家族成員含有247到715個(gè)氨基酸，在其AP2轉(zhuǎn)錄因子蛋白成員中，含有多個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，但是不存在信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域，且AP2蛋白的親和性平均值均小于0，故其為非分泌、非跨膜、親水性型蛋白。在原始小球藻的理化性質(zhì)分析中，AP2家族成員共編碼3 348個(gè)氨基酸，其中同時(shí)存在堿性氨基酸和酸性氨基酸，不穩(wěn)定系數(shù)>40，為不穩(wěn)定蛋白，而在雷公藤（Tripterygium wilfordii）（祝傳書等，2018）、茶樹（Camellia sinensis）（吳致君等，2014）和棗（Ziziphus jujube）（紀(jì)晴等，2018）中的編碼氨基酸同樣含有堿性氨基酸和酸性氨基酸、為不穩(wěn)定蛋白，但茶樹含有的堿性氨基酸略多于酸性氨基酸，且蛋白質(zhì)殘基為210～290;而棗的酸性氨基酸多于堿性氨基酸，這與本文研究結(jié)果相似。在保守結(jié)構(gòu)域的分析中，不同物種的個(gè)數(shù)及位置不盡相同：原始小球藻和棗（Ziziphus jujube）（紀(jì)晴等，2018）的AP2成員中同樣存在3個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，其中原始小球藻的氨基酸數(shù)量跨度最大，達(dá)到75，但野生大豆（Glycine soja）（朱延明等，2019）的保守結(jié)構(gòu)域個(gè)數(shù)只存在兩個(gè)，其氨基酸數(shù)量跨度較大，達(dá)到104（209～313）。在親疏水性分析中，原始小球藻AP2成員蛋白與菠蘿 AcPEPC 蛋白（馬海洋等，2020）和蔓花生PEPC基因家族（涂嘉琦等，2018）相同，所有蛋白成員均為親水性蛋白，磷酸化位點(diǎn)分析中，原始小球藻AP2蛋白家族成員含有多個(gè)潛在磷酸化位點(diǎn)，最有可能的磷酸化位點(diǎn)為絲氨酸，在蓖麻（Ricinus communis）APs分析中潛在磷酸化位點(diǎn)同樣為絲氨酸。在原始小球藻的二級結(jié)構(gòu)分析中，其二級結(jié)構(gòu)的組分含量從大到小排序均為無規(guī)則卷曲>α-螺旋>延伸鏈>β-轉(zhuǎn)角，α-螺旋和無規(guī)則卷曲是二級結(jié)構(gòu)的主要方式，延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角則分散在所有蛋白成員的氨基酸鏈中，在中國櫻桃（Chinese cherry）（王月，2017）和甘薯（Dioscorea esculenta）（阮先樂等，2017）中的二級結(jié)構(gòu)占比分布和原始小球藻相同，α-螺旋和無規(guī)則卷曲占比最大;但在楊樹（Pterocarya stenoptera）（趙金玲等，2015）中，其組分與原始小球藻有所差異，僅以無規(guī)則卷曲為主。在三級結(jié)構(gòu)分析中，甘藍(lán)與原始小球藻都能明顯觀察到α-螺旋和β-折疊，但原始小球藻三級結(jié)構(gòu)家族成員之間結(jié)構(gòu)差異較大，而甘藍(lán)（Brassica oleracea）（郭慧等，2017）和甘薯（Dioscorea esculenta）（阮先樂等，2017）的家族成員三級結(jié)構(gòu)基本相似。在原始小球藻保守基序中，將所有基序一共分為四類，其中所有成員共同含有的是motif3、motif5，這兩個(gè)可能是參與原始小球藻細(xì)胞生長發(fā)育和逆境脅迫等多個(gè)生理過程有關(guān)的功能基序（栗麗和佟少明，2016）。在原始小球藻AP2蛋白家族中不存在信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域，同樣在沙棘（Hippophae rhamnoides）WRI1轉(zhuǎn)錄因子（馬倩等，2016）蛋白序列和薔薇科植物的19個(gè)DELLA蛋白（宋偉等，2013）序列中也均無信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域，但同時(shí)也存在不同，例如：在花生profilin蛋白（肖杰等，2011）序列中，信號肽位于第1～24位蛋白，卻沒有跨膜結(jié)構(gòu)域;在大豆GmANKTM家族（柏錫等，2019）蛋白中存在跨膜結(jié)構(gòu)域;在小麥（Triticum aestivum）F-box蛋白（王俊生等，2013）基因序列中，第94至第115位存在一個(gè)可能的跨膜區(qū)，且在該蛋白質(zhì)N端序列不存在信號肽。

目前在植物界對AP2轉(zhuǎn)錄因子的研究主要在單雙子葉植物上，如：在擬南芥（Arabidopsis）（Jofuku et al.，1994）中發(fā)現(xiàn)124個(gè)AP2/ERF家族基因;水稻（Oryza sativa）（Nakano， 2006）中發(fā)現(xiàn)了139個(gè)AP2/ERF家族基因;大豆（Glycine max）中發(fā)現(xiàn)了120個(gè)AP2/ERF家族基因（Zhang et al.， 2008）;小蘭嶼蝴蝶蘭（Phalaenopsis equestris）中發(fā)現(xiàn)了107個(gè)AP2/ERF家族基因等（朱光哲，2016）;而在藻類上AP2轉(zhuǎn)錄因子的研究較少。本研究主要描述的是對原始小球藻AP2所有蛋白成員進(jìn)行了詳細(xì)的生物信息學(xué)分析，系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果說明了原始小球藻最為原始，與原始小球藻親緣關(guān)系最遠(yuǎn)的是細(xì)小微胞藻ccmp1545 （Micromonas pusilla CCMP1545），親緣關(guān)系最近的是團(tuán)藻（Volvox carteri）。本研究結(jié)果為今后進(jìn)一步研究AP2轉(zhuǎn)錄因子在原始小球藻生長發(fā)育過程中的生理特點(diǎn)和分子功能提供了一定的參考依據(jù)。

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（責(zé)任編輯?周翠鳴）