時小東 孫夢涵 吳琪 鄔曉勇 趙鋼

摘?要：藜麥營養(yǎng)豐富，油脂含量高，脂肪酸組成理想，是油脂提取物的潛在資源。植物油脂主要以三酰甘油的形式儲存在作物種子和果實等器官中，其合成受到環(huán)境和基因水平的調控，涉及質體、內質網和油體等多個細胞器。該文基于藜麥轉錄組數據，對藜麥油脂合成相關的脂肪酸生物合成途徑基因進行挖掘，并對基因表達模式進行分析。結果表明：在藜麥中，與脂肪酸生物合成相關的基因序列共87條，涉及乙酰CoA羧化酶和β-酮脂酰ACP合成酶等關鍵酶，其中編碼長鏈?；o酶A合成酶基因和β-酮脂酰ACP還原酶數目最多。通過基因表達模式分析發(fā)現，與脂肪酸生物合成相關的基因在種子表達中呈現整體上調模式，可能與種子中油脂形成和積累密切相關。對藜麥乙酰CoA羧化酶亞基編碼基因進行分析發(fā)現，accD基因在不同組織間無差異表達，表明在藜麥中accD編碼的β-CT亞基可能不是影響乙酰CoA羧化酶發(fā)揮作用的限制因子。藜麥KASⅡ含有保守結構域，與其他組織相比，編碼基因QcFb15、QcFb45和QcFb75在種子中均存在上調表達，參與藜麥脂肪酸碳鏈延伸及油脂形成。對藜麥脂肪酸生物合成途徑相關基因的挖掘，為藜麥油脂合成和積累的研究提供了理論基礎，對高油脂藜麥品種選育等后續(xù)研究也具有重要啟示作用。

關鍵詞：藜麥， 轉錄組， 脂肪酸生物合成， 差異表達基因

中圖分類號：Q945

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142（2020）12-1721-11

Abstract：Quinoa is rich in nutrients， high in oil content and ideal in fatty acid composition. It is a potential resource for oil extract. Plant oil is mainly stored in crop seeds and fruits in the form of triacylglycerol， and the biosynthesis of oil is catalyzed by a large set of enzymes and regulated by both environmental factors and related genes. In addition， the synthesis and storage of oil involve plastid， endoplasmic reticulum and oil body. The molecular mechanism related to the synthesis of quinoa oil will provide a basis for breeding of oil-quinoa. In this study， the transcriptome of quinoa was analyzed. Based on quinoa transcriptome data， genes involved in fatty acids biosynthesis were explored， and the expression pattern of quinoa genes related to acetyl CoA carboxylase and β-ketoacyl ACP synthase were analyzed. The results were as follows：There were 87 genes related to fatty acid biosynthesis in quinoa， involving key enzymes such as acetyl CoA carboxylase and β-ketoacyl ACP synthase. The number of long-chain acyl-CoA synthetase gene was the most， followed by the β-oxoacyl-ACP reductase gene. Through pathway enrichment analysis， all of these differentially expressed genes were classified into pathways including fatty acid biosynthesis and fatty acid metabolism which were involved in oil synthesis. Based on gene expression pattern analysis， it was found that the genes related to fatty acid biosynthesis showed up-regulation in quinoa seed， which was closely related to the production and accumulation of oil in seed. The accD gene was not differentially expressed between different tissues， indicating that the β-CT subunit may not be a limitation affecting factor for the function of acetyl-CoA carboxylase. The α-CT protein encoded by accD gene， with no signal peptide and was a hydrophobic protein. However， β-CT was a hydrophilic protein. KAS Ⅱ contained a conserved domain， and QcFb15， QcFb45 and QcFb75 were up-regulated in seeds， which were related to the chain extension of quinoa fatty acids and oil formation. The excavation of genes related to fatty acid biosynthesis pathway of quinoa will provide a theoretical basis for the study of the synthesis and accumulation of oil， and it has important enlightenment for the follow-up research of high oil quinoa varieties.

Key words：quinoa， transcriptome， fatty acid biosynthesis， different expression genes

藜麥（Chenopodium quinoa）為一年生莧科植物，原產于南美洲安第斯山區(qū)，是哥倫比亞到智利中部等地區(qū)重要的糧食作物，已有七千年的栽培歷史（Jacobsen et al.， 2003）。藜麥為四倍體植物，很多質量性狀表現出雙染色體遺傳特性（Maughan et al.， 2004）。藜麥具有豐富的遺傳多樣性和變異性，表現出不同生態(tài)條件下的廣泛適應性，緯度分布廣，海拔分布廣泛。藜麥可以在海平面到海拔4 000?m的范圍種植，耐受土壤貧瘠、干旱和鹽堿等惡劣環(huán)境（Hilal et al.， 2004; Hariadi et al.， 2011）。根據FAO統計（2017），藜麥產量主要集中在秘魯、玻利維亞、厄瓜多爾，智利、阿根廷、哥倫比亞也是主產國。此外，藜麥在美國、印度、意大利、法國等95個國家和地區(qū)均有種植（崔宏亮等，2019）。藜麥雖然自20世紀90年代，已引入我國，但研究進展相對緩慢。近年來，中國農業(yè)科學院作物科學研究所、成都大學等科研機構對藜麥開展了多方面研究。目前，已審（鑒）定藜麥品種10余個，在山西、青海、甘肅、內蒙等18個?。▍^(qū)）進行推廣種植，面積達9 000 hm2（2017年數據），并初步呈現規(guī)?；N植的發(fā)展趨勢?；谵见溤诓涣細夂驐l件下的持久適應能力，因此被認為是各種不良非生物因素限制條件下進行糧食作物生產的最佳選擇之一。

藜麥既是一種極富營養(yǎng)價值的食物，氨基酸配比均衡，含有人體所需的全部必須氨基酸，也是FAO認定的唯一一種單體植物即可滿足人體基本營養(yǎng)需求的食物，因此是最適宜人類的完美“全營養(yǎng)食品”。藜麥籽粒中既不含有谷物中常見的谷蛋白等過敏原，也不含麩質，適合孕婦、嬰幼兒等特殊人群。同時，藜麥富含油類成分，脂肪平均含量為5%～7%，高于玉米脂肪酸含量（3%～4%）（Zevallos et al.， 2012）。藜麥籽粒脂肪酸含量受到品種和種植環(huán)境等因素的影響。徐天才等（2017）對不同海拔下藜麥營養(yǎng)成分進行分析表明，藜麥粗脂肪含量隨海拔升高而增加。胡一波等（2017）對我國北方種植的25份藜麥種質資源進行品質評價，研究表明不同藜麥品種籽粒脂肪酸含量變化范圍為3.51%～6.72%，且與總黃酮含量呈現極顯著正相關性。對不同生育期植株（苗期、初花期、灌漿期和成熟期）進行脂肪酸分析表明，植株全株脂肪酸含量由苗期的9.53%下降到成熟期的3.30%，苗期脂肪酸含量較高（魏玉明等，2018）。此外，因其不飽和脂肪酸豐富，皮膚滲透性好，油脂透明度高，藜麥籽油已經在保健產品、嬰兒乳液、高檔口紅等產品中得到應用。柳慧芳等（2018）建立了藜麥油脂的超臨界CO2萃取工藝，為藜麥油脂開發(fā)利用提供了技術支持。上述研究均表明，藜麥具有較高的油脂含量和理想的脂肪酸組成，既可作為油脂提取物的潛在資源，也被作為非油料種子作物。

植物油脂主要以三酰甘油酯的形式存在，其合成是眾多酶和基因的協同表達和調節(jié)的復雜過程，涉及脂肪酸合成和三酰甘油組裝等過程，大多數步驟已經研究較為透徹（Beisson et al.， 2013）。脂肪酸合成是植物體內油脂形成的第一步，主要發(fā)生在質體，合成需要前體物質乙酰輔酶A的供應，前體物質在乙酰輔酶A羧化酶的作用下生成丙二酰輔酶A，后經過脂肪酸合酶、脂肪酰-ACP硫酯酶等催化，形成不同鏈長的游離脂肪酸（Yuan et al.， 1995; Pidkowich et al.， 2007）。游離脂肪酸在酰基輔酶A合成酶作用下形成?；o酶A，后經過3-磷酸甘油?；D移酶、溶血磷酸?；D移酶、二酰甘油轉酰酶等作用，將?；D移到磷酸甘油骨架上，形成三酰甘油脂（Oakes et al.， 2011）。由此可見，植物油脂合成是多種酶和基因共同參與的復雜過程，這是植物油脂含量和組成表現出復雜多樣性的分子遺傳基礎（陳昊等，2013）。從整體上對植物油脂合成途徑相關基因的挖掘和深入分析，將對全面闡明植物油脂代謝調控網絡提供參考，為植物油脂合成調控奠定基礎。目前，對藜麥油脂方面的研究主要集中于含量、脂肪酸組成和提取工藝等方面，油脂合成調控機理及作用途徑等方面的研究尚未開展，這在一定程度上限制了油脂產量的提高和品質的改善。

本研究在藜麥轉錄組數據基礎上，通過生物信息學方法，確定了其脂肪酸合成途徑中的相關基因，并對基因結構和表達模式進行分析，對差異表達基因進行鑒定。本研究結果將為藜麥高油脂內在機制的解析奠定基礎，同時也為相關功能基因研究和油用藜麥分子育種提供數據支持。

1?材料與方法

1.1 材料

藜麥籽粒種植于成都大學雜糧加工重點實驗室試驗基地，9月份播種，以隴藜2號品種為試驗材料。當材料出現成熟籽粒時，選取5株藜麥，分別取其根、莖、葉、花和種子混勻，使用液氮速凍保存。

1.2 方法

1.2.1 測序文庫構建及測序?轉錄組測序文庫構建及測序工作由北京百邁客生物科技有限公司完成，運用Illumina高通量測序平臺，基于邊合成邊測序技術。

1.2.2 數據處理及基因表達?對測序數據進行質量控制和去雜處理后得到有效序列，運用HISAT2軟件（Kim et al.， 2015）將序列對比到藜麥參考基因組（Jarvis et al.， 2017）。使用BLAST軟件對序列與公共數據庫進行對比，得到注釋信息。采用FPKM衡量基因表達水平，并運用EBSeq進行差異基因分析，篩選標準為差異倍數（Fold Change）≥2且錯誤發(fā)現率（False Discovery Rate）<0.01。

1.2.3 脂肪酸合成途徑基因挖掘?根據KEGG數據庫中脂肪酸合成途徑（ko00061）注釋信息，得到藜麥脂肪酸合成途徑中的相關基因（Kanehisa et al.， 2004）。使用ExPaSy、SOPMA、ProtComp等在線軟件對序列進行生物信息學分析，參數設置為默認值。

2?結果與分析

2.1 測序數據統計

對測序數據進行過濾后，各樣品的有效數據量均大于6.30 GB，Q30堿基百分比均大于92.10%，表明該試驗得到數據質量較高，能夠滿足后續(xù)分析需求。通過對有效序列與藜麥參考基因組進行對比，匹配到參考基因組效率為92.90%～96.63%，說明轉錄組測序數據適合該參考基因組。此外，通過與參考基因組注釋信息進行比較，共發(fā)掘得到7 416個新基因（表1）。將得到的新基因序列分別與公共數據庫中進行對比分析，共5 623個基因序列被注釋，占新基因數量的75.82%。其中：注釋到Nr數據庫的新基因數量最多，有5 578個，占所有新基因數目的75.22%;其次是eggNOG數據庫，注釋新基因數目為3 454個;注釋到KEGG數據庫的新基因數目為1 161個，占挖掘新基因數目的15.66%。

2.2 藜麥脂肪酸合成途徑基因挖掘

基于藜麥基因組和轉錄組數據的KEGG代謝途徑分析，為全面挖掘藜麥營養(yǎng)物質合成途徑解析和代謝網絡構建提供了數據支撐。脂肪酸合成是植物油脂合成的基礎，基于藜麥基因組和不同組織轉錄組數據，對藜麥脂肪酸生物合成途徑（fatty acid biosynthesis，ko00061）進行分析，挖掘得到相關基因87個，共編碼15種酶/蛋白（表2，圖1）。其中：編碼長鏈?；o酶A合成酶（LACS）基因數目最多，為20個;其次為β-酮脂酰ACP還原酶（KAR），編碼基因數目為13個。結合KEGG通路對比結果，構建了藜麥脂肪酸生物合成途徑（圖1），乙酰CoA是藜麥脂肪酸生物合成的前體，其在乙酰CoA羧化酶（ACCase）作用下生成丙二酸單酰CoA，該步驟是從頭合成脂肪酸的第一步反應。上述過程形成的丙二酸單酰CoA是脂肪酸鏈延伸的二碳單位的直接供體。丙二酸單酰CoA再經過脂肪酸合酶（FAS）系統，FAS由5部分組成，分別為丙二酸單酰輔酶A-ACP轉移酶（MAT）、β-酮脂酰ACP合成酶（KAS）、KAR、β-酮脂酰ACP脫水酶（HAD）和烯脂酰ACP還原酶（EAR），在藜麥中編碼基因數目分別為2、11、13、2和3。FAS系統催化連續(xù)循環(huán)，每次增加2個碳長度，直到生成軟脂酸-ACP和硬脂酸ACP，其在?；鵄CP硫酯酶（FAT）的作用下將ACP釋放，終止碳鏈延伸反應。隨后，游離脂肪酸在LACS的作用下形成三酰甘油合成的底物——脂酰CoA。

2.3 藜麥脂肪酸合成途徑基因的組織表達模式分析

基于藜麥根（T1）、莖（T2）、葉（T3）、花（T4）和種子（T5）轉錄組的表達數據，以種子為試驗組，以其他組織為對照組。對篩選的差異表達基因進行Pathway富集性分析，篩選富集度水平（P<0.05）且顯著水平前20個代謝通路進行通路作圖，每組差異表達基因都有一些被歸類于脂肪酸生成途徑，如脂肪酸生物合成途徑、脂肪酸代謝途徑、脂肪酸延長（表3）。對涉及藜麥脂肪酸合成途徑的差異表達基因進行分析，在根vs種子、莖vs種子、葉vs種子和花vs種子中，差異表達基因分別為45個、35個、33個和32個，其中上調表達基因數目分別為39個、31個、22個和25個，下調表達基因數目為6個、4個、11個和7個（圖2）。

2.4 乙酰CoA羧化酶（ACCase）分析

乙酰CoA羧化酶催化作用是脂肪酸生物合成的第一步，也是脂肪酸合成的限速步驟，該步驟依賴ATP，與種子含油量密切相關。乙酰CoA羧化酶由4個亞基組成，即生物素羧基載體蛋白（BCCP）亞基、生物素羧化酶（BC）亞基、羧基轉移酶（CT）的α-CT亞基和β-CT亞基。在藜麥中鑒定出17個基因編碼4個亞基，其中5個accB基因編碼BCCP，2個accC基因編碼BC，7個accA和3個accD基因分別編碼α-CT和β-CT亞基（表4）。在植物中，細胞質中α-CT亞基所表達的前體蛋白被運送到葉綠體中，與β-CT亞基所表達的蛋白結合，形成ACCase的羧基轉移酶（CT），對ACCase功能的發(fā)揮起著重要的作用。在藜麥中，α-CT亞基氨基酸數目介于513～736，理論等電點為8.08～9.14。除去QcFb26，其余α-CT亞基脂溶系數為89.63～95.43 （小于100）， 不穩(wěn)定系數為33.64～37.51（小于40），親水性小于0，推測藜麥α-CT以疏水性脂溶蛋白為主，表現為穩(wěn)定蛋白。β-CT亞基氨基酸數目為237～369，理論等電點為4.75～7.66;脂溶系數為94.64～99.08，均小于100;親水性為0.01～0.10，推測β-CT為親水性脂溶蛋白;其不穩(wěn)定系數為32.74～45.59，穩(wěn)定性具有差異性。通過對信號肽預測，CT亞基不存在信號肽切割位點，是一個非分泌蛋白。

將基因在種子中表達量與其他組織中的表達量進行兩兩對比發(fā)現，11個基因的表達量出現上調表達，除編碼β-CT亞基的accD基因無差異表達外，其余家族編碼基因均在藜麥不同組織間存在差異表達（表5）。與其他4個組織相比，QcFb76（accC）、QcFb8（accA）、QcFb46（accB）基因在種子中均表現為上調表達;與葉片相比，基因QcFb52（accB）在種子中為下調表達，這是挖掘得到唯一的1個下調表達基因;剩余6個基因的表達量在任何組織中均沒有發(fā)生變化。上述結果表明，在種子中ACCase表達量相對其他組織高，有利于種子中脂肪酸的合成，為種子中油脂合成和積累提供更多的底物。

2.5 β-酮脂酰ACP合成酶（KAS）分析

植物脂肪酸的合成是在脂肪酸合成酶的作用下，將C2結構反復添加到脂肪酸鏈中，經過多次循環(huán)，形成不同碳鏈長度的脂肪酸，β-酮脂酰ACP合成酶（KAS）作為脂?；d體，在脂肪酸合成中發(fā)揮著重要的作用。在藜麥中，鑒定出11個KAS基因編碼蛋白，其中7個fabH基因編碼KASⅡ、4個fabF基因編碼KASⅢ（表6）。運用生物信息學軟件，對藜麥KAS家族蛋白理化性質進行預測表明，編碼的KASⅡ氨基酸數目為185～549，理論等電點為5.95～7.99。4個KASⅡ不穩(wěn)定指數小于40，3個KASⅡ大于40，其穩(wěn)定性存在差異;脂溶系數均小于100，推測KASⅡ為脂溶蛋白。SignalP對信號肽進行預測，QcFb47和QcFt53存在信號肽位點，推測可能為分泌型蛋白，其余KASⅡ為非分泌型蛋白。對KASⅢ家族蛋白理化性質分析表明，藜麥中KASⅢ蛋白表現為高度一致性，為不穩(wěn)定的親水性脂溶蛋白。KASⅢ蛋白中也未檢測到信號肽， 預測為非分泌型蛋白。對藜麥KASⅡ序列結構分析表明，含有相對保守的KASⅡ結構GPNYSISTACATSN（F/H/Y）CI;同時，藜麥KASⅡ序列N端氨基酸序列存在差異性，C端氨基酸序列相對保守（圖3）。

將基因在種子中表達量與其他組織中的表達量進行兩兩對比發(fā)現，除QcFb30外，其他KAS編碼基因在種子中均發(fā)現存在上調表達;與葉片相比，1個基因（QcFb29）在種子中出現下調表達，這是挖掘到的唯一的下調表達基因（表5）。對差異表達基因進行分析，與根相比，10個基因為上調表達;與莖相比，8個基因為上調表達;在葉和花中存在上調表達的基因數目為4個和6個。與其他4個組織相比，在種子中QcFb15、QcFb45、QcFb75、QcFb51基因均表現為上調表達。上述結果表明，在種子中KAS編碼基因表達量相對其他組織中高，有利于種子中脂肪酸鏈的延長，為油脂合成提供條件。

3?討論與結論

雖然藜麥全基因組數據已經報道，但藜麥分子生物學研究基礎相對薄弱，功能基因數據仍有待深入地研究（Jarvis et al.， 2017; Zou et al.， 2017）。轉錄組測序技術成本低，靈敏度高，可在短時間內獲得大量基因表達數據，相比其他高通量基因表達數據獲得方法具有明顯的優(yōu)勢，已經在油桐、核桃等產油植物的脂肪酸合成途徑挖掘中得到成功運用（陳昊等，2013; 楊麗等，2017）。本研究利用藜麥5種組織（根、莖、葉、花和種子）轉錄組數據，測序數據Q30堿基百分比均大于92%，對比參考基因組效率大于92%，表明序列測序質量達到轉錄組分析的要求。同時，通過基因組對比分析，挖掘得到了7 461個新基因序列，并有5 623個新基因得到注釋， 新基因的挖掘可能與品種選擇及參考基因組測序質量等原因有關，將為完善藜麥參考基因組序列提供數據。油脂合成代謝過程復雜，涉及多個途徑，如脂肪酸生物合成、脂肪酸延長、脂肪酸去飽和、甘油磷脂代謝等過程，脂肪酸生物合成途徑是油脂合成代謝的前體（White et al.， 2005）。通過對藜麥轉錄組數據進行KEGG功能注釋，挖掘得到了藜麥脂肪酸生物合成途徑信息，共得到87條編碼基因序列。相比其他物種而言，挖掘得到編碼基因數目相對較多，如在油桐中共發(fā)現54條序列歸類于脂肪酸生物合成途徑（陳昊等，2013），在于瑪氏骨條藻（Skeletonema marinoi）中挖掘得到了脂肪酸生物合成途徑相關的轉錄本33個，編碼26種酶（張梅等，2018）。這可能與藜麥脂肪酸生物合成途徑調控相對復雜有關。

對藜麥種子與其他組織脂肪酸生物合成途徑基因的表達譜進行兩兩對比發(fā)現，差異基因表達以上調為主。其中與葉片相比，種子中上調表達基因數目最少，下調表達基因數目最多。魏玉明等（2018）對藜麥不同生育期粗脂肪含量進行測定，結果表明在藜麥成熟期，粗脂肪含量僅存在于葉片和籽粒中，莖稈、根系等組織未檢測到粗脂肪，且葉片和籽粒中脂肪酸含量差異不顯著（P<0.05）。這說明藜麥不同組織轉錄組的分析結果與生理研究結果相一致。

在油脂合成中，脂肪酸生物合成途徑是目前了解最為清晰的途徑（Tran et al.， 2014）。accD是制約質體ACCase活性水平的關鍵制約因子，有研究結果表明通過轉基因技術實現accD超表達，提高了質體ACCase水平，并引起葉片脂肪酸含量的提高和結籽量的增加，但籽粒脂肪酸含量沒有變化（Sasaki et al.， 2001; Madoka et al.， 2003）。對藜麥脂肪酸生物合成途徑基因進行分析，在藜麥乙酰輔酶A羧化酶組成相關的基因中，與其他組織相比，種子中accD基因未發(fā)生差異表達。KAS催化脂肪酸合成的縮合反應，作為脂?；d體，對脂肪酸合成的啟動和循環(huán)起著重要作用。KASⅢ是啟動脂肪酸合成，KASⅡ是催化植物棕櫚酸到硬脂酸轉化過程的關鍵酶，對最終油脂組成起著重要的決定作用，此外還與植物的低溫適應性和植物的生長發(fā)育密切相關（Carlsson et al.， 2002）。在藜麥中，與其他組織相比，在種子中KASⅡ編碼基因fabH均表現出上調表達，使硬脂酸含量增加。Ando et al.（2002）對藜麥籽粒脂肪酸組成的研究結果表明，18碳組成脂肪酸遠高于16碳組成脂肪酸，與藜麥種子中fabH高表達具有一致性。結合藜麥參考基因組和轉錄組數據，對藜麥脂肪酸生物合成途徑進行分析，明確了脂肪酸生物合成途徑相關基因及編碼蛋白信息，為深入研究藜麥脂肪酸形成的分子機理提供了數據支撐，也為解析藜麥油脂形成與基因的關系解析奠定了基礎。

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（責任編輯?蔣巧媛）