彭子艾，李丹丹，夏澳運，王加峰，黃翠紅，王 慧，郭 濤，陳志強

(華南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院/國家植物航天育種工程技術(shù)研究中心，廣東廣州510642)

隨著納米生物技術(shù)的迅速發(fā)展，納米材料可作為基因載體，通過包裹、靜電吸附及化學鍵作用等方式負載外源基因[1-3]，通過細胞吞噬作用將其傳送到細胞內(nèi)，使基因成功表達[4]。與其他納米載體相比，磁性納米載體具有超順磁性優(yōu)勢[5]，在磁場作用下可快速負載、運輸目的基因[6]。有研究表明外源基因成功整合到基因組中需要通過3個細胞屏障：細胞膜、溶酶體和細胞核[7]，影響整合效率的關(guān)鍵因素是避開溶酶體的消化作用[8-9]，納米載體的表面電荷[10]、粒徑大小[11]和修飾功能基團[12]等是影響整合效率的重要因素。有學者提出納米載體基因復合物可通過“質(zhì)子海綿效應”免受溶酶體的消化作用[13-14]。

納米載體基因傳輸技術(shù)為動植物遺傳育種提供了新思路，Wang 等[15]將磁性納米載體與精子介導的基因轉(zhuǎn)染相結(jié)合，獲得了轉(zhuǎn)基因小鼠。Zhao等[16]利用磁性納米顆粒(Magnetic nanoparticle，MNP)作為基因載體，負載pGBIF4ABCΔα 質(zhì)粒，在磁場作用下磁轉(zhuǎn)染棉花花粉，成功篩選到轉(zhuǎn)融合抗蟲基因的棉花。隨著CRISPR 基因編輯和修飾技術(shù)的使用，磁性納米顆粒會是將生物分子傳送到植物體內(nèi)進行基因編輯和修飾的最佳平臺[17]。

本研究選用MNP作為基因載體，負載質(zhì)粒pRGEB32，構(gòu)建了不同質(zhì)量比的納米載體?基因復合物MNP?pRGEB32。通過瓊脂糖凝膠電泳阻滯試驗評價和分析了MNP對pRGEB32 的結(jié)合和保護能力。通過納米粒度分析儀、Zeta 電位分析儀、透射電子顯微鏡和原子力顯微鏡對MNP 和MNP?pRGEB32復合物的粒徑、表面電位、形貌、分布等進行了檢測和觀察，研究了MNP?pRGEB32復合物的生物物理特性、基因負載形態(tài)與負載機理，以期為MNP負載CRISPR/Cas9表達載體的應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

MNP poly MAG1000購自德國Chemicell公司；DNase I 購自TaKaRa 公司；無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒購自TIANGEN 生物技術(shù)有限公司；含CRISPR/Cas9表達載體pRGEB32[18]的大腸埃希菌EscherichiacoliDH5α 由國家植物航天育種工程技術(shù)研究中心保存；核酸染料GelRed 購自美國Biotium公司。

1.2 質(zhì)粒DNA 的提取與純化

取pRGEB32(15 888 bp)大腸埃希菌菌液加入到含50 ng/μL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基(每升培養(yǎng)基含酵母提取物5 g、胰蛋白胨10 g、NaCl 10 g)中，于37℃、220 r/m in 培養(yǎng)16 h，按照TIANGEN無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒說明書提取質(zhì)粒。利用超微量紫外分光度計測定質(zhì)粒DNA 的濃度和純度，選取D260nm/D280 nm≈1.8的質(zhì)粒DNA 于?20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 磁性納米顆粒?DNA 復合物的制備

pRGEB32質(zhì)量固定為4μg，將poly MAG1000和pRGEB32按照質(zhì)量比為1∶1、1∶4、1∶8、1∶16、1∶24、1∶40、1∶50混合，于37℃條件下培育30m in，連接制備MNP?DNA 復合物。

1.4 瓊脂糖凝膠阻滯試驗

將MNP?pRGEB32復合物點樣在8 g/L 的瓊脂糖凝膠(含7μL 熒光染料GelRed)上，在TAE緩沖液中于130 V 電泳30m in，然后在凝膠成像儀上觀察，分析MNP對pRGEB32的負載能力；同時，將MNP?pRGEB32復合物在37℃分別用DNase I酶切4 h，用Hind III和BsaI 雙酶切16 h，然后電泳跑膠，分析對MNP對pRGEB32的保護能力。

1.5 粒度分布及Zeta 電位分析

將MNP和pRGEB32按照質(zhì)量比為1∶1、1∶4、1∶8制備的MNP?pRGEB32復合物分別用超純水稀釋至0.001μg/μL，采用納米粒度分析儀及Zeta電位分析儀分析粒度分布及Zeta 電位。

1.6 透射電子顯微鏡觀測

吸取MNP和MNP、pRGEB32質(zhì)量比為1∶1的MNP?pRGEB32復合物，用超純水分別稀釋至0.001μg/μL，各取10μL 均勻滴加到干凈的碳膜覆蓋的銅網(wǎng)上，用濾紙吸干多余的液體，靜置晾干30m in，用20 g/L的磷鎢酸負染1m in，置于干凈的培養(yǎng)皿中自然干燥，然后在透射電子顯微鏡下觀測形態(tài)并拍照。

1.7 原子力顯微鏡觀測

吸取M NP和p RGEB 32質(zhì)量比為1∶1的MNP?pRGEB32 復合物，用超純水稀釋至0.01μg/μL，取10μL 均勻滴加到新剝離的云母片表面，置于干凈的培養(yǎng)皿中自然干燥，然后在原子力顯微鏡下掃描成像，用NanoScope Analysis 1.5在Height Sensor 模式下分析圖像。

2 結(jié)果與分析

2.1 磁性納米顆粒對質(zhì)粒DNA 負載和保護能力分析

2.1.1 磁性納米顆粒對質(zhì)粒DNA 的負載能力分析MNP和pRGEB 32質(zhì)量比為1∶1、1∶4、1∶8、1∶16時，MNP與pRGEB32完全結(jié)合，泳道中無游離的pRGEB32；質(zhì)量比為1∶24、1∶40、1∶50時，逐漸減少的MNP難以負載逐步增多的pRGEB32，形成的MNP?pRGEB32復合物較少，過量的pRGEB32在泳道中呈現(xiàn)明顯條帶(圖1)。結(jié)果表明MNP能有效裝載相當于自身質(zhì)量16倍的pRGEB32。

圖1 MNP?pRGEB32復合物電泳分析Fig.1 Electrophoreses analyses of MNP-pRGEB 32 complexes

2.1.2 磁性納米載體對pRGEB32的保護能力分析MNP?pRGEB32復合物用核酸酶DNase I處理4 h 后，質(zhì)量比為1∶1、1∶4、1∶8、1∶16的復合物樣品仍停留在點樣孔，純質(zhì)粒及質(zhì)量比為1∶24、1∶40、1∶50的復合物樣品中過量的DNA 被完全消化，完全結(jié)合的MNP?pRGEB32復合物停留在點樣孔(圖2)。MNP?pRGEB32復合物用Hind III 和BsaI 雙酶切16 h 后，純質(zhì)粒及質(zhì)量比為1∶24、1∶40、1∶50的復合物樣品中過量的DNA 隨電場遷移，被限制性內(nèi)切酶Hind III和BsaI切開形成2條線性質(zhì)粒條帶，MNP?pRGEB32復合物質(zhì)量比為1∶1、1∶4、1∶8、1∶16的泳道沒有DNA 痕跡，說明MNP?pRGEB32復合物沒有被酶切割(圖3)。結(jié)果證明MNP 能保護其負載的pRGEB32 免受酶促降解。

圖2 MNP?pRGEB32復合物用DNase I 酶切處理的電泳分析Fig.2 Electrophoresis analyses of MNP-pRGEB 32 complexes digested with DNase I

2.2 粒度分布及Zeta 電位分析

納米粒度及Zeta 電位分析儀結(jié)果顯示，MNP的平均疏水粒徑為127.5 nm，Zeta 電位為12.1m V，在結(jié)合帶負電的pRGEB32后，MNP?pRGEB32復合物的粒徑增大，Zeta 電位降低(圖4)。隨著結(jié)合的pRGEB32的量逐漸增加，MNP?pRGEB32復合物的粒徑也逐漸增加，Zeta 電位逐漸降低。結(jié)果說明MNP能通過靜電作用負載pRGEB32，并能有效地結(jié)合和負載pRGEB32形成納米載體基因復合物。

圖3 MNP?pRGEB32復合物用Hin d III 和Bsa I 雙酶切處理的電泳分析Fig.3 Electrophoresis analyses of MNP-pRGEB 32 complexes digested with Hin d III and Bsa I

圖4 MNP和MNP?pRGEB32復合物的粒徑及Zeta 電位分析Fig.4 Size distribution and Zeta potential of MNP and MNP-pRGEB32 complex

2.3 透射電子顯微鏡觀測

透射電鏡下MNP為規(guī)則球形，分散性較好，粒徑約10～150 nm(圖5a)。中心深色部分為磁性氧化鐵核心，外層附有陽離子PEI膜包裹(圖5b)。MNP與pRGEB32結(jié)合后大量的pRGEB32被壓縮、吸附、聚集在納米顆粒表面(圖5c和5d)。試驗表明MNP可攜帶大量的pRGEB32，從而作為外源基因轉(zhuǎn)移的載體。

2.4 原子力顯微鏡觀測

原子力顯微鏡觀察到MNP周圍吸附了桿狀的pRGEB32，以載體顆粒為中心，越靠近中心濃度越高，呈放射狀向外擴展(圖6)，與透射電鏡觀測的形態(tài)相符合。這種高濃度的聚集有利于載體顆粒攜帶大量的pRGEB32，從而通過細胞的吞噬作用將外源基因傳送至細胞內(nèi)部。

圖5 MNP和MNP?pRGEB32復合物的透射電鏡圖像Fig.5 Transmission electron microscope images of MNP and MNP-pRGEB32 complex

圖6 MNP?pRGEB32復合物的原子力顯微鏡圖像Fig.6 Atomic force microscope images of MNP and MNP-pRGEB32 complex

3 討論與結(jié)論

納米技術(shù)已經(jīng)與許多學科交叉研究，具有巨大的潛在價值，已經(jīng)廣泛應用于生物及醫(yī)學領(lǐng)域[19-21]。理想的基因載體應該能有效地負載外源核酸，具有較高的生物相容性，在細胞質(zhì)內(nèi)可以有效保護外源核酸免受酶促降解，使其最終能實現(xiàn)高效表達[22-23]。瓊脂糖凝膠電泳阻滯試驗顯示了MNP高效負載pRGEB32的能力，并能夠有效保護pRGEB32免受核酸酶降解作用。有研究推測可能是DNA 和納米載體結(jié)合后導致DNA 構(gòu)象發(fā)生變化，阻止M g2+、核酸酶與DNA 接觸，從而保護DNA 免受酶的消化作用[24-25]。通過粒度分布和Zeta 電位測試顯示MNP結(jié)合pRGEB32后，粒徑增大，電位降低，說明二者通過靜電相互作用形成了MNP?pRGEB32復合物。透射電鏡和原子力顯微鏡的觀測證實pRGEB32被吸附壓縮后聚集在MNP表面[26]，這種壓縮和高濃度的聚集，使載體能夠有效地負載和保護pRGEB32。通過上述結(jié)果可知，M NP在負載、聚集和保護pRGEB32方面表現(xiàn)優(yōu)越，是一種理想的基因載體。

有研究通過磁性納米載體負載外源基因，將外源基因整合到生殖細胞中，外源基因能在后代穩(wěn)定遺傳[16]。同時有研究證明可以利用CRISPR/Cas9編輯性細胞基因組，如Chapman 等[27]利用CRISPR/Cas9直接編輯大鼠的精原細胞，產(chǎn)生純合非鑲嵌突變后代。若能將納米材料和CRISPR 基因編輯技術(shù)有效結(jié)合，直接對動植物生殖細胞定向編輯，將克服傳統(tǒng)方式中部分物種基因轉(zhuǎn)化困難、育種周期長等瓶頸問題。本試驗證實磁性納米載體能有效結(jié)合CRISPR 編輯系統(tǒng)，為探索基于磁性納米載體定向編輯技術(shù)的研究奠定了基礎。