□ 鐘銀飛 安徽省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院

1 前言

硒是14種人體必需微量元素之一，具有一定的營養(yǎng)作用。另一方面，硒過量攝入會引起人體中毒。同時(shí)，不同形態(tài)硒直接影響食品的營養(yǎng)價(jià)值和安全性，因此對形態(tài)硒化合物進(jìn)行研究測定具有重要意義[1]。本文以大蒜為代表檢測樣品，對流動相濃度、pH值、流速以及在線紫外消解條件進(jìn)行研究，優(yōu)化液相—原子熒光（LC—AFS）聯(lián)用技術(shù)檢測硒代胱氨酸、亞硒酸跟、硒代蛋氨酸3種形態(tài)硒的條件，確定了最佳檢測條件[2]。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 實(shí)驗(yàn)儀器

SA720原子熒光形態(tài)分析儀、pH酸度計(jì)、氮吹儀、純水機(jī)與電子天平。

2.2 試劑

亞硒酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液（GBW10032，購于中國計(jì)量科學(xué)研究院）：濃度為68.9 μg/g，以亞硒酸根計(jì)。

硒代胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（GBW10087，購于中國計(jì)量科學(xué)研究院）：濃度為93.5 μg/g，以硒代胱氨酸計(jì)。

硒代蛋氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（GBW10034，購于中國計(jì)量科學(xué)研究院）：濃度為97.9 μg/g，以硒代蛋氨酸計(jì)。

流動相：稱取6.8 g優(yōu)級純磷酸氫二銨，溶解于一級水，定容于1 000 mL，用氨水調(diào)節(jié)pH值為6.0，配制成60 mmol/L的磷酸氫二銨溶液。

還原劑：2.0%KBH4（m/v）+0.5%KOH（m/v）+0.4%KI（m/v）；載流：15%鹽酸（v/v）。

2.3 色譜條件及熒光條件

色譜柱：PRP—X100陰離子交換柱（250 mm×4.0 mm）及保護(hù)柱（25 mm×4.0 mm）；流動相：60 mmol/L磷酸氫二銨溶液，流速1.2 mL/min，進(jìn)樣體積200 μL。熒光條件：倍增管高壓：280 V；燈電流：50/50 mA；爐溫：280 ℃；載氣：300 mL/min；屏蔽氣：600 mL/min；在線紫外消解[3]。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將3種形態(tài)硒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用一級水溶解定容到棕色容量瓶中，分別配制成標(biāo)準(zhǔn)溶液母液。臨用前，用移液器移取一定量的3種形態(tài)硒標(biāo)準(zhǔn)溶液用二次去離子溶解定容到棕色容量瓶中配制成系列溶度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為硒代胱氨酸145、290、435、580 μg/L 和 725 μg/L， 亞 硒 酸 根 43、86、129、172 μg/L 和 215 μg/L，硒代蛋氨酸 119、238、357、476 μg/L與595 μg/L。依次進(jìn)樣，繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線（需當(dāng)天配制）。

2.5 樣品前處理和檢測

稱取粉碎后的大蒜樣品5 g于50 mL離心管中，向樣品中加入15 mL甲醇水（1∶2）溶液，渦旋混勻，超聲提取20 min，離心10 min（8 000 r/min），離心后將上清液轉(zhuǎn)移至10 mL比色管中；重復(fù)上述步驟，合并上清液，氮吹濃縮，將濃縮后的溶液加一級水定容至10 mL，過0.45 μm濾膜備用，標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣完成后上機(jī)檢測。

2.6 計(jì)算

按式（1）計(jì)算試樣中各種形態(tài)硒的含量。

C=(A×V×D)/(W×1000) （1）

式（1）中：C為形態(tài)硒含量，單位mg/kg；A為測得樣液中濃度，單位μg/L；V為樣液定容體積，單位mL；W為樣品稱量，單位g；D為稀釋因子。

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜分離情況

硒代胱氨酸保留時(shí)間2.6 min、亞硒酸根保留時(shí)間4.4 min、硒代蛋氨酸保留時(shí)間6.0 min，3種形態(tài)硒標(biāo)準(zhǔn)溶液的分離色譜圖詳見圖1。

3.2 檢測條件的優(yōu)化

3.2.1 流動相濃度

以40～80 mmol/L濃度范圍的磷酸氫二銨溶液為流動相，考察流動相濃度對形態(tài)硒分離和響應(yīng)值的影響。當(dāng)濃度小于50 mmol/L時(shí)，3種形態(tài)硒保留時(shí)間延長且峰形展寬；當(dāng)濃度大于50 mmol/L時(shí)，3種形態(tài)硒保留時(shí)間保留時(shí)間變短；當(dāng)濃度大于60 mmol/L時(shí)色譜峰重疊，分離度變差；當(dāng)濃度為60 mmol/L時(shí)3種形態(tài)硒能夠在8 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)有效分離。

3.2.2 流動相pH

圖1 硒代胱氨酸、亞硒酸跟、硒代蛋氨酸等三種形態(tài)硒標(biāo)準(zhǔn)溶液分離色譜圖

配制60 mmol/L磷酸氫二銨溶液流動相，用氨水調(diào)節(jié)pH值為4.5～6.5，考察不同pH對3種形態(tài)硒分離效果的影響。實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)pH值降低，保留時(shí)間減少，當(dāng)pH值小于5.0時(shí)，3種形態(tài)硒不能達(dá)到有效分離；當(dāng)pH值增加時(shí)，保留時(shí)間增加，當(dāng)pH值大于6.0后峰形變寬，靈敏度下降；當(dāng)pH值為6.0時(shí)，3種形態(tài)硒能夠?qū)崿F(xiàn)有效分離。

3.2.3 流動相流速

設(shè)定流速為0.8、1.0、1.2 mL/min和1.4 mL/min進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)流速小于1.0 mL/min時(shí)，保留時(shí)間較長，峰形展寬；當(dāng)流速大于1.2 mL/min后，保留時(shí)間減少，當(dāng)分離度下降；當(dāng)流速為1.2 mL/min時(shí)，能夠在8 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)有效分離，分離度較好。

3.2.4 在線紫外消解

直接激發(fā)除亞硒酸根外，硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸的有機(jī)硒響應(yīng)信號非常低，當(dāng)開啟在線紫外消解功能后，有機(jī)硒響應(yīng)信號顯著上升，所以在形態(tài)硒檢測過程中需要保證在線紫外消解效果。

3.3 方法的線性及檢出限

配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在上述實(shí)驗(yàn)條件下找出線性范圍。實(shí)驗(yàn)證明：硒代胱氨酸在60～720 μg/L時(shí)，峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系，峰面積A與濃度C的線性方程為C=2 600.240A—102 939.151，相關(guān) 系 數(shù)為0.997，檢出限為60 μg/L；亞硒酸根在10～210 μg/L時(shí)，峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系，峰面積A與濃度C的線性方程為C=13 536.850A+36 463.015，相關(guān)系數(shù)為0.999，檢出限為10 μg/L；硒代蛋氨酸在55～590 μg/L時(shí)，峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系，峰面積A 與濃度C的線性方程為C=1 101.099A—46 290.586，相關(guān)系數(shù)為0.999，檢出限為55 μg/L。

3.4 方法的精密度及回收率

以大蒜為代表樣品，添加一定量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)做陽性樣，按上述方法進(jìn)行檢測，連續(xù)進(jìn)樣測定8次，測定其精密度RSD，并加人適量標(biāo)準(zhǔn)溶液測定其回收率，結(jié)果見表1。

由上表可知，大蒜中硒代胱氨酸、亞硒酸根和硒代蛋氨酸的檢測精密度分別為1.5%、2.8%和1.0%，回收率分別為85.3%、89.8%和83.2%，該方法具有良好的精密度和加標(biāo)回收。

表1 大蒜中樣品中硒代胱氨酸、亞硒酸根和硒代蛋氨酸含量測定