陳拓宇 栗琳 趙忙所 薛超強(qiáng) 張玉琪

釉質(zhì)上皮型顱咽管瘤（adamantinomatous craniopharyngioma，ACP）是臨床最常見(jiàn)的顱咽管瘤類型，兒童大多都是ACP，而成人約1/6 為鱗狀乳頭型顱咽管瘤（squamous papillary craniopharyngioma，SPCP），其余為ACP[1]。臨床上ACP 的生物學(xué)特性導(dǎo)致其手術(shù)難度大、并發(fā)癥多，術(shù)后復(fù)發(fā)率高。因此，ACP 是否具有侵襲性一直是研究的熱點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者都在試圖探尋一種能判斷ACP 侵襲性強(qiáng)弱或可隨訪的指標(biāo)。熱休克蛋白90α（heat shock protein 90α，Hsp90α）是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種能界定腫瘤侵襲性強(qiáng)弱的標(biāo)志物，已通過(guò)血漿檢測(cè)，在肺癌、肝癌、乳腺癌等腫瘤患者體內(nèi)被檢測(cè)確定，但對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)腫瘤的研究還是空白[2]。本研究主要運(yùn)用ELISA 法，定量檢測(cè)、分析患者血漿及腦脊液中Hsp90α 含量的差異，結(jié)合Western blot 法血漿檢測(cè)結(jié)果與病理診斷，研究ACP 是否具有侵襲性及其侵襲性強(qiáng)弱，現(xiàn)報(bào)道如下。

資料與方法

一、分組及入組標(biāo)準(zhǔn)

選取自2014 年7 月至2015 年10 月清華大學(xué)玉泉醫(yī)院神經(jīng)外科手術(shù)治療的患者為研究對(duì)象，分為4 組，其中3 組為顱內(nèi)腫瘤患者[ACP 組、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma，GBM）組、脈絡(luò)叢乳頭狀瘤（choroid plexus papilloma，CPP）組]，1 組為顱骨修補(bǔ)患者。（1）顱內(nèi)腫瘤患者均需經(jīng)術(shù)后病理學(xué)確診，為WHO Ⅰ級(jí)的ACP 或WHO Ⅳ級(jí)的GBM 或WHO Ⅰ級(jí)的典型CPP。排除不能承受或拒絕行腰椎穿刺留取腦脊液的患者；是否為首發(fā)腫瘤未設(shè)要求。（2）顱骨缺損對(duì)照組：患者為外傷后行去骨瓣減壓術(shù)后行顱骨修補(bǔ)的患者，無(wú)腦內(nèi)器質(zhì)性病變，骨瓣減壓術(shù)后≥3個(gè)月，傷口已完全愈合，無(wú)感染、炎癥、出血、腦水腫或腦積水等；術(shù)前血漿C-反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）在正常范圍內(nèi)。（3）所有患者的年齡、性別均不限。（4）本研究方案提請(qǐng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)道德委員會(huì)審查并通過(guò)，患者或其家屬簽署知情同意書(shū)。

二、一般資料

納入患者32 例。ACP 組患者14 例，其中男性8例，女性6 例；年齡范圍5～53 歲，平均17.7 歲；首發(fā)ACP 7 例，復(fù)發(fā)ACP 7 例（3 例經(jīng)過(guò)放療后復(fù)發(fā)）。GBM 組患者6 例，男性3 例，女性3 例，年齡范圍49～76 歲，平均60.5 歲，其中首發(fā)GBM 5 例，復(fù)發(fā)GBM 1 例（經(jīng)過(guò)化療后近半年再次復(fù)發(fā)）。CPP 組患者6 例，男性4 例，女性2 例，年齡范圍5 個(gè)月～4歲，平均19 個(gè)月，均為首發(fā)腫瘤。顱骨缺損對(duì)照組患者6 例，其中男性4 例，女性2 例，年齡范圍3～12歲，平均8.3 歲；顱骨缺損均為外傷所致，其中3 例車(chē)禍傷，2 例墜落傷，1 例鈍器傷；受傷時(shí)間最短4 個(gè)月，最長(zhǎng)3 年，平均1 年9 個(gè)月。

三、標(biāo)本采集

（1）血漿標(biāo)本：入組患者均在清晨未進(jìn)食狀態(tài)下用乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)抗凝管采集10 mL 靜脈血，并盡快在低溫條件下送至實(shí)驗(yàn)室離心（4℃、1300 g、10 min），取上層血漿備用。（2）腦脊液標(biāo)本：為避免術(shù)中留取腦脊液時(shí)誤將血漿成分混入腦脊液，均采用全身麻醉后，于開(kāi)顱前在手術(shù)臺(tái)上行腰椎穿刺術(shù)留取腦脊液10 mL，余步驟同前。

四、血漿及腦脊液Hsp90α 含量測(cè)量

用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA 法）實(shí)驗(yàn)定量測(cè)量上述4 組患者的血漿及腦脊液Hsp90α 含量。血漿樣本高速離心（4℃、14 000 g、10 min）后取上清100 μL，腦脊液以同樣方法取100 μL，用于Hsp90α 定量檢測(cè)試劑盒（煙臺(tái)普羅吉生物發(fā)展有限公司）的檢測(cè)，檢測(cè)步驟嚴(yán)格遵從試劑盒使用說(shuō)明書(shū)。ELISA 樣本檢測(cè)通過(guò)跟試劑盒內(nèi)自帶的5 個(gè)濃度樣本所作出的標(biāo)準(zhǔn)曲線作對(duì)比，用酶標(biāo)儀進(jìn)行讀數(shù)。

五、Western blot 測(cè)定血漿中Hsp90α 和Actin蛋白的含量

采用蛋白免疫印跡法（Western blot 法）檢測(cè)上述患者血漿中Hsp90α 和Actin 蛋白的含量，用以輔證ELISA 結(jié)果。7 mol/L 尿素萃取液以4∶1 的比例加入臨床樣本中，混勻震蕩，用于蛋白萃取。離心后取上清1 μL，用bradford 法測(cè)定其蛋白含量。定量后將50 μg 蛋白于10%的SDS-PAGE 凝膠電泳，分離蛋白，之后轉(zhuǎn)至孔徑為0.45 nm 的PVDF 膜上，并用脫脂牛奶封閉2 h（常溫）。一抗分別是鼠抗人Hsp90α（Abcam 公司，英國(guó)）1∶1000 稀釋和鼠抗人Actin（Sigma 公司，美國(guó)）1∶1000 稀釋，37℃孵育4 h，之后用TBST 洗3 次，每次10 min，之后加入兔抗鼠二抗（Sigma 公司，美國(guó)），室溫孵育1 h，經(jīng)Odesssy曝光儀自動(dòng)生成Western blot 中各條帶的相對(duì)灰度值，并利用其自帶軟件將灰度值轉(zhuǎn)化為柱狀圖，并自動(dòng)計(jì)算每組樣本的平均值及標(biāo)準(zhǔn)差。

六、病理學(xué)檢查

術(shù)中切除的腫瘤標(biāo)本均在2 h 內(nèi)固定于4%多聚甲醛過(guò)夜，石蠟包埋后切片，進(jìn)行HE 染色，肉眼光學(xué)顯微鏡下判讀，再由免疫組織化學(xué)定性診斷。入組的顱咽管瘤必須是ACP，并為WHO Ⅰ級(jí)；膠質(zhì)瘤必須是GBM，并為WHO Ⅳ級(jí)；脈絡(luò)叢腫瘤必須是CPP，且為WHO Ⅰ級(jí)。復(fù)發(fā)ACP 患者增加對(duì)腫瘤外層邊界的病理切片、HE 染色，觀察其對(duì)周?chē)X組織的浸潤(rùn)程度。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用SPSS19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組數(shù)據(jù)進(jìn)行Kolmogorov-Smirnov（K-S）正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，4 組間比較采用方差分析，兩兩比較采用多重比較，原發(fā)和復(fù)發(fā)ACP 患者Hsp90α 含量的對(duì)比采用t 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、ELISA 法檢測(cè)4 組患者血漿和腦脊液中Hsp90α 的含量

所有入組患者體內(nèi)均能產(chǎn)生一定量的Hsp90α，其能通過(guò)血-腦屏障、血-腦脊液屏障等生理屏障等進(jìn)入外周血液循環(huán)中而被檢測(cè)出來(lái)。顱內(nèi)腫瘤患者無(wú)論是血漿還是腦脊液中的Hsp90α 水平均遠(yuǎn)高于顱骨缺損對(duì)照組患者，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1）。血漿中Hsp90α 含量高低：GBM 組＞ACP組＞CPP 組=顱骨缺損對(duì)照組；腦脊液中Hsp90α 含量高低：GBM 組＞ACP 組＞CPP 組=顱骨缺損對(duì)照組（圖1A～B）。復(fù)發(fā)ACP 患者血漿中Hsp90α 含量水平顯著高于原發(fā)ACP 患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而腦脊液中的Hsp90α 含量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖1C～D）。

表1 4 組患者血漿和腦脊液中Hsp90α 蛋白的含量（ng/mL，Mean±SD）

二、Western blot 法血漿驗(yàn)證結(jié)果

觀察各組患者的Western blot 在90 000 上的灰度值直觀上即有一定區(qū)別（圖2A）。經(jīng)Odesssy 曝光儀利用其自帶軟件將灰度值轉(zhuǎn)化為柱狀圖，在排除樣本數(shù)干擾的前提下，入組顱內(nèi)腫瘤（ACP、GBM 及CPP）患者血漿中的Hsp90α 水平均高于作為顱骨缺損對(duì)照組（圖2B）。

三、病理結(jié)果

術(shù)后病理診斷證實(shí)ACP、GBM 和CPP 的腫瘤分型及WHO 分級(jí)。ACP 病理結(jié)果顯示典型腫瘤外膜附近的組織結(jié)構(gòu)，除可見(jiàn)ACP 浸潤(rùn)?quán)徑M織時(shí)引起的膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)增生帶（Rosenthal 纖維）外，還可見(jiàn)腫瘤向外“侵襲”的跡象，即可見(jiàn)ACP 最外層擁有多尖邊緣和不規(guī)則突起形狀，呈“舌樣”或“島樣”，正在突破腫瘤基膜，侵犯周?chē)＝M織（圖3）。

討論

顱咽管瘤屬于先天性的上皮成分起源腫瘤，一直被認(rèn)為是“純”良性腫瘤。在WHO 中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類中，顱咽管瘤的兩個(gè)病理亞型（ACP 和SPCP）均被定為WHO Ⅰ級(jí)[3-5]。GBM 是顱內(nèi)最常見(jiàn)的原發(fā)惡性腫瘤，為WHO Ⅳ級(jí)，其約占顱內(nèi)腫瘤的12%～15%[5]。典型的CPP 為起源于腦室內(nèi)脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞的良性腫瘤，為WHO Ⅰ級(jí)，約占兒童顱內(nèi)腫瘤的2%～4%[6]。因此CPP 和GBM 可代表最典型的良/惡性腫瘤。本研究中將ACP 與最典型的良/惡性腫瘤進(jìn)行研究對(duì)照，能對(duì)其生物學(xué)性質(zhì)，特別是侵襲性有深入了解。

圖1 4 組患者血漿和腦脊液Hsp90α 含量ELISA 檢測(cè)

圖2 4 組患者血漿中Hsp90α 蛋白Western blot 檢測(cè)結(jié)果

圖3 復(fù)發(fā)的造釉細(xì)胞型顱咽管瘤病理資料（HE 染色，×100）

腫瘤侵襲也稱腫瘤浸潤(rùn)，是指腫瘤細(xì)胞突破外層基底膜并向四周正常組織浸潤(rùn)性生長(zhǎng)、侵犯的過(guò)程。臨床上ACP 常表現(xiàn)出對(duì)下丘腦、視神經(jīng)、垂體柄等重要結(jié)構(gòu)侵襲性生長(zhǎng)的生物學(xué)行為，預(yù)后明顯較差。但侵襲性顱咽管瘤這一稱呼至今在國(guó)際上并沒(méi)得到正式承認(rèn)，只是部分ACP 在電子顯微鏡下能證實(shí)其腫瘤細(xì)胞能呈“島樣”、“手指狀”、“舌頭樣”等聚集，突破腫瘤基膜，侵入周?chē)ＤX組織中，且腫瘤外周具有纖維膠質(zhì)組織（即Rosenthal 纖維）環(huán)繞，因此部分病理學(xué)家才稱之為侵襲性顱咽管瘤[7]。目前顱咽管瘤是否具有侵襲性只有術(shù)后病理診斷才能確認(rèn)，對(duì)臨床手術(shù)無(wú)指導(dǎo)意義。因此，探索一種兼顧“預(yù)判”及“隨訪”功能，并指導(dǎo)手術(shù)的檢驗(yàn)指標(biāo)就成了本研究的目的。此檢驗(yàn)指標(biāo)應(yīng)具有以下特點(diǎn)：（1）標(biāo)本取材盡量對(duì)患者創(chuàng)傷小、痛苦少；（2）取材操作簡(jiǎn)便易行，可普及；（3）檢驗(yàn)硬件要求一般，過(guò)程耗時(shí)少、價(jià)格低；（4）檢驗(yàn)結(jié)果通俗易懂、可量化。

Hsp90α 是機(jī)體細(xì)胞中普遍存在的一種蛋白質(zhì)，其主要作用是維持細(xì)胞新陳代謝，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖[8]。在病理或應(yīng)激條件下正常細(xì)胞可向外分泌超量的Hsp90α，通過(guò)毛細(xì)血管網(wǎng)或毛細(xì)淋巴管進(jìn)入血漿循環(huán)，使之能在血漿中被檢測(cè)出來(lái)[9]。研究表明，Hsp90α 可在應(yīng)激狀態(tài)下表達(dá)于正常的神經(jīng)細(xì)胞、皮膚鱗狀上皮細(xì)胞或血漿中的免疫細(xì)胞的細(xì)胞膜表面[10,11]。腫瘤的產(chǎn)生、發(fā)展對(duì)于正常機(jī)體來(lái)說(shuō)也是一種應(yīng)激狀態(tài)。有研究表明，在腫瘤細(xì)胞中，突變或異常蛋白可刺激Hsp90α 的高表達(dá)，達(dá)正常水平的2～10 倍以上，同時(shí)Hsp90α 還能正反饋的加速腫瘤細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)歸[12]。國(guó)內(nèi)有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，Hsp90α 在不同分化程度胃癌中的表達(dá)程度不同，在中、高度分化胃癌中的表達(dá)較低分化胃癌中的表達(dá)明顯（P＜0.05）；而印戒細(xì)胞癌中的表達(dá)明顯低于中高分化癌和低分化癌（P＜0.05）[13]。Pick 等[14]的研究表明，乳腺癌中Hsp90α 高表達(dá)跟患者術(shù)后生存時(shí)間有明顯關(guān)系。Wang 等[15]研究直接指出Hsp90α 的表達(dá)高低預(yù)示著胃癌的侵襲程度，指導(dǎo)著患者預(yù)后。

目前，尚無(wú)學(xué)者直接從血漿及腦脊液中提取Hsp90α，通過(guò)測(cè)量其表達(dá)，研究顱內(nèi)原發(fā)腫瘤的良惡性或侵襲度。本研究在運(yùn)用ELISA 法檢測(cè)Hsp90α 時(shí)，均參照清華大學(xué)腫瘤分子實(shí)驗(yàn)室的研究經(jīng)驗(yàn)，即正常人群血漿中Hsp90α 含量應(yīng)＜50。這說(shuō)明本研究取顱骨修補(bǔ)患者作為正常對(duì)照組應(yīng)符合入組條件，而且使正常人群入組，無(wú)論是在抽血還是腰椎穿刺獲取腦脊液都有技術(shù)或倫理學(xué)上的困難。

本研究中所有入組腫瘤患者（ACP、GBM）血漿及腦脊液中Hsp90α 含量均遠(yuǎn)高于顱骨缺損對(duì)照組。此結(jié)果也印證了顱內(nèi)腫瘤，無(wú)論良性、惡性腫瘤，均對(duì)患者是一種“應(yīng)激”狀態(tài)，可使其體內(nèi)高表達(dá)Hsp90α。在顱內(nèi)腫瘤患者中，無(wú)論血漿還是腦脊液中的Hsp90α 含量，GBM 組＞ACP 組＞CPP 組=顱骨缺損對(duì)照組，這一結(jié)果或許可以說(shuō)明ACP 侵犯/浸潤(rùn)周?chē)＝M織的能力介于良性和惡性腫瘤之間，具有相當(dāng)?shù)那忠u性。筆者使用了Western blot 法對(duì)以上推測(cè)進(jìn)行了驗(yàn)證，并通過(guò)Odesssy 自動(dòng)曝光儀的自帶軟件生成柱狀圖，表明在不考慮病例數(shù)的情況下，ACP 血漿中Hsp90α 含量介于GBM 與CPP 之間，且遠(yuǎn)大于顱骨缺損對(duì)照組。但ACP 與CPP 同為WHO 分類中的Ⅰ級(jí)腫瘤，其差異可能由于Hsp90α的分泌水平與腫瘤的侵襲性正相關(guān)，與病理分級(jí)無(wú)明顯關(guān)系。Hsp90α 在血漿、腦脊液中的含量越高，越能說(shuō)明腫瘤對(duì)周?chē)X組織的浸潤(rùn)、侵襲程度越重。此結(jié)果印證了在實(shí)際手術(shù)操作中，ACP 因與周?chē)ＤX組織黏連緊密而較同為WHOⅠ級(jí)的CPP 更難切除，且術(shù)后復(fù)發(fā)率高。

上述結(jié)果并沒(méi)有將原發(fā)ACP 與復(fù)發(fā)ACP 進(jìn)行分組對(duì)比，很難解釋到底是原發(fā)腫瘤侵襲還是因腫瘤復(fù)發(fā)，或是手術(shù)損傷影響了Hsp90α 水平的高低。因此，在對(duì)原發(fā)、復(fù)發(fā)ACP 患者的血漿及腦脊液的ELISA 檢測(cè)后，筆者發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)ACP 中血漿Hsp90α水平明顯高于原發(fā)患者。但是腦脊液結(jié)果差異不明顯，可能原因有：（1）復(fù)發(fā)ACP 患者均做過(guò)手術(shù)，顱內(nèi)血腦屏障等生理屏障無(wú)論從生理學(xué)還是解剖學(xué)上都不完整，腫瘤細(xì)胞與外周血液循環(huán)之間存在部分直捷通路可能；（2）復(fù)發(fā)ACP 常原位復(fù)發(fā)，多因原腫瘤與周?chē)M織結(jié)構(gòu)黏連不清，病理證實(shí)侵襲性生長(zhǎng)的ACP 細(xì)胞本身會(huì)向周?chē)X組織浸潤(rùn)，突破基膜、破壞周?chē)?xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞。這樣ACP 細(xì)胞便能直接向血液循環(huán)中分泌Hsp90α，使血漿內(nèi)濃度相對(duì)高于腦脊液內(nèi)濃度。

值得注意的是，在單獨(dú)對(duì)比檢測(cè)中，CPP 患者與顱骨修補(bǔ)患者血漿及腦脊液中Hsp90α 含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。筆者考慮為典型的CPP 生長(zhǎng)方式多為脈絡(luò)上皮細(xì)胞在腦室內(nèi)異常增殖，幾乎無(wú)核異型性，對(duì)周?chē)X組織及血管、神經(jīng)基本無(wú)侵襲，手術(shù)難度主要體現(xiàn)對(duì)供血?jiǎng)用}及引流靜脈的阻斷及處理上，而且脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞的最主要生理作用為分泌腦脊液，因此CPP 細(xì)胞直接向腦脊液中分泌大量的Hsp90α 是造成患者腦脊液中Hsp90α 含量相對(duì)高于血漿的原因，但還有待進(jìn)一步大樣本實(shí)驗(yàn)的支持。本研究因?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)原因未完成腦脊液的Western blot 檢測(cè)，需要后續(xù)研究完善。

綜上所述，探討顱咽管瘤的侵襲性是挑戰(zhàn)人們對(duì)此腫瘤的認(rèn)知，而且本研究未從傳統(tǒng)病理研究入手，而是創(chuàng)新性地直接從術(shù)前血漿及腦脊液檢測(cè)入手，面臨更大的挑戰(zhàn)。在標(biāo)本取樣時(shí)，腰椎穿刺、靜脈抽血、麻醉插管等操作對(duì)患者是一種“應(yīng)激狀態(tài)”，因此，機(jī)體細(xì)胞分泌的Hsp90α 對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響有待進(jìn)一步研究。對(duì)于ACP 患者術(shù)后Hsp90α 在血漿及腦脊液中的表達(dá)，或許能作為隨訪指標(biāo)之一。