馬文葉，金 銳，康卉嫻，代 良，唐大偉，白 剛，劉 芳，任萌萌，包俊華

不孕不育癥患者中有10%～30%為抗精子抗體(AsAb)等免疫因素導(dǎo)致的不孕[1-2]。女性體內(nèi)的AsAb是機(jī)體對(duì)精子抗原產(chǎn)生的同種異體免疫反應(yīng)的產(chǎn)物，普遍存在于不育癥患者的卵泡液、血清及精液中，可阻礙精子與透明帶以及卵膜接觸，降低受精率。在體外受精/卵胞漿內(nèi)單精子注射(IVF/ICSI-ET)的治療過程中，有10%～20%的周期會(huì)發(fā)生受精完全失敗[3]，及早發(fā)現(xiàn)患者的受精能力是實(shí)施早期補(bǔ)救ICSI的關(guān)鍵。通過檢測(cè)卵泡液中AsAb的陽性率，及早預(yù)警患者受精失敗的可能性，以幫助胚胎培養(yǎng)室人員適時(shí)實(shí)施RICSI。

1 資料與方法

1.1 一般資料：回顧性分析我院2017年9月-2018年5月因輸卵管因素助孕的患者194例，符合納入標(biāo)準(zhǔn)患者141例。按不孕原因分為：原發(fā)不孕組70例，繼發(fā)不孕組71例。按受精方式分為：A組，即常規(guī)IVF組，共89例；B組，即前次受精失敗改行ICSI組，共32例；C組，即IVF短時(shí)受精完全失敗行RICSI組，共20例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≤35歲；②首次接受IVF -ET助孕治療；③因IVF受精失敗首次改為ICSI再次助孕治療者；④獲卵數(shù)目在10～15個(gè)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①取卵當(dāng)日因精液?jiǎn)栴}臨時(shí)改為ICSI；②采用供精實(shí)施IVF-ET的患者。

1.2 促排卵方案及受精觀察：均采用高孕激素狀態(tài)下促排卵方案(PPOS)或卵泡期長(zhǎng)方案，當(dāng)目標(biāo)卵泡有2個(gè)≥20 mm時(shí)，且≥16 mm占≥14 mm的卵泡數(shù)目比大于60%時(shí)，注射人絨毛膜促性腺激素(hCG)5 000～10 000后36～38 h，在B超引導(dǎo)下經(jīng)陰道取卵。hCG注射后39～40 h按精子/卵母細(xì)胞的比例加入經(jīng)處理優(yōu)化后的精子，受精4～6 h后拆去卵母細(xì)胞周圍的顆粒細(xì)胞，于倒置顯微鏡下觀察極體及卵母細(xì)胞胞漿情況。明確第二極體出現(xiàn)率小于50%，對(duì)所有明確單極體成熟的MII卵子實(shí)施RICSI。

1.3 研究方法：取卵當(dāng)日留取無血污染的卵泡液，離心取上清液2 mL于-20 ℃冰箱中保存待測(cè)。AsAb抗體檢測(cè)試劑盒由濰坊市康華生物技術(shù)有限公司提供，采用ELISA法。實(shí)驗(yàn)操作、結(jié)果陰性和陽性判斷均嚴(yán)格按照試劑說明書。

2 結(jié)果

2.1 原發(fā)與繼發(fā)不孕患者一般資料比較:原發(fā)與繼發(fā)不孕患者不孕年限、Gn總量、Gn天數(shù)、獲卵數(shù)、成熟率、受精率、正常受精率和卵裂率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表1。

表1 原發(fā)不孕與繼發(fā)不孕患者臨床一般資料的比較

2.2 3組患者一般情況比較：A組、B組、C組的年齡、不孕年限、Gn總量、Gn天數(shù)、獲卵數(shù)和卵裂率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表2。

表2 3組患者一般情況的比較

2.3 原發(fā)與繼發(fā)不孕組早期補(bǔ)救率、卵泡液AsAb陽性率比較:原發(fā)不孕組早期補(bǔ)救率為21.43%，繼發(fā)不孕組為7.04%；原發(fā)不孕組AsAb陽性率為28.57%，繼發(fā)不孕組為9.86%，2組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，原發(fā)不孕組患者的早期補(bǔ)救率和卵泡液AsAb陽性率顯著高于繼發(fā)不孕組，見表3。

表3 2組不孕患者卵泡液AsAb陽性率的比較[n(%)]

2.4 3組患者正常受精率、AsAb陽性率比較：A組、B組、C組的正常受精率(52.53%，69.23%與68.57%，P<0.05)和AsAb陽性率(15.73%，34.38%與10.00%，P<0.05)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中B組和C組的正常受精率顯著高于A組，且B組的AsAb陽性率最高，見表4。

表4 3組患者正常受精率、AsAb陽性率的比較[n(%)]

3 討論

IVF-ET技術(shù)在近30年來的廣泛應(yīng)用幫助眾多不孕夫婦完成做父母的夢(mèng)想，但是仍有30%左右的患者在實(shí)施常規(guī)體外受精時(shí)出現(xiàn)受精失敗，導(dǎo)致患者沒有可利用的胚胎，無法移植，給本人和家庭造成經(jīng)濟(jì)和心理的雙重打擊。而早期補(bǔ)救ICSI 技術(shù)[4-5]的出現(xiàn)很好地彌補(bǔ)了部分常規(guī)體外受精發(fā)生受精失敗的不良結(jié)局，減少了因無可移植胚胎對(duì)患者造成的不利影響。

但是，目前胚胎實(shí)驗(yàn)室主要以分析觀察受精后排出第二極體卵母細(xì)胞的比例來決定是否對(duì)患者實(shí)施補(bǔ)救ICSI,條件較為單一。由于卵母細(xì)胞成熟發(fā)育不同步，在受精6 h后仍有8%左右的卵子推遲了第二極體的排出時(shí)間；另外當(dāng)?shù)谝粯O體出現(xiàn)碎片或分裂時(shí)很難與第二極體進(jìn)行區(qū)分[6],往往造成對(duì)卵母細(xì)胞受精情況的誤判，失去或者延誤了實(shí)施早期補(bǔ)救ICSI的最佳時(shí)機(jī)，仍然會(huì)造成一部分患者沒有可利用胚胎的不良結(jié)局。所以，探尋更多的評(píng)估患者受精能力的指標(biāo)就成為目前胚胎培養(yǎng)工作人員研究的難點(diǎn)。

常規(guī)體外受精失敗的原因可能有：精卵成熟不良，精子與卵子透明帶結(jié)合障礙，配子融合障礙等[7-9]。AsAb廣泛存在于人體的血液和體液中，卵泡液中也可以檢測(cè)到AsAb。AsAb主要通過以下機(jī)制影響精子與卵子結(jié)合：①抑制精子頂體酶的活性，從而抑制頂體反應(yīng)的發(fā)生；②抑制精子對(duì)透明帶的附著與穿透，使精子不能穿過透明帶。本研究結(jié)果顯示，原發(fā)不孕組的早期補(bǔ)救率和AsAb陽性率與繼發(fā)不孕組比較有顯著性差異，2組的AsAb陽性率均符合資料報(bào)道的10%～30%不孕患者中可檢測(cè)出AsAb。AsAb陽性率在原發(fā)不孕癥患者中具有較高比例，說明AsAb可能是原發(fā)不孕患者導(dǎo)致受精失敗的原因之一。

本研究通過對(duì)不同受精方式的A組、B組和C組患者卵泡液中AsAb的檢測(cè)，評(píng)估AsAb對(duì)受精能力的影響，結(jié)果顯示A組、B組、C組的正常受精率和AsAb陽性率有顯著性差異。其中B組和C組的正常受精率顯著高于A組，且B組的AsAb陽性率最高，原因是這組患者前一周期受精失敗行RICSI，這一周期直接做ICSI。結(jié)果表明，卵泡液中的AsAb陽性率對(duì)原發(fā)不孕患者早期補(bǔ)救ICSI的操作具有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值。

我院于IVF加精后4～6 h拆除卵周顆粒細(xì)胞，觀察第二極體排出情況及卵胞漿形態(tài)學(xué)的改變，未觀察到明確第二極體或明確第二極體比率低于50%，對(duì)所有明確單極體且胞漿無形態(tài)學(xué)改變的卵子及時(shí)行RICSI。而對(duì)存在碎片樣極體的卵子是否應(yīng)及時(shí)行RICSI決定較慎重，根據(jù)極體的碎片分布及間隔1～2 h后再次觀察碎片的大小、形態(tài)、位置是否改變，并結(jié)合胞漿的皮質(zhì)反應(yīng)情況及原核出現(xiàn)情況，綜合判斷卵母細(xì)胞是否受精。因此有必要進(jìn)一步通過定性檢測(cè)體外受精患者取卵后卵泡液中AsAb陽性情況，聯(lián)合對(duì)胚胎形態(tài)學(xué)的觀察，幫助胚胎培養(yǎng)室人員盡早發(fā)現(xiàn)受精失敗患者，對(duì)受精異常者有更及時(shí)、更準(zhǔn)確的評(píng)估。本研究的患者樣本量較少，仍需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究，為選擇一個(gè)相對(duì)更安全、更有效的受精方式，降低受精失敗、取消周期的風(fēng)險(xiǎn)，提高治療的成功率提供更多的臨床研究數(shù)據(jù)。