楊玲玲，馬會明，趙 帥，楊張杰，虎 娜，徐 仙

MEX3C(MEX-3 RNA binding family member C)是RNA結(jié)合蛋白家族的成員，在C-端有一個E3泛素連接酶活性的鋅指結(jié)構(gòu)域[1-2]。E3泛素連接酶在細胞周期變化、細胞增殖和細胞凋亡過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[3]，MEX3C基因敲除則沉默或抑制這些酶的活性，可抑制細胞增殖，并促進細胞凋亡，導致發(fā)育異常。已有研究證明，MEX3C在生物學過程中介導轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，可導致遺傳易感性高血壓[4]，是癌細胞中染色體不穩(wěn)定性(CIN)抑制劑[5]，可增加能量消耗，減少脂肪沉積[6-7]。已報道染色體不穩(wěn)定的細胞顯示細胞分裂后期染色體錯誤分離[8]，MEX3C基因敲除降低了細胞質(zhì)DNA的自主反應，進而增加了染色體錯誤分離的比例，形成染色體非整倍體,可能導致不育不孕、自發(fā)流產(chǎn)和先天出生缺陷等異常[9]。MEX3C在許多組織中廣泛表達，在細胞的發(fā)育、分化、凋亡等生理病理過程中發(fā)揮作用，因此，本研究利用MEX3C 基因敲除小鼠作為研究對象，從整體水平探討MEX3C基因缺失對小鼠產(chǎn)仔數(shù)、卵泡發(fā)育的影響，進而明確是否影響小鼠的繁殖，有望為臨床卵巢功能的改善提供藥物靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料：6周齡的FVB小鼠購自賽業(yè)(蘇州)實驗動物有限公司，雌雄各3只，體質(zhì)量(16.02±0.35)g，基因型為雜合體(MEX3C+/-),實驗動物許可證為NTCMK170902CHK01。按雌∶雄=1∶1配對繁殖，室內(nèi)溫度控制在20～25 ℃,濕度控制在 50%～60%,光照周期12 h，通風良好，自由進食飲水，每周換墊料2次，小鼠飼養(yǎng)于寧夏醫(yī)科大學SFP級動物中心研究所。主要試劑與儀器：DNA提取試劑盒、2×Taq PCR Master、D2000、6×DNA Loading Buffer 均購自TIANGEN;瓊脂糖粉、引物購自生工生物工程(上海)股份有限公司；HE試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；倒置熒光顯微鏡購自德國 LEICA 公司。

1.2 方法

1.2.1 MEX3C小鼠基因型鑒定：采用PCR法。剪取6～8周齡小鼠尾巴，提取DNA，體系如下?？傮w積(25 μl)：Premix Taq 12.5 μl，上游及下游引物各1 μl，模板 DNA 2 μl，ddH2O 8.5 μl。PCR循環(huán)參數(shù)：94 ℃預變性3 min； 94 ℃變性30 s，52 ℃退火35 s，72 ℃延伸35 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min，最后4 ℃保存?zhèn)溆?。引物見?。

表1 MEX3C基因敲除小鼠引物序列

1.2.2 繁殖性能的測定：將鑒定出的雌性小鼠分為MEX3C+/-組和MEX3C+/+組，于6周時分別與MEX3C+/-雄鼠采用1∶1合籠，每組6對，觀察各組小鼠每一代的平均窩產(chǎn)仔數(shù)及子代數(shù)。

1.2.3 蘇木精-伊紅(HE)染色觀察卵巢組織形態(tài)：6周齡小鼠卵巢組織依照實驗室[10-11]常規(guī)方法，行酒精梯度脫水透明，石蠟包埋，切片厚度5 μm，蘇木精-伊紅染色，顯微鏡下觀察卵巢組織形態(tài)，并拍照。

2 結(jié)果

2.1 MEX3C小鼠基因鑒定：1.5%的瓊脂糖凝膠電泳顯示MEX3C+/+PCR擴增條帶為499 bp，MEX3C+/-擴增條帶為640 bp、499 bp，MEX3C-/-擴增條帶為640 bp，見圖1(目錄后)。

2.2 MEX3C小鼠繁殖情況：MEX3C+/-雄鼠與MEX3C+/-雌鼠交配平均每代窩產(chǎn)仔數(shù)均小于MEX3C+/-雄鼠與MEX3C+/+雌鼠交配的窩產(chǎn)仔數(shù)，且相同時間段內(nèi)子代數(shù)也減少,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

2.3 HE染色觀察卵巢組織形態(tài)和卵泡計數(shù)(X20)：野生型組可見各級卵泡，雜合子組可見多個閉鎖卵泡，見圖2(目錄后)。

雜合子組原始卵泡計數(shù)和初級卵泡計數(shù)均小于野生型組，閉鎖卵泡計數(shù)大于雜合子組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3 。

表2 每一代平均的窩產(chǎn)仔數(shù)

表3 2組小鼠卵泡計數(shù)

3 討論

MEX3C(MEX-3 RNA binding family member C)是一種有兩個KH結(jié)構(gòu)域的RNA結(jié)合蛋白，其有4種同源物：MEX3A、MEX3B、MEX3C和MEX3D，它們分別定位于人類1號、15號、18號、19號染色體上[1-2]。研究[12]發(fā)現(xiàn)MEX3C 突變小鼠生長發(fā)育遲緩，且在C57BL/6小鼠背景下，85%的MEX3C突變小鼠在出生后不久死于呼吸不良。前期本課題組通過 X-gal 染色顯示β-半乳糖苷酶活性，檢測發(fā)現(xiàn) MEX3C 在發(fā)育卵泡的顆粒細胞和卵母細胞中呈高度表達狀態(tài),但在卵泡膜細胞中沒有表達或低表達。并且該基因參與早期胚胎發(fā)育和維持成人生殖系的全能性[13]，表明MEX3C 在發(fā)育的卵泡中發(fā)揮重要作用。本研究中我們應用MEX3C 基因敲除小鼠，通過觀察不同基因型合籠窩產(chǎn)仔數(shù)和卵巢形態(tài)，探討MEX3C基因缺失可否影響小鼠的繁殖。結(jié)果顯示MEX3C+/-雄鼠與MEX3C+/-雌鼠交配每代窩產(chǎn)仔數(shù)均小于MEX3C+/-雄鼠與MEX3C+/+雌鼠交配的窩產(chǎn)仔數(shù)，提示MEX3C缺失可影響卵巢的貯備功能及卵泡的發(fā)育成熟。

卵巢的貯備功能是指卵巢產(chǎn)生卵子的數(shù)量和質(zhì)量潛能，它與卵巢中原始卵泡池密切相關(guān)[14-15]。原始卵泡的啟動、激活及閉鎖是一個多因素調(diào)節(jié)過程，它的數(shù)量和維持時間直接決定可生育時間的長短。本研究結(jié)果顯示，與MEX3C+/+組相比，MEX3C+/-組卵巢中原始卵泡數(shù)和初級卵泡數(shù)明顯減少，閉鎖卵泡數(shù)增加，次級卵泡的卵母細胞形態(tài)異常，且相同時間段內(nèi)MEX3C+/-雄鼠與MEX3C+/-雌鼠交配子代數(shù)小于MEX3C+/-雄鼠與MEX3C+/+雌鼠交配子代數(shù)，提示在原始卵泡向成熟卵泡發(fā)育過程中，MEX3C可能對卵巢貯備、卵泡發(fā)育、卵母細胞的分化和成熟以及顆粒細胞功能產(chǎn)生重要的調(diào)控作用。

綜上所述，MEX3C基因缺失可影響卵泡發(fā)育，減弱卵巢貯備功能，進而影響小鼠繁殖，其可能機制是MEX3C可激活原始卵泡，促進卵泡發(fā)育，減少卵泡閉鎖。卵泡由原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡向成熟卵泡的發(fā)育過程中，不僅受促卵泡激素和雌激素的調(diào)節(jié)，且與各種細胞因子密切相關(guān)，如胰島素生長因子(IGF-1)等。由于卵泡發(fā)育過程復雜且受多因素調(diào)節(jié)，所以該基因影響卵泡發(fā)育的具體機制目前尚不清楚。