鄒佳賀,劉效伊,席健峰，徐 義,王 勇*

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154003；2.深圳市龍崗區(qū)婦幼保健院，廣東 深圳 518172；3.云臺(tái)山風(fēng)景名勝區(qū)云臺(tái)街道衛(wèi)生院，江蘇 連云港 222000)

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae,KP)屬于革蘭氏陰性桿菌，近年來(lái)已成為引起社區(qū)獲得性感染和醫(yī)院感染最重要的病原菌之一，可導(dǎo)致呼吸道、泌尿道、傷口等部位的感染及敗血癥、肝膿腫等疾病。碳青霉烯類抗菌藥物是活性最強(qiáng)、抗菌譜最廣的非典型β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物，常被認(rèn)為是治療革蘭陰性桿菌引起感染的最后一道防線[1]。近年來(lái)，由于碳青霉烯類抗菌藥物的大量使用，導(dǎo)致了耐碳青霉烯類腸桿菌的出現(xiàn)(CRE)。收集2018年6月到2019年6月我院分離出的CRKP菌株42株,檢測(cè)其毒力基因并對(duì)其藥敏結(jié)果進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 菌種來(lái)源

收集2018年6月至2019年6月佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院從患者標(biāo)本中分離出的CRE菌株，去除同一患者不同部位相同的菌株共41株。

1.2 儀器與試劑

Vitek-2 Compact全自動(dòng)微生物分析儀(法國(guó)梅里埃公司)。血平板、麥康凱平板(OXOID公司)。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株

肺炎克雷伯菌ATCC700603購(gòu)自國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委臨床檢驗(yàn)中心。

1.4 拉絲試驗(yàn)

CRE菌株接種在含5%羊血瓊脂平板上，培養(yǎng)18～20h，然后用接種針輕輕挑起菌落，如果挑起菌落過(guò)程中出現(xiàn)絲狀物并且≥5mm，則為拉絲試驗(yàn)陽(yáng)性；反之，絲狀物長(zhǎng)度<5cm則為陰性[2]。

1.5 PCR檢測(cè)毒力基因

用磁珠法提取細(xì)菌的模板DNA，根據(jù)文獻(xiàn)[3-5]委托上海生工生物技術(shù)公司合成毒力基因magA、uge、kfu、allS、iroNB、mrkD、kpn、fimH，陽(yáng)性產(chǎn)物送上海生工生物有限公司測(cè)序，結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上運(yùn)用BLAST比對(duì)確定其基因型(表1)。

表1 毒力相關(guān)基因引物序列

表1(續(xù))

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)使用SPSS 22.0 ，F(xiàn)isher精確檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用X2檢驗(yàn),以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CRKP的臨床科室分布

42株CRKP中有32(76.2%)株是ESBL陽(yáng)性菌，10(23.8%)株是ESBL陰性的菌。ESBL陽(yáng)性菌主要見于重癥醫(yī)學(xué)科和神經(jīng)外科，ESBL陰性菌主要見于重癥醫(yī)學(xué)科，見表2。

表2 ESBL陽(yáng)性菌和ESBL陰性菌科室分布

2.2 CRKP拉絲試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院42株CRKP進(jìn)行拉絲實(shí)驗(yàn)，結(jié)果皆為陰性。

2.3 CRKP毒力基因攜帶情況

(M：表示mark 1、泳道是uge 2、泳道是fimH 3、泳道是mrkD 4泳道是kpn)

使用PCR方法檢測(cè)我院42株CRKP，結(jié)果42株CRKP經(jīng)PCR檢測(cè)fimH攜帶率為88.1%(37/42)，mrkD攜帶率為92.9%(39/42)，kpn攜帶率為92.9%(39/42)；所有菌株均攜帶uge基因；magA,kfu,iroNB，alls均未檢出，見圖1。

2.4 CRKP藥敏結(jié)果

42株CRKP對(duì)臨常用的抑菌藥物如阿莫西林/克拉維酸、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢呋新、頭孢呋辛酯、頭孢西丁、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢吡肟、厄他培南、亞胺培南、左旋氧氟沙星、復(fù)方新諾明等耐藥性顯著。對(duì)阿米卡星敏感性達(dá)100%。以下是 ESBL陽(yáng)性CRKP菌株和ESBL陰性菌株耐藥情況，見表3。

表3 ESBL陽(yáng)性CRKP菌株和ESBL陰性菌株耐藥結(jié)果

表3(續(xù))

3 討論

耐碳青霉烯類肺炎克雷伯桿菌(carbapenem-resistantenterobacteriaceae，CRKP)是一種對(duì)頭孢菌素類、青霉素類甚至是碳青霉烯類抗生素廣泛耐藥的多重耐藥菌，目前CRKP僅對(duì)替加環(huán)素、多粘菌素敏感。研究表明SARS死亡率為11%，而CRKP感染患者死亡率可達(dá)40%～50%[6]，感染CRKP的血液病患者死亡率甚至高達(dá)60%以上[7]，被稱為超級(jí)耐藥菌。由于替加環(huán)素在國(guó)內(nèi)還未上市，多粘菌素有很強(qiáng)的毒副作用，應(yīng)用范圍狹窄，CRKP已處于無(wú)藥可治狀態(tài)。中國(guó)細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)(CHINT)發(fā)布報(bào)告指出KP對(duì)亞胺培南的耐藥率由2005年的3%，到2010年的9.2%，再到2016年16.1%，可以看出CRKP成明顯增長(zhǎng)趨勢(shì)，且不同地區(qū)細(xì)菌耐藥情況存在差異[8]。由于本地區(qū)醫(yī)院尚未使用阿米卡星這種抗菌藥物，所以對(duì)阿米卡星敏感性達(dá)到100%。腸桿菌科細(xì)菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥的主要耐藥機(jī)制之一是產(chǎn)生超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended-spectrum beta-lactamases，ESBLs)。ESBLs能水解青霉素類、頭孢菌素(包含第三代、第四代頭孢菌素)及單環(huán)酰胺類，如氨曲南，并且可以被β-內(nèi)酰胺酶抑制劑抑制的由質(zhì)粒介導(dǎo)的一類β-內(nèi)酰胺酶。ESBLs主要見于大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌，也見于腸桿菌屬、變形桿菌屬、枸櫞酸桿菌屬、沙雷菌屬等其他腸桿菌科細(xì)菌。近年隨著抗菌藥物大量使用，特別是第三代頭孢菌素的廣泛使用往往是促使產(chǎn)ESBLs菌株出現(xiàn)及廣泛播散的主要原因，各種腸桿菌科細(xì)菌甚至都出現(xiàn)了對(duì)碳青霉烯耐藥的菌株，表現(xiàn)出多重耐藥。多重耐藥形成的機(jī)制比較復(fù)雜，主要與產(chǎn)生ESBLs、AmpC酶、碳青霉烯酶等各種重要的滅活酶以及細(xì)菌外排系統(tǒng)過(guò)度表達(dá)、膜通透性改變等機(jī)制有關(guān)。它們常因攜帶多種不同的耐藥基因而具有多重耐藥性，這種耐藥性可以通過(guò)質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子等可移動(dòng)元件在細(xì)菌的種內(nèi)或是種間傳播，造成感染爆發(fā)流行，控制產(chǎn)酶菌株的流行防止耐藥菌譜近一步擴(kuò)大，已經(jīng)成為減緩耐藥菌眾多措施中的重中之重。

CRKP存在高致死率，但它們的毒力因子特征還尚不清楚。Ⅰ型和Ⅲ型菌毛被認(rèn)為與KP的粘附有關(guān)，是另一類較為重要的毒力基因。Ⅰ型菌毛是細(xì)菌表面上的線狀突起，由fimA-H基因編碼。Ⅲ型菌毛是螺旋狀的細(xì)絲，在KP中由mrkABCD基因簇編碼。有研究顯示，KP利用環(huán)境因素來(lái)調(diào)節(jié)Ⅰ型菌毛的表達(dá)，Ⅰ型菌毛在泌尿道中表達(dá)，但不在胃腸道或肺中表達(dá)，有助于編碼Ⅰ型菌毛的hvKP在泌尿道的粘附，引起尿道炎和膀胱[9]。Hornick稱Ⅲ型菌毛可以通過(guò)mrkD基因介導(dǎo)體外物質(zhì)與氣管、口腔細(xì)胞和肺組織結(jié)合[10]，這與呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎分離的標(biāo)本中均能檢出mrkD基因有關(guān)。有研究稱無(wú)論是hvKP還是cKP都存在Ⅰ型和Ⅲ型菌毛，但也有mrkD基因只在hvKP中檢出，并與K2血清型密切相關(guān)的報(bào)道[11]。究竟編碼Ⅰ型和Ⅲ型菌毛的基因是否在特定的KP中檢出，需要進(jìn)一步的研究。根據(jù)毒力基因攜帶情況可知我院的CRKP毒力基因目前只發(fā)現(xiàn)了四種。

4 結(jié)論

綜上所述，應(yīng)該更加注重對(duì)CRKP的耐藥性和毒力基因的檢測(cè)，從而促使臨床醫(yī)生更好的認(rèn)識(shí)和了解CRKP。