孫 楊 龔 丹 高福祥

沈陽華生生物科技開發(fā)有限公司 遼寧 沈陽 110000

蛹蟲草[Cordyceps militaris(L.)Link],又名北冬蟲夏草、北蟲草,在分類學(xué)上屬于子囊菌門(Ascomycota)、糞殼菌綱(Sordariomycetes)、肉座菌目(Hypocreales)、蟲草科(Cordycipitaceae)、蟲草屬(Cordyceps)[1]。冬蟲夏草作為中國傳統(tǒng)滋補(bǔ)上品一直備受推崇,經(jīng)現(xiàn)代科學(xué)研究表明,蛹蟲草含有與冬蟲夏草同類的營養(yǎng)物質(zhì),如蟲草素、蟲草酸、蟲草多糖、SOD和腺苷等等,甚至有些有效物質(zhì)的含量較冬蟲夏草更高[2-5]。

目前在遼寧地區(qū)已實現(xiàn)大規(guī)模的蛹蟲草人工栽培,并取得了較為廣泛的群眾基礎(chǔ)。但在大規(guī)模栽培的過程中,仍存在優(yōu)質(zhì)菌種少、菌種遺傳不穩(wěn)定、遺傳變異明顯以及退化風(fēng)險大等問題,導(dǎo)致菌種生產(chǎn)不能滿足市場需求?；谏鲜鲈?筆者對自采菌種進(jìn)行篩選,選擇性狀較優(yōu)的菌株A170815作為實驗對象,在現(xiàn)有實踐經(jīng)驗的基礎(chǔ)上分別對其液體培養(yǎng)和子實體栽培培養(yǎng)進(jìn)行優(yōu)化,篩選最適條件用于生產(chǎn)實踐,以期解決菌種市場的現(xiàn)有問題。

1 儀器與材料

SW—CJ—2DF型雙人單面凈化工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司);立式壓力蒸汽滅菌器(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);SHZ—A 旋轉(zhuǎn)氣浴恒溫振蕩器(杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司);移液器(DRAGONLAB)。

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)：葡萄糖2.0g、瓊脂2.0g,馬鈴薯浸汁定容至100 mL。(馬鈴薯浸汁：去皮馬鈴薯20.0g,加蒸餾水100 mL煮沸30 min,八層紗布過濾得浸汁。)

固體篩選培養(yǎng)基：碳源2%,氮源2%,VB1 0.005%,磷酸二氫鉀0.01%,硫酸鎂0.01%,瓊脂2%。

液體篩選培養(yǎng)基：碳源2%,氮源2%,VB1 0.005%,磷酸二氫鉀0.01%,硫酸鎂0.01%。

栽培基礎(chǔ)培養(yǎng)基：小麥40g,水72 mL。

菌種：自主采集并分離成功的菌株A170815。

2 方法

2.1 最適碳源和氮源及用量的篩選

2.1.1 固體平板初篩 將滅菌后的篩選培養(yǎng)基倒入無菌平皿中,靜置凝固后接入同一菌齡且同樣大小的菌塊,18-20℃,靜置暗培養(yǎng),比較同樣培養(yǎng)時間下的菌落平均直徑。

2.1.2 液體搖瓶復(fù)篩 取同一菌齡且同樣大小的菌塊接種于滅菌后的液體篩選培養(yǎng)基中,18-20℃,搖床暗培養(yǎng)4-6天,比較菌絲量的多少。并將培養(yǎng)后的菌液接種于栽培基礎(chǔ)培養(yǎng)基上,進(jìn)行出草驗證,比較子實體生長狀態(tài)和生物轉(zhuǎn)化率。

2.1.3 用量篩選 配制含有不同濃度碳源(或氮源)的篩選培養(yǎng)基,滅菌后倒入無菌平皿中,靜置凝固后接入同一菌齡且同樣大小的菌塊,18-20℃,靜置暗培養(yǎng),比較同樣培養(yǎng)時間下的菌落平均直徑。

2.2 最適栽培料的篩選

2.2.1 液體菌種培養(yǎng) 在優(yōu)選的液體培養(yǎng)基條件下接入菌種,18-20℃,搖床暗培養(yǎng)4-6天,得菌種培養(yǎng)液。

2.2.2 栽培料篩選實驗 分別用等量的小麥+水、燕麥+水、糙米+水、大米+水以及小麥+液體培養(yǎng)基組成栽培培養(yǎng)基,滅菌后接入同樣數(shù)量菌種培養(yǎng)液,進(jìn)行出草驗證,比較子實體生長狀態(tài)和生物轉(zhuǎn)化率。

2.2.3 子代菌種驗證 在2.2.2步驟中的子實體生長至40-45天時,通過組織分離法[6-7]獲得子代菌種,將同一菌齡且同樣大小的子代菌塊重復(fù)2.2.1培養(yǎng),獲得的培養(yǎng)液均接入栽培基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,進(jìn)行出草驗證,比較子實體生長狀態(tài)和生物轉(zhuǎn)化率。

3 結(jié)果

3.1 最適碳源和氮源及用量的篩選

3.1.1 碳源篩選：分別選用可溶性淀粉、蔗糖、白砂糖(食用級)、麥芽糖和葡萄糖作為碳源,蛋白胨為氮源,無碳源組為對照組,配制不同篩選培養(yǎng)基。接入同一菌齡且同樣大小的菌種塊,培養(yǎng)后比較菌落平均直徑,結(jié)果如圖1所示,由實驗結(jié)果可知蔗糖組菌落平均直徑最大。

圖1 不同碳源的固體篩選培養(yǎng)基上菌落平均直徑

不同的液體篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得的菌液中,蔗糖組、白砂糖組、葡萄糖組的菌絲量均較多,其次為可溶性淀粉組,麥芽糖組和無碳源組菌絲量明顯較少。將培養(yǎng)后的菌液接種于栽培基礎(chǔ)培養(yǎng)基上,進(jìn)行出草驗證,對子實體生長狀態(tài)進(jìn)行評價并測定生物轉(zhuǎn)化率,結(jié)果如圖2所示,由實驗結(jié)果可知蔗糖組表觀形態(tài)平均分最高且平均生物轉(zhuǎn)化率也最高。

圖2 不同碳源培養(yǎng)液子實體平均生物轉(zhuǎn)化率和表觀形態(tài)評價

通過固體平板初篩和液體搖瓶復(fù)篩并經(jīng)栽培出草驗證,蔗糖組表現(xiàn)明顯優(yōu)于其他組,所以確定蔗糖為最適碳源,后續(xù)實驗均采用蔗糖作為碳源。

分別以0、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%以及3%的蔗糖為碳源,蛋白胨為氮源,配制固體篩選培養(yǎng)基,接入同一菌齡且同樣大小的菌塊培養(yǎng)后測量菌落平均直徑,結(jié)果如圖3所示,蔗糖含量為2%時菌落最大,故確定蔗糖的最適濃度為2%。

圖3 不同蔗糖含量的固體篩選培養(yǎng)基上菌落平均直徑

3.1.2 氮源篩選：分別選用大豆蛋白胨、魚蛋白胨、牛肉蛋白胨、酵母蛋白胨和實驗室原用的蛋白胨作為氮源,蔗糖為碳源,無氮源組為對照組,配制不同篩選培養(yǎng)基。接入同一菌齡且同樣大小的菌塊,培養(yǎng)后比較菌落平均直徑,結(jié)果如圖4所示,由實驗結(jié)果可知無氮源組菌落直徑最大,但該菌落菌絲極薄且不轉(zhuǎn)色,故選擇酵母蛋白胨作為氮源繼續(xù)實驗。

圖4 不同氮源的固體篩選培養(yǎng)基上菌落平均直徑

不同氮源的液體篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得的菌液中,除無氮源組菌絲量較少外,其余各組的菌絲量均較多,單從菌絲數(shù)量上不易判斷孰優(yōu)孰劣。將培養(yǎng)后的菌液接種于栽培基礎(chǔ)培養(yǎng)基上,進(jìn)行出草驗證,對子實體生長狀態(tài)進(jìn)行評價并測定生物轉(zhuǎn)化率,結(jié)果如圖5所示,由實驗結(jié)果可知酵母蛋白胨組表觀形態(tài)較好且平均生物轉(zhuǎn)化率也最高。

通過固體平板初篩和液體搖瓶復(fù)篩并經(jīng)栽培出草驗證,酵母蛋白胨組表現(xiàn)優(yōu)于其他組,所以確定酵母蛋白胨為最適氮源,后續(xù)實驗均采用酵母蛋白胨作為氮源。

分別以0、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%的酵母蛋白胨為氮源,蔗糖為碳源,配制固體篩選培養(yǎng)基,接入同一菌齡且同樣大小的菌塊培養(yǎng)后測量菌落平均直徑,結(jié)果如圖6所示,酵母蛋白胨含量為0時菌落最大,但該菌落菌絲極薄且不轉(zhuǎn)色,故確定酵母蛋白胨的最適濃度為0.5%。

圖5 不同氮源培養(yǎng)液子實體平均生物轉(zhuǎn)化率和表觀形態(tài)評價

圖6 不同酵母蛋白胨含量的固體篩選培養(yǎng)基上菌落平均直徑

3.2 最適栽培料的篩選

3.2.1 栽培料篩選實驗 以蔗糖(2%)為碳源、酵母蛋白胨(0.5%)為氮源,其余組分同液體篩選培養(yǎng)基,配制液體培養(yǎng)基,接種培養(yǎng)獲得菌液。取同樣數(shù)量菌液接種于不同的栽培培養(yǎng)基中,經(jīng)出草驗證,除大米組外,其余組子實體形態(tài)均較優(yōu),且小麥培養(yǎng)的子實體均較為粗壯,但生物轉(zhuǎn)化率組間差別較大,燕麥組最高可達(dá)163%,該組實驗子實體表觀形態(tài)平均分和生物轉(zhuǎn)化率如圖7所示。

圖7 栽培實驗子實體生物轉(zhuǎn)化率和表觀形態(tài)平均分

3.2.2 子代菌種驗證

2.2.2 步驟中子實體的子代菌種在轉(zhuǎn)色階段略有差異,大米組轉(zhuǎn)色差,其余組均正常。將子代菌種培養(yǎng)液接入栽培基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,通過出草驗證可知,糙米和燕麥培養(yǎng)的子代表觀形態(tài)較優(yōu),且燕麥培養(yǎng)獲得的子代菌種生物轉(zhuǎn)化率仍最高,實驗結(jié)果如圖8所示。結(jié)合當(dāng)代子實體綜合數(shù)據(jù)和子代子實體綜合數(shù)據(jù)認(rèn)為燕麥+水組成的栽培培養(yǎng)基最適宜。

圖8 栽培實驗子代菌種子實體生物轉(zhuǎn)化率和表觀形態(tài)平均分

4 小結(jié)與討論

4.1 在液體培養(yǎng)時采用蔗糖(2%)作為碳源、酵母蛋白胨(0.5%)作為氮源,獲得培養(yǎng)液后栽培至燕麥和水組成的栽培培養(yǎng)基上,可以獲得綜合評價最高的子實體,且該菌株能夠?qū)?yōu)勢保持至下一代,既保證了當(dāng)代子實體的經(jīng)濟(jì)價值又大大降低了菌種遺傳風(fēng)險。

4.2 在碳源或氮源篩選中,固體平板篩選結(jié)果清晰明了但不能保證出草結(jié)果,而液體培養(yǎng)結(jié)果不易觀察但可結(jié)合栽培實驗明確出草結(jié)果,僅使用單一方法不能保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性,故采用固體平板初篩和液體搖瓶復(fù)篩結(jié)合的方法,增強(qiáng)實驗結(jié)果的可靠性。

4.3 在不同氮源含量篩選過程中,無氮源固體培養(yǎng)基上生長的菌落大、菌絲極薄且不轉(zhuǎn)色,與原始菌落和其他組差異極大。對該菌落進(jìn)行了相關(guān)實驗,其能夠正常生長、出草和傳代,但與其他組別相比較,菌絲不夠強(qiáng)壯,后代變異風(fēng)險較大。