陳 斌，樊海平，薛凌展，管 碧，暢孟陽，鐘全福，葉小軍，張偉妮

( 1.福建省淡水水產(chǎn)研究所，福建 福州 350002； 2.福建農(nóng)林大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350000 )

異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)“中科3號”因其生長速度快、個體大、抗病力強(qiáng)受到廣大養(yǎng)殖者喜愛[1-2]，成為我國鯽魚(C.auratus)養(yǎng)殖的主要品種之一。水霉病是對淡水養(yǎng)殖魚類危害較大的常見真菌性疾病之一，特別是在魚類人工繁育過程中，鯉魚(Cyprinuscarpio)、鯽魚和黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)等黏性卵感染水霉的比例較高，孵化過程中的死卵及卵膜受損的受精卵最易受到水霉感染，這些卵感染后其內(nèi)部滋生大量菌絲，蔓延，覆蓋，傳染侵入周圍正常卵，導(dǎo)致胚胎死亡[3-7]。由于鯽魚的繁殖季節(jié)為春季，繁殖水溫為18～23 ℃，該水溫范圍正是霉菌極易暴發(fā)的環(huán)境條件，因此在異育銀鯽“中科3號”苗種繁育過程中，如何有效減少霉菌感染比例及限制霉菌繁殖速度是提高孵化率的關(guān)鍵[8]。

生產(chǎn)上主要通過化學(xué)藥物來抑制魚卵和仔魚的霉菌生長，常見的藥物有高錳酸鉀、過氧化氫、福爾馬林、鉻化合物(重鉻酸鈉、重鉻酸鉀、三氧化鉻)、硫醚沙星(復(fù)合丙烯基二、三硫醚乳液)、氯化鈉、溴硝丙二醇、碘伏(霉菌凈)、五倍子(水霉凈)等。由于這些藥物缺乏高效性，同時存在較高的使用安全風(fēng)險[9-13]，所以目前科研人員仍在不斷探索開發(fā)新的抑殺霉菌藥物，如篩選中草藥抗水霉制劑[14-18]，研究異噻唑啉酮、磺基水楊酸、尼泊金乙酯、二硫氰基甲烷、丙酸鈣、雙乙酸鈉、山梨酸鉀等防霉劑對水霉的抑制效果[19-20]，開展新型殺菌劑立達(dá)霉[21]、復(fù)方甲霜靈粉(美婷)[22-23]等對魚卵水霉病防治效果的研究與應(yīng)用。雖然霉菌抑制劑的研發(fā)受到廣泛的關(guān)注，但適合用于防治魚卵水霉病的有效、安全藥物仍較為匱乏。結(jié)合本單位中試基地近幾年抗水霉藥物的應(yīng)用效果及文獻(xiàn)資料中植物抑霉藥物和食品抑霉劑的普遍好評率，本試驗選擇美婷Ⅱ、霉靈、高錳酸鉀、殺毒礬和納他霉素5種藥物。其中美婷Ⅱ中的活性成分可以直接作用于菌體細(xì)胞膜表面的巰基醇，在細(xì)胞壁產(chǎn)生特大突起，使細(xì)胞壁破裂，菌體死亡，孢子失活；霉靈的主要成分可以滲透霉菌細(xì)胞壁，損傷細(xì)胞膜并改變其通透性，引起細(xì)胞亞微結(jié)構(gòu)變性和細(xì)胞壞死，同時可以抑制霉菌芽孢轉(zhuǎn)變?yōu)榍忠u性的菌絲；高錳酸鉀通過氧化菌體酶蛋白中的巰基使酶失活，導(dǎo)致菌體發(fā)生機(jī)能障礙而死亡，殺毒礬可以抑制霉菌RNA聚合酶的合成從而抑制RNA的生物合成，最終達(dá)到抑制霉菌的目的；納他霉素可以與真菌的麥角甾醇及其他甾醇基團(tuán)結(jié)合，阻礙麥角甾醇的生物合成，從而使細(xì)胞膜畸變，導(dǎo)致滲漏，引起霉菌細(xì)胞的死亡。筆者研究了5種藥物對異育銀鯽“中科3號”魚卵水霉病的抑制效果和受精卵孵化的影響，以期尋找控制魚卵水霉的有效安全藥物，為異育銀鯽“中科3號”的苗種繁育提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗用受精卵

以3齡雌性異育銀鯽“中科3號”作為母本，3齡雄性福瑞鯉作為父本進(jìn)行人工催產(chǎn)，催產(chǎn)水溫控制在18～20 ℃，約16 h后開始人工擠卵、取精。采取干法人工授精，并將受精卵均勻鋪在網(wǎng)片上用于試驗。

1.2 試驗藥物來源

美婷Ⅱ由上海海洋大學(xué)研制，主要成分溴硝醇(皮樂寶)、硫酸亞鐵，在有效性和安全性方面比美婷更具優(yōu)勢；霉靈由上海海洋大學(xué)研制，山西爭躍化工藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，主要成分磺基水楊酸等；高錳酸鉀(99%)，由衡陽市凱信化工試劑有限公司生產(chǎn)；殺毒礬(噁霜·錳鋅)由先正達(dá)(蘇州)作物保護(hù)有限公司生產(chǎn)，主要成分噁霜靈(8%)、代森錳鋅(56%)；納他霉素(99%)，由浙江多味化工食品有限公司生產(chǎn)。

1.3 試驗方法

試驗容器為5 L塑料桶，每桶裝孵化用水3 L，放于孵化車間。將試驗藥物分別配置1000 mg/L母液，按照設(shè)計質(zhì)量濃度分別添加到各試驗桶中，混勻后剪取5 cm×10 cm的已鋪卵的網(wǎng)片放于桶中進(jìn)行靜水孵化。每個質(zhì)量濃度組和對照組均設(shè)置3個平行，日換水量為50%，并及時補(bǔ)充50%的試驗藥物，維持藥物質(zhì)量濃度。每24 h肉眼結(jié)合鏡檢觀察受精卵1次，并將網(wǎng)片置于帶水的玻璃平皿中，用手電從下方照射，計數(shù)發(fā)霉卵數(shù)量和未發(fā)霉卵數(shù)量。試驗期間水溫21～23 ℃，當(dāng)魚苗進(jìn)入尾牙期時停止換水補(bǔ)藥，孵化時間約76 h，待完全出膜后計數(shù)仔魚數(shù)量。

參照各藥物常用質(zhì)量濃度，按等對數(shù)間距設(shè)置質(zhì)量濃度梯度，試驗藥物質(zhì)量濃度見表1。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 17.0軟件對樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，數(shù)據(jù)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，P<0.05為差異顯著。

長霉率/%=n1/(n1+n2)×100%

孵化率/%=n3/(n1+n2)×100%

式中，n1為長霉卵數(shù)量，n2為未長霉卵數(shù)量，n3為孵出水花數(shù)量。

表1 試驗藥物質(zhì)量濃度設(shè)置 mg/LTab.1 The concentrations of test drugs on mass basis

2 結(jié) 果

2.1 美婷Ⅱ?qū)κ芫验L霉率和孵化率的影響

試驗結(jié)果顯示，美婷Ⅱ可顯著降低異育銀鯽“中科3號”受精卵的長霉率，隨著藥浴質(zhì)量濃度的升高，長霉率顯著下降(P<0.05)；同一藥浴質(zhì)量濃度隨浸泡時間的延長，受精卵的長霉率顯著上升(P<0.05)(表2)。孵化效果試驗顯示，6.50 mg/L質(zhì)量濃度組孵化率略高于4.90 mg/L組(P>0.05)，顯著高于3.69 mg/L組、8.620 mg/L組和11.44 mg/L組及對照組(P<0.05)。

2.2 霉靈對受精卵長霉率和孵化率的影響

霉靈5個質(zhì)量濃度組中，24 h內(nèi)均可抑制霉菌生長，隨著時間延長，各質(zhì)量濃度組受精卵長霉率顯著增加(P<0.05)；在48 h和72 h時，受精卵長霉率隨著霉靈質(zhì)量濃度的增加逐漸下降趨勢明顯，15 mg/L組的長霉率最低，僅為(1.05±0.1)%和(4.7±0.9)%，現(xiàn)在低于其他組(表3)。48 h時，7.62 mg/L組受精卵長霉率略低于3.87 mg/L組，但差異不顯著(P>0.05)，其余各試驗組間差異顯著(P<0.05)；1.00 mg/L組進(jìn)入72 h時霉菌感染率明顯上升，長霉率達(dá)到(40.3±0.6)%與對照組差異不顯著(P>0.05)，1.97、3.87、7.62 mg/L 3個試驗組受精卵長霉率分別增加了3.8%、7.7%、7.5%，3組間差異不顯著(P>0.05)。

綜合分析，當(dāng)霉靈質(zhì)量濃度為1.97 mg/L時，受精卵孵化率最高，長霉率控制在(23.9±2.8)%，當(dāng)霉靈質(zhì)量濃度升至15.00 mg/L時，霉菌生長受到限制，長霉率僅為(4.7±0.9)%，但該質(zhì)量濃度顯著影響受精卵孵化，其孵化率僅為(31.1±1.4)%，顯著低于其他組。

2.3 高錳酸鉀對受精卵長霉率和孵化率的影響

5個質(zhì)量濃度的高錳酸鉀在24 h內(nèi)能均能抑制水霉生長，隨浸泡時間的延長，高錳酸鉀抑菌效果逐漸下降，同一質(zhì)量濃度組72 h受精卵長霉率顯著高于48 h(P<0.05)；而24 h以后，隨著試驗質(zhì)量濃度的增加，受精卵長霉率逐漸下降，48 h時6.25 mg/L組的長霉率最低，僅為(6.0±0.9)%，顯著低于其他組(P<0.05)；72 h時各組的長霉率均有所增加，但仍低于對照組(P<0.05)，其中6.25 mg/L組的長霉率相對于48 h上升顯著(P<0.05)，達(dá)(29.0±1.4)%。孵化效果試驗顯示，各試驗組的孵化率均高于對照組，其中2.50 mg/L組的孵化率最高，達(dá)到(54.0±4.0)%，顯著高于其他組(P<0.05)(表4)。

表2 美婷Ⅱ?qū)κ芫验L霉率和孵化率試驗結(jié)果Tab.2 The incidence of mildew and hatching rate of fertilized eggs exposed to Mei Ting Ⅱ

注：同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)；同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同大寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同大寫字母表示差異不顯著(P>0.05)；下同.

Note: means with different letters in the same column are significant difference (P<0.05), means with the same letters are not significant difference (P>0.05); means with different capital letters in the same line are significant difference (P<0.05), with the same capital letter are not significant difference (P>0.05)； et sequentia.

表3 霉靈對受精卵長霉率和孵化率試驗結(jié)果Tab.3 The incidence of mildew rate and hatching rate of fertilized eggs exposed to Mei Ling

表4 高錳酸鉀對受精卵長霉率和孵化率試驗結(jié)果Tab.4 The incidence of mildew rate and hatching rate of fertilized eggs exposed to potassium permanganate

2.4 納他霉素對受精卵長霉率和孵化率影響

當(dāng)納他霉素的質(zhì)量濃度為1.5～5.00 mg/L時，24 h內(nèi)霉菌抑制效果顯著，霉菌感率為0。1.00 mg/L組也能有效抑制水霉生長，長霉率顯著低于對照組(P<0.05)；48 h和72 h，高于1.50 mg/L的各質(zhì)量濃度組能有效抑制水霉生長，長霉率顯著低于1.00 mg/L組和對照組(P<0.05)，但72 h受精卵長霉率與48 h差異不顯著(P>0.05)，而1.00 mg/L組和對照組72 h受精卵長霉率顯著高于48 h(P<0.05)，且1.00 mg/L組48 h和72 h的受精卵長霉率與對照組無顯著差異(P>0.05)(表5)。

孵化率以1.50 mg/L組最高，顯著高于其他試驗質(zhì)量濃度組和對照組(P<0.05)，其次為2.24 mg/L組，顯著高于1.00、3.34、5.00 mg/L組和對照組(P<0.05)，而1.00、3.34、5.00 mg/L組和對照組之間差異不顯著(P>0.05)。

2.5 殺毒礬對受精卵長霉率和孵化率影響

孵化24 h時，0.33 mg/L組和0.50 mg/L組的水霉抑制效果顯著，受精卵均未感染霉菌。48 h時，各組的霉菌感染率均出現(xiàn)了顯著增加，0.33 mg/L組和0.50 mg/L組受精卵長霉率雖顯著低于其他質(zhì)量濃度組和對照組(P<0.05)，但是其長霉率也分別達(dá)到了(15.5±1.7)%和(14.6±0.8)%，差異不顯著(P>0.05)；72 h后，各組受精卵的霉菌感染率進(jìn)一步提高，其中0.10 mg/L組的長霉率高達(dá)(50.0±0.7)%，顯著高于其他各組(P<0.05)，0.50 mg/L的長霉率最低，僅為(23.4±1.0)%，顯著低于其他組(P<0.05)。孵化效果試驗顯示，各試驗質(zhì)量濃度組的受精卵孵化率均顯著低于對照組(P<0.05)，其中以0.15 mg/L組孵化率較高，孵化率為(36.1±2.2)%，略低于對照組(P<0.05)，0.50 mg/L組孵化率最低，僅為(9.8±1.0)%，顯著低于對照組(P<0.05)(表6)。

表5 納他霉素對受精卵長霉率和孵化率試驗結(jié)果Tab.5 The incidence of mildew and hatching rate of fertilized eggs exposed toy Natamycin

表6 殺毒礬對受精卵長霉率和孵化率試驗結(jié)果Tab.6 The incidence of mildew and hatching rate of fertilized eggs exposed to oxadixyl mancozeb

3 討 論

3.1 不同藥物對受精卵水霉控制作用

水霉病是魚卵孵化過程中的一種常見病，常給苗種生產(chǎn)造成較大損失。多年來國內(nèi)外不斷進(jìn)行抗水霉有效藥物的篩選和開發(fā)，主要以消毒劑、防霉防腐劑和中草藥制劑為主。雖然這些藥物對水霉均有一定的抑制作用[19-27]，但有些藥物的有效抑制質(zhì)量濃度遠(yuǎn)超過安全質(zhì)量濃度，不適合應(yīng)用于生產(chǎn)；有些藥物如美婷、過氧化氫等療效較好，但因使用成本較高而無法推廣應(yīng)用[13-28]。本試驗選擇了常用消毒劑高錳酸鉀，農(nóng)用殺菌劑殺毒礬，食品防腐劑納他霉素，漁藥美婷Ⅱ和霉靈等5種藥物用于異育銀鯽“中科3號”受精卵孵化期間水霉的抑制試驗及其對孵化率的影響研究。其中殺毒礬是農(nóng)藥類新型混合殺菌劑，對一些植物真菌性病害有較高的防治效果[29]。納他霉素是一種多烯類抗真菌的生物防腐劑，能夠抑制絲狀真菌的生長，廣泛用于食品防腐和醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用[30-31]。高猛酸鉀作為最強(qiáng)的氧化劑之一，常被應(yīng)用于醫(yī)療、化工、動物養(yǎng)殖、苗木培育等各個領(lǐng)域，可以防治水生動物的水霉病和腐皮病[32-33]，還對葡萄的霉斑病有一定的治療效果[34]。

試驗結(jié)果顯示，5種藥物對異育銀鯽“中科3號”受精卵的水霉均一定的抑制作用，其抑霉率為美婷Ⅱ>霉靈>高錳酸鉀、納他霉素和殺毒礬。美婷Ⅱ和霉靈均為上海海洋大學(xué)研制，美婷Ⅱ主要成份溴硝醇(皮樂寶)，為新型化妝品防腐劑。有學(xué)者探討了溴硝醇對虹鱒(Oncorhynchusmykiss)、比目魚(Hippolossushippolpssus)、大西洋鱈(Gadusmoehua)、黑線鱈(Melanogrammusaeglefinus)等魚卵水霉的抑制效果，均證實采用短時間浸浴的方法能夠有效抑制水霉滋生，提高受精卵的孵化率[35-38]，其抑制霉菌的效果在本試驗中進(jìn)一步證實，其優(yōu)點是抑制霉菌效果好，孵化率高，其缺點是使用質(zhì)量濃度高，成本高。霉靈主要成分為磺基水楊酸，具有防霉殺菌作用，磺基水楊酸對水霉具有較好的體外抗菌效果[19]，其抑制霉菌的效果也同樣在本試驗中得以體現(xiàn)，但是相對于美婷Ⅱ，霉靈的抑菌效果更差一些，其優(yōu)點是使用質(zhì)量濃度低且藥物價格低，能夠節(jié)約生產(chǎn)成本。

3.2 藥物質(zhì)量濃度及作用時間對受精卵長霉率影響

藥物的使用質(zhì)量濃度和作用時間對魚卵水霉的防治效果存在明顯的差異。隨著藥物浸泡質(zhì)量濃度的增加，受精卵長霉率逐漸降低；隨著浸浴時間的延長，受精卵長霉率逐漸升高。霉靈、高錳酸鉀、納他霉素和殺毒礬低質(zhì)量濃度組對魚卵寄生水霉沒有抑制效果，而殺毒礬低質(zhì)量濃度組72 h的受精卵長霉率反而顯著高于對照組，可能與殺毒礬對異育銀鯽“中科3號”受精卵毒性較大，造成魚卵死亡數(shù)量較多，而受傷或死亡的魚卵更易滋生霉菌[3]，導(dǎo)致受精卵長霉率進(jìn)一步升高；而納他霉素2.24 mg/L以上質(zhì)量濃度組72 h的受精卵長霉率則略低于48 h，說明該藥物在水中結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、藥效長。亦有研究結(jié)果表明，納他霉素是一種高效、專一的抗真菌抑制劑，具有較好的穩(wěn)定性，可專一性地與霉菌細(xì)胞膜中的麥角固醇結(jié)合，提高對霉菌的持續(xù)抑制作用[39-40]，與該試驗結(jié)果完全相符。因此納他霉素在水霉抑制方面具有一定開發(fā)應(yīng)用前景。

3.3 藥物對受精卵孵化率的影響

水霉寄生是嚴(yán)重影響淡水魚受精卵孵化的一個主要因素，尤其是在水溫較低的早春季節(jié)，為提高淡水魚受精卵孵化率，生產(chǎn)上通常采用一些藥物來防治受精卵的水霉病，并以受精卵孵化率或出苗率來評估藥物的實際防治效果。除了殺毒礬外，一定質(zhì)量濃度的美婷Ⅱ、霉靈、高錳酸鉀、納他霉素均能顯著提高異育銀鯽“中科3號”受精卵孵化率，說明美婷Ⅱ、霉靈、高錳酸鉀、納他霉素對異育銀鯽“中科3號”受精卵的毒副作用較小，而殺毒礬各試驗質(zhì)量濃度組受精卵的孵化率均低于對照組，說明殺毒礬對異育銀鯽“中科3號”受精卵的毒副作用較大，不適合應(yīng)用于受精卵孵化。

同一藥物不同質(zhì)量濃度對受精卵孵化率差異極大，5種試驗藥物的受精卵孵化率均為中質(zhì)量濃度組>低質(zhì)量濃度組>高質(zhì)量濃度組，說明試驗藥物高于適宜質(zhì)量濃度均對受精卵產(chǎn)生毒性作用，影響孵化率；同樣，低質(zhì)量濃度藥物未能有效控制魚卵水霉繁殖，導(dǎo)致受精卵孵化率下降。因此，各種防霉藥物在應(yīng)用到孵化生產(chǎn)之前，一定要根據(jù)試驗結(jié)果得出最適使用量，才能同時發(fā)揮藥物安全和高效的特性。

試驗結(jié)果顯示，美婷Ⅱ?qū)Ξ愑y鯽“中科3號”受精卵適宜使用質(zhì)量濃度為4.90～6.50 mg/L，適合長時間浸浴，對水霉的抑制效果良好且孵化率較高，這與夏文偉等[23-24]的研究結(jié)果基本一致，而孫鵬等[35]建議使用高質(zhì)量濃度溴硝醇浸泡15 min短時間使用；霉靈對異育銀鯽“中科3號”受精卵的適宜使用質(zhì)量濃度為1.97～3.87 mg/L，與該漁藥的建議使用劑量說明基本一致；高錳酸鉀對異育銀鯽“中科3號”24 h內(nèi)浸泡效果顯著，受精卵的適宜使用質(zhì)量濃度為2.50 mg/L，遠(yuǎn)低于張繁榮等[32]用15.0 mg/L的高錳酸鉀溶液每隔3 d浸洗1次，每次浸洗時間10 min的使用方法；納他霉素對異育銀鯽“中科3號”受精卵的適宜使用質(zhì)量濃度為1.50 mg/L，孵化率與美婷Ⅱ和霉靈無顯著差異(P>0.05)，具有高效、無毒和低殘留特性[39]，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景；而殺毒鞏對水霉的抑制效果不甚理想，較強(qiáng)的毒副作用嚴(yán)重影響了“中科三號”受精卵的孵化率，不適合應(yīng)用于魚卵的孵化生產(chǎn)。