張玉清 陶立玉 張子軒

蛛網(wǎng)膜下腔出血（subarachniod hemorrhage，SAH）是腦底部或腦表面的病變血管破裂，血液直接流入蛛網(wǎng)膜下腔的一種疾病，可分為自發(fā)性與繼發(fā)性，其中自發(fā)性SAH在臨床上更為常見[1]。顱內(nèi)動(dòng)脈瘤是一種常見的腦血管疾病，是誘導(dǎo)動(dòng)脈瘤破裂致自發(fā)性SAH的最主要原因[2]。目前治療顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂出血患者的主要方法是行開顱手術(shù)夾閉動(dòng)脈瘤或介入栓塞治療，但術(shù)后極易引發(fā)腦血管痙攣（cerebral vasospasm，CVS）[3]。研究表明，CVS是因局部腦血管收縮時(shí)受累腦組織區(qū)域血供減少，從而引起缺血缺氧性神經(jīng)功能損害，是患者致殘、致死的主要原因之一[4]。及早預(yù)測及診治CVS，對(duì)于降低顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂出血患者死亡率具有積極的意義。缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）是機(jī)體缺氧適應(yīng)過程中起核心調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子，與創(chuàng)傷性顱腦損傷中血管的修復(fù)與再生過程密切相關(guān)[5]。miR-210是微小RNA（microRNA，miRNA）家族成員之一，其表達(dá)水平與缺氧缺血性腦損傷新生鼠腦血管再生有關(guān)[6]。但關(guān)于HIF-1α、miR-210在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂出血患者術(shù)后血清中的表達(dá)情況，目前鮮有報(bào)道，基于此，本研究通過檢測顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂出血術(shù)后血清中HIF-1α、miR-210的表達(dá)情況，旨在探討其與CVS的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

資料與方法

一、一般資料

選取禹城市人民醫(yī)院神經(jīng)外科自2015年1月至2018年12月收治的87例顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂急診自發(fā)性SAH并接受手術(shù)治療的患者為研究對(duì)象，其中男性49例，女性38例；年齡范圍35～75歲，年齡（46.17±15.28）歲；按Hunt氏法分級(jí)，術(shù)前Ⅰ～Ⅱ級(jí)48例，Ⅲ～Ⅳ級(jí)39例[7]。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）均以蛛網(wǎng)膜下輕出血為首發(fā)癥狀；（2）經(jīng)頭顱X線、CT及全腦數(shù)字減影血管造影（digital subtraction angiography，DSA）檢查確診；（3）均接受手術(shù)治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）SAH造影為陰性；（2）術(shù)前或術(shù)中發(fā)生再次出血；（3）術(shù)后因高血壓、腦梗死或腦室外引流術(shù)中穿刺等引起的再出血；（4）嚴(yán)重精神病、妊娠期、哺乳期、過敏體質(zhì)及嚴(yán)重肝腎等臟器功能不全。

二、診斷標(biāo)準(zhǔn)與評(píng)定方法

CVS診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]：（1）患者經(jīng)治療后出現(xiàn)惡化或進(jìn)行性加重；（2）意識(shí)性障礙呈波動(dòng)性或進(jìn)行性加重；（3）出現(xiàn)感覺障礙、失語、偏癱等體征；（4）顱內(nèi)壓升高；（5）血流容量大腦前、中動(dòng)脈≥120 cm/s，后動(dòng)脈≥90 cm/s。

CVS評(píng)定方法：術(shù)后4 d行DSA檢查，測量腦中動(dòng)脈（M1、M2段）、前動(dòng)脈（A1、A2段）及血管最狹窄處直徑，根據(jù)健康人腦血管直徑作為基準(zhǔn)，評(píng)估CVS嚴(yán)重程度。無CVS：患者腦血管直徑與正常腦血管直徑相比，減少度＜10%；輕度CVS：10%≤減少度＜35%；中度CVS：35%≤減少度＜70%；重度CVS：70%≤減少度＜100%。

三、標(biāo)本采集與檢測

標(biāo)本采集：分別于術(shù)前1 d和術(shù)后3、7 d采集患者肘靜脈血5 mL，室溫靜置0.5 h后，在離心機(jī)（2500 r/min，離心半徑13.5 cm）上離心20 min，取上清液，并置于-70℃冰箱中保存待測。

血清HIF-1α水平：采用HIF-1αELISA檢測試劑盒檢測血清HIF-1α水平，檢測過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，HIF-1α檢測試劑盒購自上海研生實(shí)業(yè)有限公司。

血清miR-210水平：采用RNA提取試劑盒提取RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒得cDNA，采用miScript SYBR Green PCR Kit檢測血清miR-210水平，反應(yīng)體系20μL，具體步驟參見各試劑盒說明書，qRTPCR反應(yīng)條件：95℃，120 s；95℃，30 s；60℃，60 s，共35個(gè)循環(huán)。RNA提取試劑盒購自上海賽默飛世爾科技有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒及miScript SYBR Green PCR Kit購自上海索萊寶生物科技有限公司。miR-210的上游引物序列：TCAGCCGCTGTCACACGCAC AG；下游引物序列：TTCTCCGAACGTGTCACGTT TC；內(nèi)參U6的上游引物序列：ATTGGAACGATACA GAGAAGATT；下游引物序列：GGAACGCTTCACG AATTTG。采用2-△△Ct法對(duì)miR-210水平進(jìn)行定量分析。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料先進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，方差分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義者再進(jìn)一步采用LSD-t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Pearson相關(guān)性分析法分析顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂出血術(shù)后血清HIF-1α、miR-210表達(dá)的相關(guān)性，采用ROC曲線分析顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂出血術(shù)后3 d患者血清HIF-1α、miR-210水平對(duì)CVS的診斷價(jià)值。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、不同程度CVS患者的臨床資料比較

87例顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂出血患者中，術(shù)后無CVS者50例（57.47%），出現(xiàn)CVS患者37例（42.53%），其中輕度CVS10例（11.49%）、中度19例（21.84%）、重度8例（9.20%）。不同程度CVS患者性別比例、年齡、BMI、Hunt氏法分級(jí)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳細(xì)信息見表1。

表1 不同程度CVS患者的臨床資料比較

二、不同程度CVS患者顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂出血術(shù)后血清HIF-1α、miR-210水平比較

術(shù)前不同程度CVS患者血清HIF-1α、miR-210水平相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。術(shù)后3、7 d，不同程度CVS患者血清中HIF-1α、miR-210水平與無CVS組患者相比均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且CVS程度越重，血清HIF-1α、miR-210表達(dá)水平越高。不同程度CVS患者術(shù)后3、7 d的血清HIF-1α、miR-210水平均顯著高于術(shù)前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；術(shù)后7 d時(shí)血清HIF-1α、miR-210水平均顯著低于術(shù)后3 d，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳細(xì)信息見表2。

表2 不同程度CVS患者顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂出血術(shù)后血清HIF-1α、miR-210水平比較（）

表2 不同程度CVS患者顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂出血術(shù)后血清HIF-1α、miR-210水平比較（）

與無CVS組比較，a P＜0.05；與輕度CVS組比較，b P＜0.05；與中度CVS組比較，c P＜0.05；與術(shù)前比較，d P＜0.05；與術(shù)后3 d比較，e P＜0.05；CVS：腦血管痙攣；HIF-1α：缺氧誘導(dǎo)因子1α；miR-210：微小RNA-210

三、顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂出血術(shù)后血清HIF-1α、miR-210表達(dá)的相關(guān)性

顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂出血術(shù)后3、7 d患者血清HIF-1α水平與miR-210水平均呈正相關(guān)（r=0.381、P=0.012，r=0.631、P=0.000）（圖1）。

圖1 顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂出血術(shù)后血清HIF-1α、miR-210表達(dá)的相關(guān)性分析

四、ROC曲線分析顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂出血術(shù)后3 d患者血清HIF-1α、miR-210水平對(duì)CVS的診斷價(jià)值

術(shù)后3 d顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂出血患者血清HIF-1α水平診斷CVS的曲線下面積（areaunder thecurve，AUC）為0.834（95%CI：0.748～0.920，P=0.000），診斷分界點(diǎn)為84.82 pg/mL，血清miR-210水平診斷顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂出血患者CVS的AUC為0.769（95%CI：0.662～0.877，P=0.000），二者聯(lián)合診斷顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂出血患者CVS的AUC為0.900（95%CI：0.830～0.970，P=0.000）（圖2）。

五、血清HIF-1α、miR-210檢測CVS的診斷價(jià)值

HIF-1α取最佳截?cái)嘀?4.82 pg/mL時(shí)，檢測CVS的敏感度為81.80%，準(zhǔn)確度為80.46%；miR-210取最佳截?cái)嘀?.09時(shí)，檢測CVS的敏感度為59.46%，準(zhǔn)確度為77.01%。HIF-1α、miR-210二者聯(lián)合檢測CVS的敏感度為94.59%、準(zhǔn)確度為87.36%，均高于HIF-1α、miR-210單獨(dú)檢測。詳細(xì)信息見表3～4。

討 論

顱內(nèi)動(dòng)脈瘤性SAH是常見的出血性腦血管疾病，多由動(dòng)脈瘤及血管畸形破裂出血等引起，其總年發(fā)病率約9.1/10萬，病死率約50%，30%存活者生活不能自理，威脅人類身體健康[9]。CVS是指顱內(nèi)動(dòng)脈的持續(xù)性收縮狀態(tài)，是顱內(nèi)動(dòng)脈瘤性SAH最常見的并發(fā)癥，發(fā)生率達(dá)40%～80%，由血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)和功能改變、血管收縮作用的增強(qiáng)和舒張作用的減弱所致，常引起嚴(yán)重的局部腦組織缺血或遲發(fā)性腦損傷，是患者重殘或死亡的主要原因[10]。目前臨床上尚缺乏有效的CVS診斷指標(biāo)，因此繼續(xù)尋找特異、有效的生物學(xué)指標(biāo)對(duì)于早期預(yù)測及診斷CVS的發(fā)生、降低顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂出血患者的死亡率具有積極的意義。

圖2 術(shù)后3 d患者血清HIF-1α、miR-210水平診斷腦血管痙攣的ROC曲線

表3 血清HIF-1α、miR-210檢測腦血管痙攣的診斷結(jié)果

表4 血清HIF-1α、miR-210檢測腦血管痙攣診斷價(jià)值（%）

HIF-1α是HIF-1的功能性亞基，是一種介導(dǎo)機(jī)體對(duì)缺氧環(huán)境產(chǎn)生應(yīng)答的重要轉(zhuǎn)錄因子，在低氧環(huán)境中能夠調(diào)節(jié)穩(wěn)態(tài)平衡及介導(dǎo)低氧反應(yīng)[11]。董靜和劉群[12]研究表明，HIF-1α在人腦出血灶周腦組織中表達(dá)明顯上調(diào)，其表達(dá)水平與腦水腫密切相關(guān)。miR-210是一種缺氧特異性miRNA，在機(jī)體缺氧條件下表達(dá)上調(diào)[13]。研究表明，當(dāng)人大腦處于嚴(yán)重缺血缺氧狀態(tài)時(shí)，其血液中miR-210表達(dá)水平會(huì)明顯變化，其表達(dá)水平與腦損傷情況有關(guān)[14]。王新立等[15]研究表明，miR-210的表達(dá)水平與SAH大鼠遲發(fā)性CVS的發(fā)生有關(guān)。本研究結(jié)果顯示42.53%的顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂出血患者出現(xiàn)CVS。術(shù)后3、7 d，與無CVS患者相比，不同程度CVS患者血清中HIF-1α、miR-210水平均顯著升高，且CVS程度越重，血清HIF-1α、miR-210表達(dá)水平越高，提示血清HIF-1α、miR-210水平可能與CVS進(jìn)展有關(guān)。不同程度CVS患者術(shù)后7 d血清HIF-1α、miR-210水平均顯著低于術(shù)后3 d，提示可能是受手術(shù)的影響；術(shù)后3 d患者血清HIF-1α、miR-210水平較高，血清HIF-1α、miR-210水平隨著術(shù)后時(shí)間的延長，其表達(dá)動(dòng)態(tài)變化可能在一定程度上指導(dǎo)臨床治療方案的調(diào)整。

本研究進(jìn)一步分析顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂出血術(shù)后血清HIF-1α與miR-210表達(dá)的關(guān)系，結(jié)果顯示顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂出血患者術(shù)后3、7 d血清HIF-1α水平與miR-210水平均呈正相關(guān)，提示血清HIF-1α、miR-210可能具有一定調(diào)節(jié)關(guān)系，共同參與顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂出血患者術(shù)后CVS的發(fā)生及發(fā)展。采用ROC曲線分析其診斷價(jià)值，結(jié)果顯示顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂出血術(shù)后3 d患者血清HIF-1α水平診斷CVS的AUC為0.834，診斷分界點(diǎn)為84.82 pg/mL，血清miR-210水平診斷CVS的AUC為0.769，二者聯(lián)合診斷顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂出血患者CVS的AUC為0.900，敏感度為93.06%，準(zhǔn)確度為87.36%，均高于單項(xiàng)指標(biāo)檢測。提示血清HIF-1α、miR-210水平對(duì)顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂出血術(shù)后CVS早期診斷可能具有一定的參考價(jià)值，二者聯(lián)合檢測可能成為CVS發(fā)生、發(fā)展的重要生物學(xué)指標(biāo)。

綜上所述，顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂出血術(shù)后血清HIF-1α、miR-210水平可有效預(yù)示CVS的發(fā)生，二者可能成為CVS發(fā)生、發(fā)展的重要生物學(xué)指標(biāo)。然而本研究僅探究了顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂出血術(shù)后血清HIF-1α、miR-210表達(dá)與CVS的關(guān)系，具體生物學(xué)調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚，仍需進(jìn)一步研究。