彭 敏，羅 邦，朱威霖，楊春玲，趙永貞，李強(qiáng)勇，劉青云，曾地剛，李 旻，陳秀荔

（1.廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)科學(xué)研究院// 2.廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530021）

牡蠣屬雙殼綱（Bivalvia ）翼形亞綱（Pterimorphia）珍珠貝目（Pterioida）牡蠣科（Ostreidae），是分布廣、種類多、產(chǎn)量高的一種經(jīng)濟(jì)貝類[1-2]，在近岸生態(tài)系統(tǒng)中扮演重要角色[3]。牡蠣具有廣棲息性，外部形態(tài)常隨生活環(huán)境不同而變化，在所有海洋無(wú)脊椎動(dòng)物中，牡蠣是最常見的、形態(tài)變異大的一類[4]，通過(guò)形態(tài)來(lái)確定牡蠣的分類地位往往會(huì)造成錯(cuò)誤和困惑[5-9]。因此，尋找快速有效的種類鑒定方法，對(duì)牡蠣的遺傳改良、種質(zhì)資源管理與保護(hù)等具有重要意義。目前，線粒體及核糖體DNA序列是鑒定和分類巨礪屬牡蠣的常用方法，例如Klinbunga等[10]用線粒體DNA標(biāo)記對(duì)泰國(guó)的Crassostrea belcheri、艾氏牡蠣（Crassostrea iredalei）和僧帽牡蠣（Saccostrea cucullata）進(jìn)行分類。Mazon-Suastegui等[11]報(bào)道稱28S rDNA是商業(yè)上重要的牡蠣鑒定的替代標(biāo)記。Cordes等[12]報(bào)道了基于線粒體DNA標(biāo)記區(qū)分9種巨蠣屬牡蠣物種。Diaz等[13]根據(jù)5S rDNA基因擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)對(duì)Crassostrea和Ostrea oysters的物種鑒定；Lam等[14-15]基于線粒體DNA方法鑒定出一種新的巨蠣屬牡蠣和印度西太平洋巖牡蠣；Wang等[7]基于線粒體16S rRNA和核28S rRNA基因的DNA序列對(duì)近江牡蠣進(jìn)行分類；楊葉欣等[16]采用RAPD分子標(biāo)記和rDNA-ITS1序列分析對(duì)近江牡蠣兩個(gè)野生種群的遺傳多樣性分析；李詠梅等[17]進(jìn)行了欽州灣牡蠣線粒體16S rRNA和COⅠ基因片段的序列變異分析。此外，還有非基因方法來(lái)研究鑒定和分類，如Wang等[18]采用高分辨率熔解分析法研究了來(lái)自中國(guó)的五種巨蠣屬牡蠣的鑒定。DNA序列分析是DNA多態(tài)分析技術(shù)中最有效的方法之一，是各類生物的遺傳、進(jìn)化和生態(tài)等領(lǐng)域研究的重要工具。核糖體DNA轉(zhuǎn)錄間隔子序列（Internal transcribed spacer，ITS）進(jìn)化速度快、在種和種下水平變異豐富，是重要的分子標(biāo)記，在無(wú)脊椎動(dòng)物的分子系統(tǒng)學(xué)研究中，ITS 區(qū)序列已得到了廣泛的應(yīng)用，為解決一些長(zhǎng)期存在的分類學(xué)問(wèn)題提供了新的重要標(biāo)記[19-25]。目前關(guān)于采用線粒體DNA片段（COI、12S、16S和tRNAs）以及核糖體RNA基因轉(zhuǎn)錄間隔子序列ITS-1、ITS-2和ITS對(duì)巨蠣屬牡蠣進(jìn)行鑒定和分類鮮有報(bào)道。針對(duì)牡蠣外殼形態(tài)的多變性，為尋找合適的用于區(qū)分牡蠣的DNA條形碼（DNA barcodes），本研究通過(guò)對(duì)線粒體DNA片段（COI、12S、16S和tRNAs）以及核糖體RNA基因轉(zhuǎn)錄間隔子序列（ITS-1、ITS-2和ITS）的比對(duì)分析，對(duì)我國(guó)沿海分布的香港牡蠣（Crassostreahongkongensis）、有明牡蠣（Crassostrea ariakensis）、葡萄牙牡蠣（Crassostrea gigas angulata）、太平洋牡蠣（Crassostrea gigas gigas）、熊本牡蠣（Crassostrea sikamea）、巖牡蠣（Crassostrea nippona）和艾氏牡蠣（Crassostrea iredalei）等7種巨礪屬牡蠣進(jìn)行分子系統(tǒng)學(xué)研究，旨在尋找出快速有效的種類鑒定和分類方法，以期闡明其系統(tǒng)關(guān)系和種類區(qū)分，進(jìn)而為牡蠣的遺傳改良、種質(zhì)資源管理與保護(hù)提供依據(jù)和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究分別在廣西欽州、防城、廣東陽(yáng)江、山東萊州灣和福建等地收集香港牡蠣、有明牡蠣、葡萄牙牡蠣、太平洋牡蠣和熊本牡蠣等5種牡蠣樣本各10個(gè)，分別對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序。

利用GenBank公布的與本研究同屬或同種的牡蠣線粒體全基因序列33條及全長(zhǎng)ITS序列25條比對(duì)分析，這些序列劃屬于7個(gè)巨礪屬種（表1）。

表1 所用樣品的相關(guān)信息Table 1 Related information on the samples used in this study

1.2 DNA 的提取、擴(kuò)增與測(cè)序

采集牡蠣閉殼肌按醋酸銨法提取牡蠣總DNA[26]。本研究選用4段線粒體DNA片段和3段核DNA片段對(duì)我國(guó)采集的香港牡蠣、有明牡蠣、葡萄牙牡蠣、太平洋牡蠣和熊本牡蠣樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，tRNAs片段擴(kuò)增界于12S和16S之間，其引物根據(jù)Genbank中巨礪屬線粒體DNA序列設(shè)計(jì)相應(yīng)的擴(kuò)增引物，而COI、16S、12S、ITS1、ITS2和ITS均采用貝類基因通用引物，本研究所采用的引物見表2。

表2 PCR擴(kuò)增K片段及引物序列Table 2 Primer sequence for PCR

1.3 DNA序列處理及數(shù)據(jù)分析

采用SeqMan程序，COI、16S、12S片段拼接后去除引物區(qū)及不穩(wěn)定區(qū)域，tRNAs、ITS片段測(cè)序拼接后去除兩端序列，ITS1和ITS2序列直接用ITS序列切除獲得；在GenBank下載的序列與本實(shí)驗(yàn)樣品的測(cè)序結(jié)果比對(duì)后獲得相應(yīng)的序列。應(yīng)用MEGA4.1軟件計(jì)算基于Kimura雙參數(shù)距離模型（K2P）的序列種間和種內(nèi)遺傳距離[27]；通過(guò)Wilcoxon檢驗(yàn)分析不同序列之間的變異性[28]；通過(guò)比較序列種內(nèi)和種間變異的分布評(píng)估條形碼間隙（barcoding gap）；采用BLAST和Nearest Distance考察序列的鑒定成功率。

2 結(jié)果與分析

2.1 7個(gè)基因片段的序列分析

由表3可知，50個(gè)樣本的7個(gè)片段均全部PCR擴(kuò)增成功，COI、16S、12S和tRNAs PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均可直接測(cè)序成功，ITS1、ITS2和ITS直接測(cè)序成功率極低，故ITS PCR產(chǎn)物電泳切膠回收后克隆，所得的克隆子均測(cè)序成功，ITS1和ITS2序列直接用ITS序列切除而得。

各條序列的長(zhǎng)度從277～ 1 203 bp不等，去除兩端12S和16S部分序列后獲得的tRNAs序列最短，為277～ 306 bp，ITS序列最長(zhǎng)，為1101～ 1 203 bp。tRNAs序列變異位點(diǎn)最多，為51.4%，12S變異位點(diǎn)最少，為10.3%。各序列的GC含量也不相同，ITS1序列的GC含量最高，達(dá)到58.0%，tRNAs序列的GC含量最低，A+T含量高達(dá)71.4%。

2.2 7個(gè)基因片段序列的差異分析

對(duì)獲得的巨礪屬牡蠣不同序列的平均種間距離、平均種內(nèi)距離、最小種間距離和最大種內(nèi)距離進(jìn)行分析。結(jié)果如表4所示，在種間最小距離中，tRNAs序列最大，COI序列次之，16S序列最小，種內(nèi)最大距離中，同樣是tRNAs序列最大，COI序列次之，12S序列最小，ITS1的種內(nèi)最大距離過(guò)了種間最小距離。

表3 7個(gè)基因片段的序列分析結(jié)果Table 3 Sequence analysis results of seven DNA fragment

表4 7個(gè)基因片段在巨蠣屬種內(nèi)種間變異Table 4 Inter-specific variation and Intra-specific variation in seven gene fragments in Crassostrea

亞種間及亞種內(nèi)不同序列的差異分析結(jié)果如表5，亞種間最小距離序列差異對(duì)比發(fā)現(xiàn)，tRNAs序列差異最大，COI次之，而12S、ITS、ITS1、ITS2亞種間最小距離的序列差異為0；亞種內(nèi)最大距離對(duì)比發(fā)現(xiàn)，ITS1和ITS差異最大，12S、ITS、ITS1和ITS2的亞種內(nèi)最大距離序列差異變化均超過(guò)了亞種間最小距離的序列變化差異。

表5 7個(gè)基因片段在巨蠣屬亞種內(nèi)亞種間變異Table 5 Inter-subspecific variation and Intra-subspecific variation in seven gene fragments in Crassostrea

2.3 7個(gè)基因片段序列變異程度比較

Wilcoxon秩和檢驗(yàn)結(jié)果（表6、7）表明，無(wú)論是種間變異還是種內(nèi)變異，最大的都是tRNAs序列，COI序列次之，12S序列最小。在亞種間變異，最大的是tRNAs序列，COI次之，12S序列最小，而在亞種內(nèi)變異，ITS1序列最大，ITS次之，12S序列最小。tRNAs和COI序列較其它序列具有極顯著性差異，反映出各序列（亞）種間的變異情況是tRNAs和COI較其它序列變異更快，所得結(jié)果與表5中（亞）種間距離值結(jié)果一致。

表6 7個(gè)基因片段在種間種內(nèi)差異的Wilcoxon秩和檢驗(yàn)Table 6 Wilcoxon Rank and Test of Inter-specific variation and Intra-specific variation in seven gene fragments

表7 7個(gè)基因片段在亞種間亞種內(nèi)差異的Wilcoxon秩和檢驗(yàn)Table 7 Wilcoxon Rank and Test of Inter-subspecific variation and Intra-subspecific variation in seven gene fragments

2.4 7個(gè)基因片段在種內(nèi)變異和種間變異分布

巨礪屬不同序列種內(nèi)變異和種間變異分布圖（圖1）顯示，在種層面上，tRNAs和COI序列種間變異與種內(nèi)變異之間有明顯的條形碼間隙，12S、16S、ITS和ITS2的種間變異與種內(nèi)變異沒(méi)有重疊，但也不存在條形碼間隙，而ITS1的種間變異與種內(nèi)變異出現(xiàn)重疊，不利于區(qū)分物種。在亞種層面上，12S、ITS、ITS1和ITS2的亞種間變異與亞種內(nèi)變異出現(xiàn)重疊，16S的亞種間變異與亞種內(nèi)變異雖沒(méi)有重疊，但也不存在條形碼間隙，而tRNAs和COI序列亞種間變異與亞種內(nèi)變異之間有明顯的條形碼間隙，有利于區(qū)分亞種。

圖1 （亞）種內(nèi)和（亞）種間變異分布Fig.1 genetic variation distribution of species and subspecies

3 討論

巨牡蠣屬的分類已經(jīng)研究了很多年，盡管已引入分子鑒別方法，但是爭(zhēng)論仍然不斷，其中1 個(gè)典型例子就是C.gigas和C.angulata的分類關(guān)系。一些研究者認(rèn)為這2 個(gè)是不同的種，但是遺傳上近緣關(guān)系很近[29]，另外有人則表示這2 個(gè)應(yīng)該為1 個(gè)種[30-31]，還有人將福建等南方海域廣泛分布并大量養(yǎng)殖的葡萄牙牡蠣命名為福建長(zhǎng)牡蠣（C.gigas angulata），并將其與我國(guó)長(zhǎng)江口以北海域廣泛分布并大量養(yǎng)殖的長(zhǎng)牡蠣（C.gigas gigas）由種間關(guān)系修訂為亞種關(guān)系[32]。本研究采用第三種觀點(diǎn)對(duì)我國(guó)巨礪屬牡蠣進(jìn)行分析。

理想的DNA條形碼序列應(yīng)具備明顯的種間變異，同時(shí)種內(nèi)變異要足夠小，并在兩者間形成一個(gè)明顯的間隔區(qū)，即條形碼間隙[33]，并且應(yīng)該能夠使用單引物對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)雙向測(cè)序得到高質(zhì)量的序列[34-35]。Hebert等認(rèn)為種內(nèi)與種間的標(biāo)準(zhǔn)差異應(yīng)為種內(nèi)平均遺傳距離的10倍（10倍法則）[36]。另外有一些研究者則建議當(dāng)計(jì)算條形碼間隙時(shí)應(yīng)用最小種間距離取代平均種間距離[37]。本研究對(duì)7個(gè)不同牡蠣品種的tRNAs、COI、16S、12S、ITS、ITS1和ITS2序列進(jìn)行分析。分析結(jié)果表明，在種層面上，7種序列的種內(nèi)種間平均距離均超過(guò)種內(nèi)平均距離10倍以上，但若用最大種內(nèi)距離和最小種間距離取代平均種內(nèi)距離和平均種間距離，最大倍率為tRNAs（4.25）隨后是12S（3.52）和COI（2.96）最低為ITS1，僅為0.67，10倍距離法是不能滿足。在亞種層面上，tRNAs、COI、16S的種內(nèi)種間平均距離均超過(guò)種內(nèi)平均距離10倍以上，而最小種間距離與最大種內(nèi)距離最大倍率為COI（2.62），隨后是tRNAs（1.95），12S、ITS、ITS1和ITS2最小種間距離與最大種內(nèi)距離比值為0，無(wú)法區(qū)分亞種。在植物鑒定中，表現(xiàn)較好的ITS、ITS1、ITS2常作為各種植物鑒定的候選DNA條形碼序列[38-39]。然而，在本研究中巨蠣屬牡蠣種內(nèi)與種間遺傳差異中ITS1存在重疊，而ITS、ITS2與12S無(wú)條形碼間隙，即使C.gigas gigas和C.gigas angulata有共同序列也難以區(qū)分這些種，因此這些基因片段不適合用作種水平的物種鑒定。16S盡管也有較高的遺傳分化率，但在（亞）種間與（亞）種內(nèi)距離分布圖中沒(méi)有明顯的條形碼間隙，而16S和12S遺傳變異在本研究中7種序列中最小，隨著采樣范圍的擴(kuò)大和樣品數(shù)量的增加，（亞）種內(nèi)的遺傳距離很可能也隨之增大而出現(xiàn)重疊。相較而言，tRNAs、COI比12S和16S更適合巨礪屬牡蠣物種鑒別，與王青[40]的研究結(jié)果認(rèn)為COI優(yōu)于16S一致，與劉凱凱等[41]認(rèn)為COI可以快速鑒定巖牡蠣和長(zhǎng)牡蠣結(jié)果一致，但他們認(rèn)為16S與COI均可快速鑒定巖牡蠣和長(zhǎng)牡蠣。

4 結(jié)論

在鑒別巨蠣屬牡蠣種以及亞種方面本研究中表現(xiàn)最好的是tRNAs，其次為COI 序列，tRNAs比COI 序列擁有更高的變異，但從巨礪屬牡蠣物種來(lái)說(shuō)COI 序列更適合物種鑒定，COI 引物具有更廣的通用性[42]。在鑒別巨礪屬牡蠣方面tRNAs 具有更高的變異性和更大的條形碼間隙可作為COI 序列的輔助序列。本研究證實(shí)了tRNAs 和COI 序列不僅可用于種間的鑒定，也可用于亞種間的鑒定。該研究可用于闡明牡蠣系統(tǒng)關(guān)系和種類區(qū)分，進(jìn)而為其遺傳改良、種質(zhì)資源管理與保護(hù)提供依據(jù)和指導(dǎo)。