胡興 茍知賢 王幽夢 黃林 周月 魯利群

成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院兒科（成都610500）

缺氧缺血性腦損傷（hypoxic-ischemic brain damage，HIBD）是指圍生期窒息導(dǎo)致的腦組織缺氧缺血（hypoxic-ischemic，HI）性損害[1-2]。研究[3]顯示，HI后神經(jīng)炎癥是新生兒腦損傷演變的關(guān)鍵因素。NLRP3炎癥小體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用[4]，其過度活化介導(dǎo)下游信號通路的激活參與了多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病[5]。目前，NLRP3炎癥小體信號通路在HIBD中的表達情況及作用相關(guān)報道較少。本實驗通過建立HIBD新生大鼠模型，檢測NLRP3炎癥小體信號通路相關(guān)分子在HIBD新生大鼠海馬中的表達情況，以闡明引起HIBD新生大鼠神經(jīng)細(xì)胞死亡的可能機制，為新生兒HIBD疾病的防治提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物健康SPF級7日齡新生SD大鼠（動物合格證號：SCXK（川）2015-030成都達碩實驗動物公司），體質(zhì)量（15±2）g，雌雄不限。

1.2 方法

1.2.1 HIBD新生大鼠動物模型制備將50只7日齡新生SD大鼠隨機分成為假手術(shù)（Sham）組（n=20），模型（HIBD）組（n=30），Sham組將頸部正中皮膚切開分離出左頸總動脈不結(jié)扎，后縫合皮膚，不進行缺氧處理。HIBD組參照文獻[5-7]采用改良Rice法進行HIBD模型制備，讓50只新生大鼠休息0.5 h后放入氧濃度為8%的透明缺氧艙內(nèi)，予以2.5 h缺氧處理。缺氧結(jié)束后大鼠若出現(xiàn)自發(fā)夾尾左旋表明造模成功，將造模成功的新生SD大鼠納入下述實驗中。

1.2.2 WesternBlot 將7日齡新生SD大鼠干預(yù)至相應(yīng)的時間節(jié)點，按照RIPA組織裂解液（Solarbio，中國北京）說明書提取總蛋白，使用增強型BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒（Solarbio，中國北京）進行蛋白濃度測量后按照Western Blot的步驟進行電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶封閉2 h，一抗 NLRP3（1∶1 000），ASC（1∶500），Pro-Caspase-1（1∶500），Caspase-1（1∶100），GSDMD（1∶500），IL-1β（1∶500），IL-18（1∶300）、Gapdh（1∶2 000），4 ℃冷庫孵育過夜，洗膜后二抗室溫孵育2 h，洗膜后ECL顯影。

1.2.3 實時熒光定量PCR（Real-timeqPCR，RT-qPCR） 引物由上海生工生物公司式設(shè)計、合成和生產(chǎn)。用RNA試劑盒（Solarbio，中國北京）參照說明書提取術(shù)后72 h Sham組和HIBD組新生大鼠左側(cè)海馬組織中RNA，取2 μg的總RNA用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，操作按照試劑盒說明書進行，以1 μL cDNA鏈為模板進行PCR反應(yīng)，上下游引物各0.15 μL，反應(yīng)總體積為20 μL，PCR反應(yīng)體系：95℃，10 min后，95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸10 min，共40個循環(huán)。引物序列如下：Gapdh：上游5′-ATGACATCAAGAAGGTGGTG-3，下游 5′-CATACCAGGAAATGAGCTTG-3′；NLRP3：上游 5′-ACCAATGCGAGATCCTGACAACAC-3′，下游 5′-GAGCTGGACCTCAGTGACAATGC-3′；ASC：上游 5′-GGACCAACACAGGCAAGCACTC-3，下游5′-ACAAGTTCTTGCAGGTCAGGTTCC-3′；Caspase-1：上游 5′-ATGGCCGACAAGGTCCTGAGG-3′，下游5′-GACATGATCGCACAGGTCTCGT-3；GSDMD：上游5′-GTCTGCTTGCCGTACTCCATTCC-3′，下游 5′-TGAAGAGCCTGCCTCCACCTC-3′；IL-1β：上游 5′-AATCTGTACCTGTCCTGCGTGTTG-3′，下游 5′-GAGAGGTGCTGATGTACCAGTTGG-3′；IL-18：上游 5′-ATGGCTGCCATGTCAGAAGAAGG-3′，下 游 5′-TGCTCCGTATTACTGCGGTTGTAC-3′。

1.2.4 HE染色、尼式染色及免疫組織化學(xué)染色檢測術(shù)后72 h將Sham組和HIBD組新生大鼠斷頭取腦組織、固定、脫水、石蠟包埋、腦組織石蠟塊沿冠狀面進行4 μm切片，HE染色觀察海馬DG區(qū)病理形態(tài)學(xué)變化；尼氏染色（1%硫堇溶液）觀察海馬DG區(qū)神經(jīng)元數(shù)目；免疫組織化學(xué)染色檢測海馬DG區(qū)NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達情況，光鏡下觀察新生大鼠左側(cè)海馬DG區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞核染色情況，顯微成像系統(tǒng)圖像掃描，采用Image-Pro Plus軟件測定陽性細(xì)胞平均吸光度值（average optical density，AOD）值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用GraphPad Prism 7.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)分析。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異顯著性采用單因素方差分析，組間兩兩比較用Student′st檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同時間節(jié)點左側(cè)海馬組織中NLRP3炎癥小體及Caspase-1蛋白表達水平Western Blot法檢測Sham組、HIBD組新生大鼠術(shù)后24、48、72 h左側(cè)海馬組織中NLRP3、ASC、Pro-Caspase-1、Caspase-1蛋白水平變化。Western Blot條帶（圖1A）及灰度值（圖1B）顯示，與Sham組相比，HIBD組新生大鼠術(shù)后24 h和48 h NLRP3表達水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），術(shù)后72 h表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；術(shù)后24 h和48 h ASC表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），術(shù)后72 h表達水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；術(shù)后24、48、72 h Pro-Caspase-1表達水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；術(shù)后24 h及48 h Caspase-1表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），術(shù)后72 h表達水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 左側(cè)海馬DG區(qū)HE染色、尼式染色結(jié)果及NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達情況術(shù)后72 h，與Sham組相比，HE染色結(jié)果顯示，HIBD組新生大鼠左側(cè)海馬DG區(qū)細(xì)胞層數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖2）。細(xì)胞排列疏松、散亂，細(xì)胞輪廓及形態(tài)發(fā)生改變，核仁偏移、碎裂、不清晰，膜染色不均勻；尼氏染色結(jié)果顯示，HIBD組新生大鼠左側(cè)海馬DG區(qū)神經(jīng)元丟失較為嚴(yán)重，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖3）；免疫組織化學(xué)染色檢測結(jié)果（圖4）顯示，新生大鼠左側(cè)海馬DG區(qū)神經(jīng)元中NLRP3、ASC、Caspase-1在細(xì)胞質(zhì)表達，呈棕黃色；HIBD組新生大鼠左側(cè)海馬DG區(qū)神經(jīng)NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達增強（表1），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 左側(cè)海馬組織中NLRP3炎癥小體信號通路相關(guān)分子蛋白及mRNA表達水平術(shù)后72 h，與Sham組相比，Western Blot條帶（圖5A）及灰度值（圖5B）、RT-q PCR檢測結(jié)果（圖6）顯示，HIBD組新生大鼠左側(cè)海馬組織中NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18的蛋白及mRNA表達水平均升高，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 各組新生大鼠左側(cè)海馬組織NLRP3、ASC、Pro-Caspase-1、Caspase-1的蛋白表達條帶（A）及灰度值（B）Fig.1 Protein expression bands（A）and gray value（B）of NLRP3，ASC，Pro-Caspase-1 and Caspase-1 in the left hippocampus of neonatal rats in each group

圖2 新生大鼠腦組織HE染色結(jié)果Fig.2 HE staining results in neonatal rat brain tissue

圖3 新生大鼠腦組織尼氏染色結(jié)果Fig.3 Nissl staining results in brain tissue of newborn rats

圖4 新生大鼠腦組織免疫組織化學(xué)染色結(jié)果比較（×400）Fig.4 Comparison of immunohistochemical staining results in brain tissue of neonatal rats（× 400）

表1 不同組新生大鼠左側(cè)海馬DG區(qū)神經(jīng)元NLRP3、ASC、Caspase-1的表達（AOD值）Tab.1 Expression of NLRP3，ASC and Caspase-1 in hippocampal DG neurons of different groups of neonatal rats（AOD value）±s

表1 不同組新生大鼠左側(cè)海馬DG區(qū)神經(jīng)元NLRP3、ASC、Caspase-1的表達（AOD值）Tab.1 Expression of NLRP3，ASC and Caspase-1 in hippocampal DG neurons of different groups of neonatal rats（AOD value）±s

注：與Sham組相比，*P＜0.05

組別Sham組HIBD組F值P值NLRP3 0.203 5±0.013 1 0.217 2±0.017 3*296.556＜0.01 ASC 0.201 0±0.013 6 0.208 1±0.016 3*243.43＜0.01 Caspase-1 0.200 8±0.015 8 0.206 3±0.018 4*213.225＜0.05

圖5 各組新生大鼠左側(cè)海馬組織NLRP3炎癥小體信號通路相關(guān)分子的蛋白表達條帶及灰度值Fig.5 Protein expression bands and gray value of NLRP3 inflammatory corpuscle signaling pathway in the left hippocampus of neonatal rats in each group

3 討論

新生兒HIBD全球發(fā)病率約為2‰～4‰，在罹患HIBD的新生兒中約有25%～30%出現(xiàn)永久性神經(jīng)發(fā)育障礙或認(rèn)知缺陷，15%～20%左右的患兒死亡[8]。亞低溫治療是目前唯一公認(rèn)有效的治療方式，但即使接受亞低溫治療的HIBD新生兒仍會出現(xiàn)較多的后遺癥。HIBD通常以神經(jīng)細(xì)胞死亡為特征[9]，炎癥反應(yīng)是造成HIBD后神經(jīng)細(xì)胞死亡的主要原因之一[10]。細(xì)胞焦亡作為一種新型的伴有炎癥反應(yīng)的程序性細(xì)胞死亡方式，在HIBD中的作用尚不十分清楚。海馬在人類學(xué)習(xí)、記憶等高級神經(jīng)活動中起到了重要的作用，同時海馬也是缺氧缺血損傷中最敏感的部位之一[11-12]。海馬各區(qū)在信息的處理過程中都扮演著重要角色，信息進入海馬時由DG區(qū)流入其他各區(qū)。因此，積極尋找引起海馬DG區(qū)神經(jīng)細(xì)胞死亡的原因，對新生兒HIBD的防治至關(guān)重要。

圖6 RT-qPCR檢測新生大左側(cè)海馬組織NLRP3炎癥小體信號通路相關(guān)分子mRNA水平Fig.6 RT-qPCR detection of NLRP3 inflammatory signaling pathway-related molecular mRNA levels in newborn large left hippocampus（n=8）

NLRP3炎癥小體由NLRP3、凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（ASC）和pro-Caspase-1組成，其激活后導(dǎo)致pro-Caspase-1的募集和活化，形成活性的Caspase-1[13-14]。HIBD新生小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，HI后24 h NLRP3炎癥小體在海馬中的表達上調(diào)2.6倍[15]。同時，NLRP3炎癥小體激活可介導(dǎo)包括新生兒HIBD在內(nèi)的多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病引起的神經(jīng)損傷[16]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，HIBD新生大鼠左側(cè)海馬組織中NLRP3、ASC、活性Caspase-1蛋白的表達高峰時間分別在術(shù)后24、72 h，NLRP3的表達高峰時間先于活化Caspase-1的表達高峰時間，由此推測，本實驗過程中HI作為刺激因素，可能引發(fā)NLRP3炎癥小體的激活，進而介導(dǎo)Caspase-1的活化。本實驗研究顯示，術(shù)后72 h，與Sham組相比，HIBD組新生大鼠左側(cè)海馬DG區(qū)細(xì)胞層數(shù)相對減少、細(xì)胞排列相對紊亂，神經(jīng)元數(shù)目丟失增多，NLRP3、ASC、活性Caspase-1蛋白表達增強。上述實驗結(jié)果進一步證實，新生大鼠HI后可能引起NLRP3炎癥小體的激活，進而介導(dǎo)Caspase-1的活化，最終可能引起神經(jīng)細(xì)胞死亡。

細(xì)胞焦亡是一種新的促炎程序性細(xì)胞死亡方式，其經(jīng)典途徑是依賴Caspase-1的活化。當(dāng)機體受到外來刺激時，NLRP3與ASC結(jié)合并募集pro-Caspase-1組裝形成NLRP3炎癥小體，NLRP3炎癥小體調(diào)控Caspase-1的激活，活性Caspase-1能將胞內(nèi)無活性的IL-18和IL-1β前體剪切為成熟的IL-18和IL-1β，放大炎癥反應(yīng)，如同發(fā)生級聯(lián)效應(yīng)，最終引起細(xì)胞焦亡[17-18]?；钚訡aspase-1還可以激活GSDMD使成熟的IL-1β和IL-18分泌到胞外發(fā)揮相應(yīng)的作用[19]。目前，活化的Caspase-1切割GSDMD底物被認(rèn)為是細(xì)胞焦亡的關(guān)鍵執(zhí)行環(huán)節(jié)[20]。本實驗研究顯示，術(shù)后72 h，與Sham組相比，HIBD組新生大鼠左側(cè)海馬組織中NLRP3、Caspase-1、ASC、GSDMD、IL-1β、IL-18蛋白及 mRNA表達水平均升高且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。上述實驗結(jié)果表明，NLRP3炎癥小體信號通路相關(guān)分子在HIBD新生大鼠左側(cè)海馬組織中表達上調(diào)，表明新生大鼠HI后可以激活NLRP3炎癥小體信號通路，提示NLRP3炎癥小體信號通路激活介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡可能引起HIBD新生大鼠神經(jīng)細(xì)胞死亡，并在新生大鼠HIBD發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。但目前NLRP3炎癥小體是通過何種途徑被激活，細(xì)胞焦亡在HIBD中的作用以及抑制細(xì)胞焦亡能否為新生兒HIBD的防治提供新思路，需進一步深入研究。