黃東恒 馬彥凝 馮惠怡 朱鳳盈 于新發(fā),2
1廣東醫(yī)科大學(xué)(廣東湛江524002);2南方醫(yī)科大學(xué)順德醫(yī)院腫瘤科(廣東順德528300);3南方醫(yī)科大學(xué)順德醫(yī)院放射治療科(廣東順德528300)
鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是一種起源于鼻咽部黏膜上皮的惡性腫瘤,我國鼻咽癌的發(fā)病率和病死率高于世界平均水平,付振濤等報道2014年我國鼻咽癌發(fā)病率為3.26/10萬,病死率為1.77/10萬,死亡病例約占全球鼻咽癌死亡病例的40%[1]。放療是鼻咽癌首選的治療方法,單純放療及同步放化療是臨床上治療鼻咽癌的主要手段[2],雖然以適形調(diào)強放射治療為代表的治療應(yīng)用于臨床使得原發(fā)鼻咽癌的治療效果顯著提高,但仍有19%~56%的患者在放療后5年內(nèi)發(fā)生局部復(fù)發(fā),特別常見于晚期鼻咽癌患者,一旦出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移,雖然可采取再程放化療等綜合治療措施[3],但再程放療容易產(chǎn)生較嚴重并發(fā)癥,獲益有限[4],因此提高鼻咽癌放射敏感性及對化療藥物的敏感性具有重要意義。
小腦鋅指結(jié)構(gòu)可表達鋅指結(jié)構(gòu)蛋白,最早由ARUGA等[5]于1994年在成年鼠的小腦中發(fā)現(xiàn),因小腦顆粒細胞里大量表達鋅指蛋白而得名。Zic基因家族成員包括了5個成員Zic1~5,其中鋅指蛋白-2(Zinc finger protein 2,Zic2)已被證明作為癌基因在骨肉瘤[6]、胰腺癌[7]、乳腺癌[8]、急性髓系白血病[9]、前列腺癌[10]等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起作用。還有研究發(fā)現(xiàn)HOXA10通過誘導(dǎo)Zic2的表達促進鼻咽癌細胞的增殖和侵襲[11],然而Zic2對鼻咽癌放射敏感性及順鉑敏感性的影響尚未見報道。本研究主要探討Zic2對鼻咽癌CNE2細胞放射敏感性及順鉑敏感性的影響,研究Zic2在鼻咽癌放射抵抗性細胞中表達情況,明確Zic2表達與鼻咽癌細胞放射敏感性及順鉑敏感性的相關(guān)性,為放化療增敏提供分子理論基礎(chǔ),旨在為鼻咽癌的治療尋找新的靶標(biāo),結(jié)果如下。
1.1 材料人CNE2細胞由南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心提供;RPMI-1640、胎牛血清、Opti-MEM購自美國Gibco公司;CCK-8試劑盒購自美國Apexbio公司;Zic2抑制物(siRNA)購自吉瑪公司;Lipofectamine?3000購自Invitrogen公司;0.25%胰酶購自廣州晶欣公司;westem blot實驗相關(guān)試劑購自上海雅酶生物科技有限公司;兔抗人Zic2單克隆抗體(ab150404)購自Abcam公司;辣根過氧化物酶二抗、β-Actin內(nèi)參抗體購自美國Earthox公司;ECL發(fā)光液購自美侖生物。
1.2 實驗方法
1.2.1 CNE2細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及照射用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞,并放置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中,待細胞融合至80%~90%后胰酶消化傳代。取對數(shù)生長期的細胞接種于六孔板中,待貼壁后通過Lipofectamine?3000將Zic2 siRNA轉(zhuǎn)染至CNE2細胞中(siZic2:5′-GGCAAAGUCUUCGCGCGCUTT-3′,5′-AGCGCGCGAAGACUUUGCCTT-3′;NC:5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′,5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′)。細胞貼壁后,在培養(yǎng)板下方墊1 cm厚的凡士林膠,大機頭180°,源皮距100 cm,6 MV的X射線,吸收劑量率為300 cGy/min(Varian),經(jīng)從下往上垂直照射。
1.2.2 轉(zhuǎn)染后細胞增殖能力變化轉(zhuǎn)染24 h后,分別將轉(zhuǎn)染Zic2 siRNA組及陰性對照組的CNE2細胞以每孔1 000個/100 μL接種到96孔板中,設(shè)置3個重復(fù)孔,連續(xù)5 d加入10 μL CCK-8溶液作用1 h,酶聯(lián)免疫檢測儀上450 nm處測定各孔吸光度值。以培養(yǎng)日期為X軸,OD值為Y軸,繪制兩組細胞的生長曲線。
1.2.3 轉(zhuǎn)染后細胞對順鉑的敏感性轉(zhuǎn)染24 h后,將CNE2細胞以每孔2 000個/100 μL接種到96孔板中,設(shè)置3個重復(fù)孔,培養(yǎng)12 h后加入含各種濃度(0、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L)順鉑的10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h后加入10 μL CCK-8溶液作用1 h,酶聯(lián)免疫檢測儀上450 nm處測定各孔吸光度值。重復(fù)3次實驗后計算出各A450平均OD值,并計算各濃度順鉑作用下的細胞抑制率。
1.2.4 轉(zhuǎn)染后細胞放射敏感性的測定
1.2.4.1 CCK-8實驗 轉(zhuǎn)染24 h后,將CNE2細胞以每孔2 000個/100 μL接種到96孔板中,設(shè)置3個重復(fù)孔,培養(yǎng)12 h后行2 Gy劑量的X線照射,對照細胞同等條件處理但不照射;照射后分別于第1、2、3、4、5天加入 10 μL CCK-8溶液作用1 h,采用酶聯(lián)免疫檢測儀450 nm處檢測各孔吸光度值。重復(fù)3次實驗后計算出各A450平均OD值,并計算細胞百分存活率。
1.2.4.2 克隆形成實驗 轉(zhuǎn)染24 h后,按不同照射劑量,接種細胞于6孔板中,設(shè)3個重復(fù)孔。貼壁后分別用0、2、4、6、8 Gy的X線照射,繼續(xù)培養(yǎng)至出現(xiàn)肉眼可見集落,甲醇固定15 min,PBS洗滌,0.1%的結(jié)晶紫染色20 min,顯微鏡下計數(shù)細胞個數(shù)≥50的集落,計算各組細胞存活分數(shù)。
1.2.5 建立并驗證放射抵抗性細胞系取指數(shù)生長期CNE2細胞,消化成單細胞懸液種植于6孔板中,種植細胞密度為4.0×104個/孔,貼壁后照射8 Gy繼續(xù)培養(yǎng),挑選出存活亞克隆細胞培養(yǎng)至穩(wěn)定生長后重復(fù)以上過程給予6 Gy共3次及8 Gy 1次照射,命名為CNE2-R,待細胞穩(wěn)定常規(guī)傳代5次后用于以下實驗:取處于對數(shù)生長期的親本株CNE2細胞及放射抗拒株CNE2-R細胞分別稀釋成2 000個/100 μL接種于96孔板內(nèi),用CCK-8實驗檢測各孔OD值并繪制親本株及放射抗拒株細胞經(jīng)6 Gy照射后0~7 d的細胞增殖曲線??寺⌒纬蓪嶒炗嬎銉芍昙毎到?jīng)不同劑量照射后各組細胞存活分數(shù),整個照射及培養(yǎng)過程歷時8個月。
1.2.6 提取總蛋白及Westernblot分析 轉(zhuǎn)染48 h后,提取轉(zhuǎn)染Zic2 siRNA與陰性對照組CNE2細胞的總蛋白、提取CNE2-R與CNE2細胞總蛋白及提取未照射的CNE2與照射6 Gy后24 h的CNE2細胞總蛋白。10%的SDS-PAGE電泳分離蛋白,后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂牛奶室溫下封閉2 h。將膜分別放置于1∶5 000體積稀釋的Zic2單克隆抗體和1∶5 000體積稀釋抗β-Actin單克隆抗體中4℃過夜。PBST洗膜后置于1∶5 000體積稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗中室溫下孵育2 h。PBST洗膜后,用ECL試劑發(fā)光及顯影。
1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用GraphPad Prime 8.0軟件進行統(tǒng)計分析,均值±標(biāo)準(zhǔn)差記錄數(shù)據(jù)并繪制相關(guān)曲線。比較組間數(shù)據(jù)用t檢驗分析(P<0.05)。擬合多靶單擊模型計算相關(guān)放射生物學(xué)參數(shù)來比較兩株細胞系的放射敏感性。
2.1 Zic2對CNE2細胞生長增殖的影響通過繪制陰性對照組及轉(zhuǎn)染Zic2 siRNA的CNE2兩組細胞的生長曲線,發(fā)現(xiàn)抑制Zic2表達后細胞增殖率降低(P<0.01),見圖1。
圖1 CCK-8檢測抑制Zic2表達對CNE2細胞增殖的影響Fig.1 Effect of inhibition of Zic2 expression on proliferation of CNE2 cells
2.2 Zic2對CNE2細胞順鉑敏感性的影響CCK-8實驗測出轉(zhuǎn)染Zic2 siRNA組與對照組細胞經(jīng)各濃度(0、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L)順鉑作用24 h及48 h后的OD值并計算相應(yīng)的抑制率,發(fā)現(xiàn)抑制Zic2表達的CNE2細胞經(jīng)不同濃度的順鉑作用后,細胞抑制率較對照組明顯提高(P<0.05),見圖2。
圖2 CCK-8檢測抑制Zic2表達對CNE2細胞對順鉑敏感性的影響Fig.2 Effect of inhibition of Zic2 on sensitivity of CNE2 cells to Cisplatin
2.3 Zic2對CNE2細胞放射敏感性的影響克隆形成實驗結(jié)果顯示抑制Zic2表達的CNE2細胞經(jīng)不同劑量X線照射后,細胞存活分數(shù)明顯下降,通過多靶單擊模型擬合實驗數(shù)據(jù),并求出細胞放射敏感性參數(shù)D0(平均致死劑量)、Dq(準(zhǔn)閾劑量)和N值(靶數(shù))以及照射2 Gy后細胞存活分數(shù)(SF2)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制Zic2表達的CNE2細胞SF2、Do、Dq、N均變小,放射增敏比(SER)為1.483,說明抑制Zic2表達后的CNE2細胞具有更高的放射敏感性。見表1。CCK-8實驗結(jié)果顯示:經(jīng)2Gy照射后,抑制Zic2表達的CNE2細胞的存活率低于陰性對照組細胞,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖3。
圖3 CCK8檢測抑制Zic2表達后照射2 Gy對CNE2細胞存活率的影響Fig.3 Effect of inhibition of Zic2 on survival rate of CNE2 cells after 2 Gy irradiation
表1 多靶單擊模型擬合的放射生物學(xué)參數(shù)值Tab.1 Paremeter values of Single-hit Multi-target model fitting
2.4 CNE2與CNE2-R細胞放射敏感性的比較CCK-8實驗結(jié)果顯示:CNE2與CNE2-R細胞在接受6Gy的X射線照射后,兩株細胞緩慢增殖,但照射第5天后,CNE2細胞迅速死亡,而CNE2-R細胞則繼續(xù)緩慢生長,表現(xiàn)出更高的生存率,兩種細胞增殖情況差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),見圖4。克隆形成實驗結(jié)果顯示CNE2-R細胞較親本CNE2細胞 SF2、Do、Dq、N 變大,具有較高的放射抵抗性,見表2。
圖4 CNE2與CNE2-R照射6Gy后細胞的增殖曲線Fig.4 Proliferation of CNE 2 and CNE 2-R after irradiated 6 Gy
表2 多靶單擊模型計算CNE2與CNE2-R的放射生物學(xué)參數(shù)Tab.2 Paremeter values of Single-hit MμLti-target model fitting
2.5 Westernblot實驗檢測Zic2蛋白的表達Western blot實驗結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染Zic2抑制物siRNA可顯著降低CNE2細胞中Zic2的蛋白表達,證明成功轉(zhuǎn)染,見圖5A。與親本細胞株CNE2比較,放射抵抗性細胞CNE2-R的Zic2蛋白明顯高表達,見圖5B。經(jīng)6 Gy劑量X線照射CNE2細胞24 h后與未照射細胞比較,照射后的CNE2細胞Zic2蛋白表達水平高于未經(jīng)照射的細胞,見圖5C。
圖5 Zic2蛋白表達檢測Fig.5 Western blot results of Zic2 expression
許多抗癌藥物是通過損傷腫瘤細胞DNA來達到治療的目的,但腫瘤細胞可以激活自身的DNA損傷修復(fù)機制進行修復(fù),從而對DNA損傷藥物產(chǎn)生耐藥[12]。順鉑是臨床上治療鼻咽癌最常用的化療藥物,所以選擇順鉑進行研究具有重要的臨床指導(dǎo)意義。本研究通過轉(zhuǎn)染siRNA以抑制CNE2細胞中Zic2的表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制Zic2表達后CNE2細胞的增殖能力下降,且明顯提高CNE2細胞對順鉑的敏感性。LU等[13]研究發(fā)現(xiàn)Zic2-PAK4可導(dǎo)致肝細胞癌預(yù)后不良,Zic2與PAK4的表達呈正相關(guān),PAK4可通過PI3K/Akt-和MEK/ERK-依賴途徑使胃癌細胞對順鉑產(chǎn)生耐藥性[14],許多腫瘤過度激活的PI3K/Akt信號通路與腫瘤化療耐藥的產(chǎn)生密切相關(guān)[15],因此推測 Zic2-PAK-PI3K/Akt途徑可能降低鼻咽癌細胞對順鉑的敏感性,從而影響鼻咽癌的治療效果。
腫瘤細胞經(jīng)過長期的放射線反復(fù)照射之后,某些基因、蛋白質(zhì)等表達異常可降低腫瘤細胞的放射敏感性,進而發(fā)生放射抵抗[16-17],放射抵抗細胞有較強的輻射損傷修復(fù)能力,從而導(dǎo)致腫瘤放療效果欠佳。因此,尋找NPC放射抵抗的相關(guān)基因、蛋白質(zhì),揭示NPC的放射抵抗機制,尋找降低放射抵抗性靶點從而提高NPC治療效果具有重要意義。賀玉香等[18]研究發(fā)現(xiàn)鼻咽癌細胞株CNE1和CNE2在射線照射后,Ku70、Ku80和DNA-PKcs的表達水平明顯升高。DNA-PKcs是參與DNA損傷的修復(fù)過程的重要酶類,抑制DNA-PKcs可提高放療敏感性[19]。有研究發(fā)現(xiàn)Zic2依賴的轉(zhuǎn)錄調(diào)控由DNA依賴蛋白激酶(DNA-PK)、多聚ADP核糖聚合酶(poly-ADPribosepolymerase,PARP)、RNA解旋酶A(RHA)介導(dǎo),而DNA-PK 由 Ku70、Ku80以及DNA-PKcs(DNA-PK 的催化亞基)3個亞基組成[20]。本研究通過轉(zhuǎn)染siRNA以抑制CNE2細胞中Zic2的表達,平板克隆實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制Zic2表達后明顯提高CNE2細胞的放射敏感性,放射增敏比為1.483,CCK-8實驗結(jié)果顯示照射2 Gy后,抑制Zic2表達的CNE2細胞的存活率低于陰性對照組細胞,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),說明Zic2可影響鼻咽癌CNE2細胞的放射敏感性。本研究利用大劑量X射線反復(fù)照射CNE2細胞篩選出放射抵抗亞克隆CNE2-R以及予6 Gy劑量的X射線照射CNE2細胞,通過Western blot分析發(fā)現(xiàn)放射抵抗性細胞CNE2-R及經(jīng)照射后24 h的CNE2細胞高表達Zic2,該結(jié)果提示Zic2在放射抵抗細胞生存中及在DNA損傷的修復(fù)過程可能起一定作用。因此可推測鼻咽癌放療后引起DNA損傷導(dǎo)致DNA-PK和PARP活性增強,從而促進了Zic2依賴的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,進一步增強了Zic2相關(guān)的促癌的作用從而產(chǎn)生抵抗電離輻射的損傷。國內(nèi)一項研究通過回顧性分析60例接受放療的宮頸癌患者,結(jié)果發(fā)現(xiàn)HOXA10蛋白的陽性表達與放療后宮頸癌患者差的預(yù)后相關(guān)[21],而已有研究表明HOXA 10通過誘導(dǎo)Zic 2表達促進鼻咽癌細胞增殖和侵襲,因此推測HOXA10-Zic2亦可能是導(dǎo)致鼻咽癌產(chǎn)生放射抵抗的機制。
綜上所述,本研究初步證實了抑制Zic2表達可增強鼻咽癌CNE2細胞的放射敏感性及對順鉑的敏感性,放射抵抗性鼻咽癌細胞株CNE2-R高表達Zic2,這些結(jié)果提示Zic2可能增加鼻咽癌CNE2細胞的放化療抵抗性。Zic2可能是預(yù)測鼻咽癌放化療的內(nèi)在生物標(biāo)志物,為今后制訂鼻咽癌的個體化治療方案提供了實驗依據(jù)。本研究首次驗證了抑制Zic2表達與可增加CNE2細胞的放射和對順鉑敏感性的關(guān)系,但本研究尚未驗證鼻咽癌細胞Zic2表達改變后表達譜的改變,相關(guān)作用機制亦尚未明確,將利用高通量基因芯片和蛋白芯片分析鼻咽癌細胞Zic2表達改變后表達譜變化,篩選出靶分子以研究其下游通路,進一步驗證鑒定靶蛋白的功能。本研究僅局限于細胞實驗,未開展動物實驗及在鼻咽癌組織中分析Zic2表達情況,Zic2與預(yù)后關(guān)系仍未知。本研究將進一步開展動物實驗以及在鼻咽癌組織中、與預(yù)后相關(guān)性進行驗證,為Zic2相關(guān)的鼻咽癌研究提高新的實驗證據(jù)。