萬(wàn)兵 張珊 趙樹娟 王國(guó)芳

牙周膜成纖維細(xì)胞是牙周組織的牙骨質(zhì)再生、骨組織修復(fù)的細(xì)胞基礎(chǔ)。在牙周組織病變恢復(fù)過(guò)程中, 牙周組織形成的主要細(xì)胞是牙周膜成纖維細(xì)胞, 它具有較高的堿性磷酸酶活性和多向分化潛能［1］, 它的活性能夠通過(guò)堿性磷酸酶活性的高低客觀地反映。然而, 在牙周組織病損部位,牙周組織重建及再生達(dá)不到很好的效果, 主要是因?yàn)閿?shù)量和來(lái)源極為有限。本次采用體外細(xì)胞培養(yǎng)法, 研究人牙周膜成纖維細(xì)胞活性受牙齦卟啉菌膜泡影響情況, 及銀杏葉提取物如何阻斷膜泡的生物活性, 為臨床治療牙周病提供了一種實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 ECV提?。?］及細(xì)胞培養(yǎng) 將菌種接種于改良模型(GAM)血液瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng), 對(duì)培養(yǎng)72 h的細(xì)菌培養(yǎng)物, 用超速離心法進(jìn)行離心, 取上清液(含ECV)備用；取臨床上11～15歲因正畸拔除的上頜或下頜雙尖牙, 要求牙周牙體組織健康。拔牙前局部消毒。準(zhǔn)備預(yù)冷細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM)培養(yǎng)液, 拔牙后立即放入同時(shí)送往實(shí)驗(yàn)室。采用胰蛋白酶消化法(按1:3)傳代, 選取第5～7代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)觀察。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 利用生長(zhǎng)良好第6代細(xì)胞, 隨機(jī)分為空白對(duì)照組、膜泡組(50 μg/ml)、銀杏葉組(含GBE濃度分別為 0.1、0.01、0.001 mg/ml)+膜泡 (50 μg/ml), 每組設(shè) 4個(gè)復(fù)孔, 并分別加入上述所需藥物每孔100 μl, 置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。取出細(xì)胞培養(yǎng)板棄去上清液, PBS清洗3次, 每孔加入1 g/LTriton X-100各50 μg, 4℃冷藏過(guò)夜, 在顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

當(dāng)50 μg/ml ECV加入細(xì)胞培養(yǎng)物中, 人牙周膜成纖維細(xì)胞ALP的活性明顯抑制, 與對(duì)照空白組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。當(dāng)加入不同濃度銀杏葉提取物時(shí), 人牙周膜成纖維細(xì)胞ALP的活性明顯增高, 與ECV 組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01), 且隨ALP的活性隨銀杏葉提取物濃度的升高而增高, 具有一定的濃度依賴性, 見表1。

表1 ECV抑制人牙周膜成纖維細(xì)胞活性受銀杏葉提取物的影響(±s, n=4)

表1 ECV抑制人牙周膜成纖維細(xì)胞活性受銀杏葉提取物的影響(±s, n=4)

注：與空白對(duì)照組比較aP<0.05；bP<0.01

藥物分組 OD值((n=4, ±s)空白對(duì)照組 0.29±0.01膜泡組 0.07±0.01a膜泡+0.001 mg/ml GBE 0.16±0.02b膜泡+0.01 mg/ml GBE 0.19±0.02b膜泡+0.1 mg/ml GBE 0.24±0.01b

3 討論

牙周炎是常見的慢性感染性口腔疾病, 主要病原菌是Pg。它是游離入周圍微環(huán)境的一種外膜芽生體［3］, 其胞外膜泡經(jīng)過(guò)細(xì)菌外膜向外膨。不僅透過(guò)細(xì)菌本身不能穿透的解剖屏障, 而且能達(dá)到更深的組織導(dǎo)致破壞, 結(jié)果使牙齒松動(dòng)甚至脫落。治療牙周炎是使病變部位能有一定健康數(shù)量的牙周膜細(xì)胞(PDLCs)從而建立牙周組織的新附著, 是治療牙周炎的前提。PDLCs是牙周膜中最主要細(xì)胞, 具有大量膠原物質(zhì)的分泌和合成的功能, 因此有利于病變的牙周組織的再生,有助于牙周組織的修復(fù), 是牙周炎治療后形成牙齦與牙根面之間新附著的主要細(xì)胞來(lái)源。

本次試驗(yàn)研究顯示: 50 μg/ml ECV加入人牙周膜成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物中, 它的活性明顯受到抑制, 可能通過(guò)抑制牙周膜成纖維細(xì)胞的活性, 泡膜導(dǎo)致PDLCs數(shù)量減少, 進(jìn)而在牙周組織病變修復(fù)過(guò)程中, 能夠阻止成纖維細(xì)胞向成牙骨質(zhì)細(xì)胞或成骨細(xì)胞的分化, 阻礙硬組織與骨性修復(fù)的鈣化, 從而使病變的牙周組織的轉(zhuǎn)歸與修復(fù)受到影響。當(dāng)50 μg/ml ECV和3種銀杏提取物不同濃度分別同時(shí)加入細(xì)胞培養(yǎng)物中后, 細(xì)胞的ALP活性, 說(shuō)明在病變修復(fù)過(guò)程中,銀杏提取物可能通過(guò)阻斷ECV及抑制牙周膜成纖維細(xì)胞ALP的活性, 促進(jìn)牙周膜成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化成骨細(xì)胞, 有利于愈合病變。這一結(jié)果也為牙周病的治療提供一定的參考意義。

［1］李德懿.牙周病微生物學(xué)新探.國(guó)外醫(yī)學(xué)口腔分冊(cè), 1986,3(15): 147-151.

［2］倪龍興, 史俊南, 陳曉玲.成人唾液對(duì)牙齦卟啉菌及其提取物毒理學(xué)作用的影響.中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志, 1997, 17(1):21.

［3］高學(xué)敏.中藥學(xué).北京: 人民衛(wèi)生出版社, 1991: 345-239.