柴麗芬 王艷華 吳琪瑞 王睿 李淑霞 劉林英 石青 吳凱 張慧萍
寧夏醫(yī)科大學(xué)1臨床醫(yī)學(xué)院,2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院(銀川750001);3寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院(銀川750004)
子癇前期(preeclampsia,PE)是一種妊娠期特有疾病,胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡與增殖平衡失調(diào)是PE發(fā)生的關(guān)鍵[1]。研究[2]發(fā)現(xiàn),與正常妊娠的婦女相比,PE患者胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增加,但其機(jī)制不清。同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy),是蛋氨酸代謝過程中的重要產(chǎn)物,通過影響細(xì)胞功能、參與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)以及改變基因表達(dá)活性等多種環(huán)節(jié)參與細(xì)胞凋亡調(diào)控,進(jìn)而誘發(fā)疾病的發(fā)生[3]。另有研究[4]發(fā)現(xiàn),正常妊娠時,血清Hcy濃度降低,而PE患者的血清Hcy濃度較正常孕婦升高,以上提示,在PE發(fā)生的過程中,Hcy可能促進(jìn)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡,但機(jī)制不清。轉(zhuǎn)錄因子EB(transcription factor EB,TFEB)是亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子家族中的成員,以磷酸化狀態(tài)穩(wěn)定于細(xì)胞漿,受到不良刺激后轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核啟動下游基因轉(zhuǎn)錄,從而參與多種病理生理過程,如:調(diào)節(jié)線粒體功能、增強細(xì)胞凋亡、抑制炎癥因子釋放等[5],但其在Hcy引起的滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡中的作用尚不清楚。因此,本研究以人源胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞為研究對象,利用不同濃度Hcy干預(yù)滋養(yǎng)細(xì)胞并過表達(dá)TFEB后,檢測凋亡相關(guān)指標(biāo)的變化,從而探討TFEB在Hcy誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡中的作用。
1.1 材料人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞株(HTR8-S/Vneo)購自上海瑞鹿生物科技有限公司;RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco公司);青鏈霉素、胰蛋白酶消化液(碧云天生物技術(shù)研究所);CCK8試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所);Cell Viability Imaging Kit試劑盒(Roche Applied Science公司)RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR試劑盒(Takara生物公司);蛋白提取試劑盒、蛋白定量試劑盒(南京凱基有限公司);Cleaved-caspase3抗體(ab49822)、Bcl-2抗體(ab692)、TFEB抗體(D207D),羊抗兔或鼠二抗(Abcam公司);引物由上海生工公司合成。
1.2 方法
1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)采用含10%胎牛血清、1%雙抗1640培養(yǎng)基,于37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)滋養(yǎng)細(xì)胞(HTR8-S/Vneo)。
1.2.2 CCK8檢測HTR8-S/Vneo細(xì)胞活力取對數(shù)生長期的HTR8-S/Vneo,制成2×103個/mL的細(xì)胞懸液接種于96孔板中,培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁及生長狀態(tài)良好,換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h后,各組分別加入不同濃度Hcy(0、0.1、0.2、0.5、1、2、2.5、5 mmol/L)孵育48 h,然后,每孔加入10 μL CCK8試劑,放至培養(yǎng)箱共同孵育4 h,取出培養(yǎng)板于酶標(biāo)儀上490 nm測定各孔OD值,通過與正常組比較求出存活率。同時,繪制不同濃度Hcy對HTR8-S/Vneo生長活力的影響曲線圖。
1.2.3 細(xì)胞活力熒光測定使用Cell Viability Imaging Kit試劑盒,檢測前選擇生長狀態(tài)較好的HTR8-S/Vneo細(xì)胞,分為正常組和Hcy組:(1)Hcy組,細(xì)胞經(jīng) 1 mmol/L Hcy處理 48 h;(2)正常組,10%1640培養(yǎng)基培養(yǎng),然后使用細(xì)胞活力熒光測定試劑盒進(jìn)行染色,共聚焦顯微鏡下觀察兩組細(xì)胞活力情況。
1.2.4 qRT-PCR法檢測兩組TFEB mRNA表達(dá)按照總RNA抽提試劑盒說明書抽提總RNA,分析樣品純度及濃度。根據(jù)GeneBank數(shù)據(jù)庫查詢TFEB的基因序列并設(shè)計相應(yīng)引物。TFEB引物,上游:5′-ACCTGTCCGAGACCTATGGG-3′,下游:5′-CGTCCAGACGCATAATGTTGTC-3′,GAPDH 引物,上游:5′-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3′,下游:5′-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3′,按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書加入相應(yīng)試劑反轉(zhuǎn)錄成cDNA,以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR。熒光PCR反應(yīng)條件為:95℃ 預(yù)變性 30 s,95℃變性5 s、57℃退火34 s,擴(kuò)增40個循環(huán)。待反應(yīng)結(jié)束后,分析qRT-PCR原始數(shù)據(jù),用內(nèi)參基因GAPDH校正,結(jié)果用2-△△CT計算。
1.2.5 TFEB腺病毒感染HTR-8/SVneo細(xì)胞委托上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司構(gòu)建TFEB腺病毒過表達(dá)載體,感染前選擇生長狀態(tài)較好的HTR8-S/Vneo進(jìn)行培養(yǎng),吸去舊培養(yǎng)液,PBS洗1遍,加入調(diào)整好滴度的腺病毒液,病毒感染細(xì)胞6 h后,棄掉培養(yǎng)液,加入新含血清培養(yǎng)液,感染48 h后,收集細(xì)胞。
1.2.6 Westernblot檢測Cleaved-caspase3、Bcl-2、TFEB蛋白表達(dá) 收集各組滋養(yǎng)細(xì)胞,提取總蛋白并定量,加入上樣緩沖液煮沸變性。每孔蛋白樣品30 μg,SDS PAGE電泳,轉(zhuǎn)移至孔徑0.22 μm 硝酸纖維素薄膜;含5%脫脂奶粉的PBST室溫封閉2 h;加入一抗(兔抗TFEB,1∶1 000;鼠抗Bcl-2,1∶1 000;兔抗Cleaved-caspase3,1∶1 000;β-actin兔抗,1∶1 000),4℃ 過夜;PBST 洗滌10 min,3次;再加入HRP 標(biāo)記的二抗(1∶5 000),搖床孵育2 h;PBST洗滌10 min,3次;加入ECL顯色底物,凝膠成像分析儀上成像。進(jìn)行目的基因灰度值分析,以β-actin為內(nèi)參對照。
1.3 統(tǒng)計學(xué)方法用Prism 5.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,數(shù)據(jù)結(jié)果以表示,計量資料兩組對比采用t檢驗,多樣本均數(shù)間比較采用One-way ANOVA檢驗,組間的兩兩比較采用Student-Newman-Keuls檢驗,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 Hcy對滋養(yǎng)細(xì)胞存活率的影響不同濃度的Hcy干預(yù)HTR-8/SVneo細(xì)胞48 h后,CCK8法檢測并計算各組細(xì)胞存活率。與正常組比較,Hcy干預(yù)后細(xì)胞存活率降低,在濃度為1 mmol/L時細(xì)胞存活率69.4%,而在2 mmol/L時,細(xì)胞存活率降低至33%(故后續(xù)實驗中均選用1 mmol/L Hcy濃度為實驗組),提示Hcy對滋養(yǎng)細(xì)胞生長有抑制作用。見圖1。
2.2 細(xì)胞活力熒光測定觀察Hcy對滋養(yǎng)細(xì)胞活力的影響1 mmol/L Hcy干預(yù)HTR-8/SVneo細(xì)胞后,細(xì)胞活力熒光測定法檢測細(xì)胞活力(綠色為細(xì)胞有活力,紅色為細(xì)胞無活力,藍(lán)色為細(xì)胞核),結(jié)果發(fā)現(xiàn):正常組細(xì)胞活力正常;Hcy組與正常組比較,紅染細(xì)胞及細(xì)胞碎片明顯增多,細(xì)胞活性顯著降低。見圖2。
圖1 Hcy對HTR-8/SVneo增殖活力的影響Fig.1 Effect of Hcy on proliferation activity of HTR-8/SVneo
2.3 Hcy干預(yù)滋養(yǎng)細(xì)胞后Cleaved-caspase3、Bcl-2的蛋白表達(dá)1 mmol/L Hcy干預(yù)滋養(yǎng)細(xì)胞48 h后,運用Western blot檢測Cleaved-caspase3、Bcl-2的蛋白表達(dá)改變。與正常組比較,Hcy組Cleaved-caspase3蛋白表達(dá)量增高,Bcl-2表達(dá)量降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),結(jié)果提示:Hcy可能促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡。見圖3。
2.4 Hcy干預(yù)滋養(yǎng)細(xì)胞后TFEB的表達(dá)1 mmol/L Hcy干預(yù)滋養(yǎng)細(xì)胞48 h后,采用qRT-PCR及Western blot檢測TFEB的mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示:與正常組比較,Hcy組中TFEB mRNA表達(dá)量降低,TFEB蛋白表達(dá)趨勢與TFEB mRNA表達(dá)趨勢一致,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),提示Hcy抑制了TFEB的表達(dá)。見圖4。
圖2 Hcy干預(yù)HTR-8/SVneo細(xì)胞后細(xì)胞活力的變化Fig.2 Changes of cell viability after Hcy intervention of HTR-8/SVneo cells
2.5 過表達(dá)TFEB并驗證表達(dá)效果為進(jìn)一步探討TFEB在Hcy促滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡中的作用,將TFEB重組包裝的腺病毒感染滋養(yǎng)細(xì)胞,并運用Western blot驗證過表達(dá)效果,結(jié)果呈現(xiàn)出Ad-TFEB組TFEB表達(dá)顯著升高,提示TFEB重組腺病毒感染成功。見圖5。
2.6 過表達(dá)TFEB后檢測滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡的改變HTR-8/SVneo感染TFEB過表達(dá)腺病毒,同時再給予1mmol/L Hcy干預(yù)48 h后,運用Western blot檢測各組細(xì)胞Cleaved-caspase3、Bcl-2蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示,過表達(dá)TFEB后,Cleaved-caspase3蛋白表達(dá)水平降低,Bcl-2升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),提示TFEB抑制Hcy誘導(dǎo)的滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡。見圖6。
胎盤是母體與胎兒間進(jìn)行物質(zhì)交換的器官,其中胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞是妊娠得以建立和維持的基礎(chǔ),占妊娠胎盤的主要部分。已有研究表明胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞功能和形態(tài)異常影響其浸潤、遷移及胎盤的種植[6-8]。PE患者胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡較正常孕婦明顯增加,提示妊娠期間胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡可能是PE的重要致病因素之一[9]。同時,有研究發(fā)現(xiàn),妊娠早期高的Hcy能影響滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖從而影響其侵襲過程[10]。周登詩等研究發(fā)現(xiàn),PE患者的血清Hcy濃度較正常孕婦升高,而在正常妊娠時,血清Hcy濃度是降低的[11-13],這意味著在PE發(fā)生的過程中,較高濃度的同型半胱氨酸可能會導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡,從而影響其浸潤、遷移及胎盤的種植。本研究中Hcy干預(yù)滋養(yǎng)細(xì)胞后發(fā)現(xiàn),細(xì)胞活力及存活率均降低,凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-caspase3明顯升高、Bcl-2降低,與文獻(xiàn)報道一致。細(xì)胞凋亡通路包括死亡受體通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路及線粒體通路,研究表明過高濃度Hcy可通過過度激活細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體應(yīng)激,引起細(xì)胞凋亡[14-15]。其中,在線粒體應(yīng)激途徑中,Hcy誘導(dǎo)線粒體功能障礙,導(dǎo)致caspase依賴的級聯(lián)凋亡反應(yīng)激活,從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡事件發(fā)生。
圖3 Hcy干預(yù)HTR-8/SVneo細(xì)胞后Cleaved-caspase3、Bcl-2的蛋白表達(dá)Fig.3 Protein expression of Cleaved caspase3 and Bcl-2 in HTR-8/SVneo cells after treated with Hcy
圖4 Hcy干預(yù)HTR-8/SVneo細(xì)胞后TFEB的表達(dá)Fig.4 Expression of TFEB in HTR-8/SVneo cells after treated with Hcy
圖5 TFEB腺病毒感染HTR-8/SVneo后Western blot檢測TFEB的蛋白表達(dá)Fig.5 The protein expression of TFEB detected by Western blot after infected with TFEB adenovirus in HTR-8/SVneo
圖6 過表達(dá)TFEB同時Hcy干預(yù)后檢測Cleaved-caspase3、Bcl-2蛋白表達(dá)Fig.6 The protein expression of Cleaved caspase3 and Bcl-2 were detected after over-expressed TFEB and treated with Hcy
近年,研究發(fā)現(xiàn)TFEB這一家族的分子在脊椎動物中結(jié)構(gòu)相似,具有遺傳保守性,序列中都包含有一段可識別的DNA特殊結(jié)合的結(jié)構(gòu)域,與細(xì)胞的發(fā)生和分化密切相關(guān)。并發(fā)現(xiàn),TFEB可在多種類型的細(xì)胞中廣泛表達(dá),正常狀態(tài)下大部分TFEB以無活性的磷酸化形式定位于胞漿,當(dāng)受到負(fù)性應(yīng)激時被激活脫磷酸化轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核,通過識別、啟動下游相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄,參與多種生理病理過程[5,16-17]。LI等[18]發(fā)現(xiàn)檸檬酸克羅米芬(CC),可促進(jìn)TFEB的核易位,增加細(xì)胞的溶酶體生物發(fā)生,抑制細(xì)胞活力,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。在糖尿病足細(xì)胞,帕金森病患者神經(jīng)細(xì)胞等的細(xì)胞凋亡過程中TFEB也均發(fā)生明顯變化,提示TFEB可參與調(diào)控細(xì)胞凋亡,但目前在滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡中是否亦同樣發(fā)生變化,尚無文獻(xiàn)報道[16,19]。本實驗利用Hcy干預(yù)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡模擬PE病理變化,檢測TFEB的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)較高濃度Hcy干預(yù)滋養(yǎng)細(xì)胞可導(dǎo)致其降低,提示TFEB在Hcy誘導(dǎo)的滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡分子機(jī)制中可能起到了重要作用。為了進(jìn)一步探討TFEB在Hcy誘導(dǎo)的滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡過程中的作用,本實驗過表達(dá)TFEB后發(fā)現(xiàn)滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡水平降低,暗示TFEB抑制了Hcy誘導(dǎo)的滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡。同時,在KANG等[20]的研究中發(fā)現(xiàn),過表達(dá)TFEB可以明顯增加抗氧化應(yīng)激蛋白的表達(dá),促進(jìn)線粒體生物合成,維持線粒體穩(wěn)態(tài),從而抑制凋亡的線粒體調(diào)控途徑。
綜上,TFEB在Hcy誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制中可能起到保護(hù)作用,這就提示TFEB可能參與了高Hcy致PE的發(fā)病過程,但機(jī)制不明,是否與其抑制凋亡作用相關(guān)需進(jìn)一步研究。