張 婧 張 易 施春雷

（上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院 中美食品安全聯(lián)合研究中心 上海 200240）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一種具有較強攻擊性的常見人類病原菌，隸屬于葡萄球菌屬，可引起多種醫(yī)院感染和社區(qū)感染性疾病，輕者引起化膿性皮膚感染，嚴(yán)重時甚至導(dǎo)致各種危及生命的并發(fā)癥，如菌血癥和心內(nèi)膜炎[1]。金黃色葡萄球菌在環(huán)境中分布廣泛，對外界不利環(huán)境如干燥、低溫等有較強的抵抗能力，極易通過各種途徑污染食品，會引發(fā)金黃色葡萄球菌食物中毒（S.aureus food poisoning，SFP），對食品安全和人類健康造成重大威脅。當(dāng)金黃色葡萄球菌污染食品后，會在適宜的環(huán)境條件下大量繁殖，與此同時分泌各種毒素或毒力因子，如金黃色葡萄球菌腸毒素（Staphylococcal enterotoxins，SE），大大增加了其侵襲性和致病力。消費者食用了被金黃色葡萄球菌污染的食品后便會引起SFP[2]，主要的中毒癥狀為腹瀉、惡心、嘔吐等，中毒嚴(yán)重者還會出現(xiàn)胃腸痙攣，體內(nèi)水平衡失調(diào)甚至虛脫，脫水等癥狀[3]。根據(jù)美國疾病預(yù)防控制中心的研究報道[4]，每年在美國由金黃色葡萄球菌導(dǎo)致的食物中毒約有24萬人次，其中1 000多人需要住院治療并約10人因此死亡，由該菌引起的食物中毒占整個細(xì)菌性食物中毒的33%；在加拿大，這個比例高達(dá)45%[5]。我國每年也會發(fā)生多起該類食品安全事件，給醫(yī)療衛(wèi)生造成巨大壓力。

據(jù)報道，由5種傳統(tǒng)腸毒素SEA～SEE引起的金黃色葡萄球菌食物中毒占比高達(dá)95%[6]。來自許多不同國家和地區(qū)的研究顯示，SEA是引起金黃色葡萄球菌食物中毒事件的最主要的腸毒素[7]。不同的金黃色葡萄球菌菌株會分泌不同類型的腸毒素，即使分泌同一種腸毒素，其產(chǎn)生量往往也會因生長環(huán)境不同而有差異[8]。鑒于腸毒素的多樣性和多變性，以及其產(chǎn)生的普遍性，由腸毒素導(dǎo)致的金黃色葡萄球菌食物中毒在治療和防御上都有很大難度，因此一直以來都是食源性污染監(jiān)測的重點對象。本研究對比不同菌株、不同腸毒素基因的攜帶及其表達(dá)情況，有助于進(jìn)一步分析腸毒素表達(dá)的環(huán)境條件，加強產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌的防范和控制，同時可為食品安全監(jiān)控和風(fēng)險評估提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株

1）金黃色葡萄球菌食源性分離株：33株金黃色葡萄球菌食源性分離株，分離自2014年9月至2015年5月采集的上海市市售食品樣品。分離和鑒定方法按照 《金黃色葡萄球菌檢驗方法》（GB4789.10-2010）第一法對采集的樣品中污染的金黃色葡萄球菌進(jìn)行選擇性分離，對疑似菌株用PCR技術(shù)擴增nuc1基因?qū)ζ渥鲞M(jìn)一步鑒定[9]。

2）腸毒素陽性對照菌株：ATCC8095（攜帶sea、sed基因）；ATCC14458（攜帶seb基因）；ATCC27664（攜帶see基因）；I073（攜帶sec基因），均為本實驗室保藏。

1.1.2 主要設(shè)備與儀器 Mastercycler型全自動PCR擴增儀、5810 R型高速微量臺式離心機、Thermomixer comfort型恒溫混勻器，德國Eppendorf；EPS 2A 200型電泳儀，美國Harvard Hoefer；GIS2020型紫外凝膠成像系統(tǒng)，上海天能；ES-315型滅菌鍋，日本TOMY；Mili-Q超純水系統(tǒng)，美國Mili-Q；HZ-8211K型恒溫?fù)u床，太倉科教儀器；HPP 260型恒溫培養(yǎng)箱，德國Memmert；CA-1480-2型垂直層流潔凈工作臺，上海上凈；Forma 900 Series型-80℃超低溫冰箱，美國Thermo Fisher。

1.1.3 主要試劑

1）TE 緩沖液：10mmol/L Tris-Cl（pH 8.0）；1 mmol/L EDTA（pH 8.0）；121℃滅菌15min，4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

2）引物（上海生工）開蓋前先12 000 r/min離心30 s，按使用說明加入一定量的TE緩沖液溶解，使其終濃度為100mmol/L，-20℃保存?zhèn)溆?，使用時以無菌純水稀釋10倍至終濃度10mmol/L。

3）混合溶菌酶溶液：用TE緩沖溶液溶解溶菌酶（Lysozyme，美國Sigma 62970）和溶葡萄球菌酶（Lysostaphin，美國Sigma L7386），配制成質(zhì)量濃度為20mg/mL溶菌酶、5mg/mL溶葡球菌酶的混合酶溶液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4）TIAN amp細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（上海天根）。

5） Taq DNA 聚合酶、dNTP、PCR buffer（大連寶生物）。

6）3MTMTecraTM微孔板法葡萄球菌腸毒素ID快速檢測試劑盒（3M中國有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的活化 從-80℃超低溫冰箱中取出金黃色葡萄球菌食源性分離株和腸毒素陽性標(biāo)準(zhǔn)菌株的甘油保藏管，在超凈臺內(nèi)用移液槍吸取10 μL金黃色葡萄球菌甘油保藏液接種到TSB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)過夜后，在超凈臺內(nèi)用金黃色葡萄球菌菌液劃平板，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～14 h，長出單菌落的平板放入4℃冰箱，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 基因組DNA的提取 從TSB平板上挑取單菌落至TSB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)過夜后，按照DNA提取試劑盒的說明，提取金黃色葡萄球菌食源性分離株和標(biāo)準(zhǔn)菌株的基因組DNA。

1.2.3 金黃色葡萄球菌腸毒素基因的PCR篩查 根據(jù)已有的文獻(xiàn)報道和檢索GenBank數(shù)據(jù)庫，設(shè)計合成了5種金黃色葡萄球菌腸毒素基因的引物序列，具體見表1。

表1 金黃色葡萄球菌5種腸毒素基因引物序列及其產(chǎn)物大小Table1 Primer sequences and fragment size of products of 5 enterotoxin genes

以提取的基因組DNA作為模板，PCR擴增5種金黃色葡萄球菌腸毒素基因，按比例配制反應(yīng)體系：10× buffer 2.5μL，MgCl2溶液（25mmol/L）1.5 μL，dNTPs（各 2.5 mmol/L）1 μL，上下游引物（10 μmol/L）0.5 μL＋0.5 μL，Taq DNA 聚合酶（1 U/μL）0.5 μL，DNA 模板 2.0 μL，無菌水 16.5 μL。擴增條件：95℃預(yù)變性 5min，95℃變性 30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10min。

吸取5μL PCR擴增產(chǎn)物，與1μL 10×Loading Buffer混勻后，將100 bp DNA Ladder和樣品點樣于1.5%瓊脂糖凝膠（內(nèi)含萬分之一核酸染料DuRed），電壓 120 V，電泳時間 45min，電泳結(jié)束后使用紫外凝膠成像系統(tǒng)成像并觀察結(jié)果。

1.2.4 金黃色葡萄球菌腸毒素表達(dá)的篩查 本研究使用3MTMTecraTM微孔板法葡萄球菌腸毒素ID快速檢測試劑盒進(jìn)行腸毒素表達(dá)的篩查，大致試驗步驟如下。

1）樣品液的制備：5mL過夜培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌菌液加10mL Tris緩沖液，充分混合。3 000 r/min離心10min。用注射器過濾裝置過濾菌液后，調(diào)節(jié)pH值至7～8。取1mL過濾液與50 μL樣品添加液，充分混合備用。

為對比環(huán)境條件對腸毒素表達(dá)的影響，本研究中分別使用了TSB培養(yǎng)液和食品基質(zhì)（牛奶）培養(yǎng)得到金黃色葡萄球菌菌液進(jìn)行相關(guān)檢測。

2）參考試劑盒說明書配制試劑，包括洗液（Wash solution）、結(jié)合物（Conjugate）、底物（Substrate）、終止液和樣品添加劑（Stop solution，Sample additive）、陽性毒素對照液（Positive control）及陰性食品對照（Negative control）的準(zhǔn)備。

圖1 5種金黃色葡萄球菌腸毒素基因的凝膠電泳圖Fig.1 Electrophoresis of 5 S.aureus enterotoxin genes

3）參考試劑盒說明書進(jìn)行孔板試劑盒的操作，確保使用前試劑盒內(nèi)所有試劑處于室溫（20～25℃）。

4）判讀結(jié)果：結(jié)果可用比色卡直接肉眼判讀。使用比色卡注意陽性對照必須至少達(dá)到比色卡4號顏色，并且陰性對照顏色必須淺于比色卡2號顏色，此時試驗結(jié)果有效。

微孔變色說明存在腸毒素，攜帶腸毒素基因的菌株能夠有效表達(dá)。

2 結(jié)果與分析

2.1 金黃色葡萄球菌腸毒素基因攜帶情況

攜帶這5種腸毒素基因的金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的電泳圖如圖1所示。

使用表1所示的5種金黃色葡萄球菌腸毒素基因的引物，對33株食源性分離株進(jìn)行毒力基因篩查，得到了這些分離株中5種傳統(tǒng)腸毒素基因的攜帶率，具體結(jié)果見圖2。5種腸毒素基因中檢出率最高的基因是seb，總攜帶率為48.48%（16/33），攜帶率最低的腸毒素是see，僅為9.09%（3/33）。其它3種腸毒素基因的攜帶率依次為是sec 30.30%（10/33）、sea 27.27%（9/33）和sed 15.15%（5/33）。

33株分離株中，腸毒素基因的檢出率為100%，即每株分離株至少攜帶一種腸毒素基因，且有2株分離株（SJTUF21507、21509）同時攜帶有3種腸毒素基因，而有6株分離株同時攜帶有2種腸毒素基因。

圖2 5種腸毒素基因在33株食源性分離株中的攜帶率Fig.2 Carrying rate of 5 enterotoxin genes in 33 foodborne S.aureus isolates

2.2 金黃色葡萄球菌腸毒素分泌情況

通過3MTMTecraTM微孔板法檢測，有21株分離株出現(xiàn)腸毒素陽性結(jié)果，即腸毒素基因得到了有效表達(dá)，其具體試驗結(jié)果見圖3。在本試驗中，經(jīng)TSB培養(yǎng)基或食品基質(zhì)（牛奶）培養(yǎng)后的金黃色葡萄球菌，其中5種腸毒素的表達(dá)情況一致。

圖3 33株食源性分離株中5種腸毒素基因的攜帶和表達(dá)Fig.3 The carrying and expression of 5 enterotoxin genes in 33 foodborne S.aureus isolates

3 討論

SE是由金黃色葡萄球菌所產(chǎn)生的一類典型的超抗原組成，它的N端肽鏈具有催吐活性，可引起人嘔吐，是導(dǎo)致SFP的罪魁禍?zhǔn)譡14]。SE引起的食物中毒占整個細(xì)菌性食物中毒的首位，而其中，傳統(tǒng)腸毒素SEA～SEE是引起該類食物中毒最主要的因素，其表達(dá)與否，直接影響著菌株的致病性。SE蛋白具有顯著的耐熱性和耐酸性。一旦食物受到SE污染，常規(guī)的烹煮甚至高溫處理并不能使其完全變性失活，而仍然保有超抗原活性，繼而引起嘔吐和胃腸炎等食物中毒癥狀。此外，SE蛋白耐胃腸蛋白酶滅活，包括胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和凝乳酶[15]，因此可以很容易進(jìn)入人體腸道中產(chǎn)生毒素。

在本試驗中，PCR對5種傳統(tǒng)腸毒素基因的篩查結(jié)果顯示，腸毒素基因的檢出率高達(dá)100%，證明其存在具有普遍性。其中，seb和sec的攜帶率較高，都超過30%，最低see的攜帶率不超過10%。值得一提的是，雖然33株食源性分離株均攜帶至少一種腸毒素基因，但是在3MTMTecraTM微孔板法檢測的結(jié)果中，只有63.64%（21/33）的菌株腸毒素檢測結(jié)果呈陽性，即有腸毒素表達(dá)。雖然有數(shù)據(jù)表示，不同的培養(yǎng)基質(zhì)對SEs的產(chǎn)生也有一定影響，例如2013年Valihrach等[16]的研究證明，所有受測菌株在牛奶中產(chǎn)生的SEC均少于在微生物肉湯中的量。而本試驗僅定性地證明了受測的33株食源性分離菌在TSB和牛奶中的SE產(chǎn)生情況一致，但產(chǎn)生的數(shù)量是否一致，還需要進(jìn)一步檢測。

SE基因在金黃色葡萄球菌中的表達(dá)由多個調(diào)控元件（例如：agr、arlRS和saeRS）和DNA 結(jié)合蛋白（例如：sarA家族和sigB因子）協(xié)調(diào)[17]。此外，pH值、溫度、氧氣、碳源、鹽、金屬離子和短肽等環(huán)境信號可能對毒力基因的轉(zhuǎn)錄有影響[18]。SE產(chǎn)生的環(huán)境整體范圍較廣，在溫度10～45℃，pH 4.5～9.6，水分活度Aw 0.85～0.99 以上，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)介于0～10%的條件下均可產(chǎn)生[19]。含淀粉、蛋白質(zhì)和水分較多的食品，如牛乳及乳制品、肉和蛋等，都可以為其產(chǎn)生提供適宜的食品基質(zhì)。不同SE的產(chǎn)生也存在一定規(guī)律性和差異性。例如，SEA產(chǎn)生的pH范圍較廣，一般要求大于4.5，Aw＞0.86，這也是SEA在過去報道中，引起金黃色葡萄球菌食物中毒最多的主要原因。相比之下，SEB和SEC產(chǎn)生的pH范圍較窄，均為中性，且只有在Aw＞0.96且溫度適宜的情況下，SEB才能分泌產(chǎn)生[3]。綜合而言，SE產(chǎn)生的最適溫度為37℃，當(dāng)存放在20℃以上時，溫度越高，產(chǎn)生腸毒素時間越短；在通風(fēng)不良，氧氣壓較低的時候，更容易形成SE[20-21]。所以，即使攜帶了SE基因，也不一定能夠得到表達(dá)產(chǎn)生SE蛋白，這與本試驗的結(jié)果相一致。

一般來說，SE引起食物中毒所需的劑量極少，有研究表明[15]，SEA的最低催吐劑量可達(dá)0.5 ng/mL。目前，一般的監(jiān)管規(guī)定只要求對日常食品中是否存在5種傳統(tǒng)腸毒素SEA～SEE進(jìn)行檢測，這也是5種腸毒素與食物中毒關(guān)系研究較多的原因。然而，截至目前，共有22種SE基因被發(fā)現(xiàn)，分別是sea～see、seg～sev、sey[22]。且據(jù)已有報道顯示，在不少引起SFP的分離菌株中，只攜帶某些新型SE。這也就意味著，未來對SFP的預(yù)防和治療過程中，也需要關(guān)注新型SE。

4 結(jié)論

金黃色葡萄球菌攜帶SE基因并不一定就會表達(dá)產(chǎn)生相應(yīng)的SE蛋白，還需要多系統(tǒng)的協(xié)調(diào)及適宜的環(huán)境條件。在未來研究中，可以加強對SE產(chǎn)生與環(huán)境因素之間關(guān)系的探究，從而通過調(diào)節(jié)環(huán)境因素來抑制金黃色葡萄球菌增殖，及其腸毒素分泌提供更多數(shù)據(jù)支持。