歐揚雯珊 劉松玲 劉治麟 陳巧燕 夏兵兵 趙 亮，*

（1 教育部功能乳品重點實驗室 中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院 北京 100083

2 北京市高等學校畜產(chǎn)品工程技術(shù)研究中心 北京 100083

3 北京和益源生物技術(shù)有限公司 北京 100088

4 深圳市晨光乳業(yè)有限公司 廣東深圳 518107）

雙歧桿菌（Bifidobacterium）是一類安全有效的益生菌，然而其環(huán)境耐受與營養(yǎng)供應問題一直影響著它的有效利用。雙歧桿菌定植能力弱[1-3]，其豐度受腸道內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)含量、種類的制約[4]。特定糖類則可促進雙歧桿菌生長[4]，幫助其定植。

寡糖（亦稱為低聚糖）是指由3～10個單糖組成的糖類[5]。根據(jù)生理功能，寡糖可分為消化性寡糖與無法被人體利用的非消化性寡糖[5-7]，后者可被雙歧桿菌代謝利用[8-11]，因此膳食會影響腸道微環(huán)境[12]。不同菌株對糖的利用范圍、種類、方式存在特異性[13]，如嬰兒雙歧桿菌主要利用母乳寡糖[14]、兩歧雙歧桿菌主要利用 mucin寡糖[15]。Vulevic等[9-10]發(fā)現(xiàn)低聚半乳糖可提高老年人與肥胖成人腸道中雙歧桿菌含量，分別提升IL-10水平與降低總膽固醇含量；Lewis等[11]發(fā)現(xiàn)喂養(yǎng)含巖藻糖基化寡糖母乳的嬰兒，腸道中雙歧桿菌豐度顯著高于對照組。

不同于多數(shù)嬰兒來源的雙歧桿菌，來自中國廣西巴馬長壽老人腸道的BBMN68（Bifidobacterium longum subsp.longum BBMN68）對寡糖的利用具有特異性[15-17]。該菌株具有增強免疫[18]，緩解過敏[19]，改善便秘[20]的功能。生物信息學技術(shù)從基因?qū)用娼沂玖司陮Νh(huán)境的適應特性，是研發(fā)菌株營養(yǎng)利用的有效手段[15-16]。本研究旨在通過生物信息學技術(shù)預測BBMN68糖苷水解酶及碳水化合物轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，獲得潛在可利用寡糖，對開發(fā)利用特有BBMN68益生元具有重要意義。

1 材料與試劑

1.1 試驗菌株

B.longum subsp.longum BBMN68（CGMCC No.2265；GenBank assembly accession GCA_000166315.1）分離自廣西巴馬長壽老人糞便，由教育部功能乳品重點實驗室保藏。

1.2 主要儀器（表1）

表1 主要儀器與設備Table1 Main instruments and equipment

1.3 主要試劑及配制

1.3.1 菌株培養(yǎng) 碳源：低聚甘露糖、低聚木糖、低聚半乳糖、低聚異麥芽糖、低聚麥芽糖、低聚果糖、葡萄糖。

半合成培養(yǎng)基[21]：細菌蛋白胨10 g/L；酵母浸粉5 g/L；磷酸氫二鉀 2 g/L；乙酸鈉 5 g/L；檸檬酸氫二胺 2 g/L；MnSO4·4H2O 0.25 g/L；MgSO4·7H2O0.58 g/L；Tween-80 1 g/L；Cys-HCl 0.5 g/L。

1.3.2 定量PCR細菌RNAout試劑盒，天恩澤公司；cDNA第一鏈合成試劑盒、SYBR Green I Real-time PCR Master Mix，日本TAKARA公司。

2 試驗方法

2.1 BBMN68寡糖相關基因功能預測

2.1.1 糖苷水解酶分析 使用CAZy數(shù)據(jù)庫（http：//www.cazy.org）比對分析BBMN68基因組，獲取糖苷水解酶編碼基因。利用PSORTb數(shù)據(jù)庫（http：//www.psort.org/psortb/）定位上述基因編碼的糖苷水解酶在細胞中的位置。通過EC數(shù)據(jù)庫（http：//www.ebi.ac.uk/）對 BBMN68 中糖苷水解酶進行編碼歸類。

2.1.2 寡糖轉(zhuǎn)運子分析 獲取BBMN68基因組中所有COG（G）蛋白，使用 TCDB 數(shù)據(jù)（http：//www.tcdb.org/）庫BLAST功能，對所有蛋白進行檢索分析。根據(jù)TCDB數(shù)據(jù)庫分類信息：分類號3.A.1.1及3.A.1.2為碳水化合物ABC轉(zhuǎn)運子；2.A.1.X為MFS轉(zhuǎn)運子；8.A.7及8.A.8為PTS轉(zhuǎn)運系統(tǒng)[22]。

2.2 功能驗證

2.2.1 生長試驗驗證 按照2%接種量，將BBMN68接種于含不同寡糖的半合成培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)12 h，測定OD600條件下的吸光值。

2.2.2 定量PCR 總RNA的提取及cDNA合成：使用TIANDZ細菌RNAout試劑盒提取對數(shù)期長雙歧桿菌BBMN68的總RNA。收集5～8mL新鮮菌液于離心管中，4℃，12 000×g離心1min，棄盡上清；加入1mL細菌RNAout并用槍充分吹打，確保細菌充分裂解，沒有塊狀物；加入0.2mL氯仿，充分振蕩混勻，以打斷DNA并去除蛋白質(zhì)；4℃，12 000×g離心3min，吸取無色上清液（注意不要吸取中間層的蛋白質(zhì)）于新的離心管中，并加入等體積異丙醇，輕輕顛倒混勻；4℃，12 000×g離心10min，吸棄上清；加入75%乙醇，充分振蕩混勻，4℃，12 000×g離心 3min，吸棄上清；加入 50μL的0.1%DEPC水沉淀溶解。將RNA用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗所提取RNA的完整度及純度。使用cDNA第一鏈合成試劑盒，作為后續(xù)實時熒光定量PCR的模板。

引物的設計、合成與實時熒光定量PCR：利用NCBI數(shù)據(jù)庫中PRIMER BLAST在線引物設計軟件設計引物，并對選自文獻中的引物進行比對驗證。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成（表3）。PCR 反應體系 25μL：cDNA 模板 1μL，上下游引物各 1 μL，SYBR Green I Real-time PCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。反應條件：95℃預變性10 s，95℃變性5 s，61℃退火延伸31 s，45個循環(huán)。相對表達量計算公式：相對表達量=2[（CT目的基因-CT內(nèi)參基因）對照組-（CT目的基因-CT內(nèi)參基因）處理組]。在以葡萄糖為唯一碳源的半合成培養(yǎng)基中BBMN68基因表達量作為對照組，在以其它寡糖為唯一碳源的半合成培養(yǎng)基中其基因表達量為處理組。CT目的基因指BBMN68中糖苷水解酶基因拷貝數(shù)，CT內(nèi)參基因指 BBMN68 16S rRNA拷貝數(shù)。每個目標基因進行3個生物重復。

表2 RT-PCR引物Table2 The primer of RT-PCR

3 結(jié)果與分析

3.1 BBMN68寡糖相關基因功能預測

3.1.1 糖苷水解酶預測 CAZy數(shù)據(jù)庫顯示BBMN68基因組中含有58個編碼糖苷水解酶的基因。通過PSORTb數(shù)據(jù)庫進一步對58個編碼蛋白進行亞細胞定位，發(fā)現(xiàn)其中有16個蛋白位于胞外，占總數(shù)的28%。全部糖苷水解酶可歸納為24個蛋白家族，其中 GH13家族數(shù)量最多（13），GH43家族其次（9），且GH43家族糖苷水解酶均位于胞外或錨定于細胞壁。

結(jié)果顯示，BBMN68主要以細胞壁多糖及淀粉為底物。以植物細胞壁為底物的糖苷水解酶數(shù)目最多，包括26個編碼基因，其中12個位于胞外或細胞壁；其次是以淀粉為底物的糖苷水解酶，包括15個編碼基因，全部屬于胞內(nèi)酶。

EC數(shù)據(jù)庫顯示，33個糖苷水解酶可注釋EC編碼，共編碼14種酶。水解獲得的單糖產(chǎn)物包括半乳糖、葡萄糖、N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰半乳糖胺、果糖、甘露糖、阿拉伯糖和木糖。

表3 BBMN68糖苷水解酶Table3 Glycoside hydrolyses of BBMN68

（續(xù)表3）

3.1.2 寡糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)預測 與糖苷水解酶不同，多數(shù)寡糖的轉(zhuǎn)運蛋白為膜蛋白，限制了該類蛋白的深入研究。目前，學者主要通過蛋白質(zhì)組學[23]、轉(zhuǎn)錄組學[24]和糖組學[25]，開展對雙歧桿菌寡糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)底物的研究。TCDB數(shù)據(jù)庫顯示BBMN68寡糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)主要包括ABC（ATP binding cassette）轉(zhuǎn)運系統(tǒng)和PEP-PTS（Phosphoenolpyruvate-phosphotransferase）轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，以及MFS（Major facilitator superfamily）系統(tǒng)及少量的MIP（Major intrinsic protein）[26]系統(tǒng)。

表4 BBMN68碳水化合物轉(zhuǎn)運子Table4 Carbohydrate transporters in BBMN68

（續(xù)表4）

TCDB數(shù)據(jù)庫顯示，BBMN68基因組共編碼57個碳水化合物轉(zhuǎn)運子基因（表5），包括ABC轉(zhuǎn)運子41個，MFS轉(zhuǎn)運基因11個，PTS轉(zhuǎn)運系統(tǒng)基因3個和MIP基因2個，介于已報道的雙歧桿菌碳水化合物轉(zhuǎn)運基因數(shù)目（21～68）[24]。通常雙歧桿菌MFS基因數(shù)目在1～6個之間，而BBMN68具有11個MFS基因。

BBMN68中ABC轉(zhuǎn)運子基因多位于基因簇內(nèi)，其中，36個基因分布于11個基因簇中，僅5個基因單獨存在。通常，每個基因簇包括1～3個糖特異性連接蛋白，1～2個通透酶和1～2個ATP酶。結(jié)果顯示，BBMN68_925-BBMN68_927編碼3個糖連接蛋白，BBMN68_933-BBMN68_934編碼2個連續(xù)的通透酶。不同于已有文獻，11個ABC轉(zhuǎn)運子基因簇中僅有2個基因簇（BBMN68_73-BBMN68_78 與 BBMN68_1723-BBMN68_1730）包含ATP連接蛋白基因。而BBMN68基因組中發(fā)現(xiàn)一個單獨存在的ATP連接蛋白（BBMN68_1403），該蛋白氨基酸序列與已報道的BL0673相似度大于60%。該蛋白在B.longum NCC2705與Streptomycescoelicolor A3中的注釋信息為ABC轉(zhuǎn)運子通用ATP酶，該酶可被其它缺少ATP酶的ABC轉(zhuǎn)運子共用[27]，因此 BBMN68_1403可能作為BBMN68 ABC轉(zhuǎn)運子的通用ATP酶。該現(xiàn)象可幫助有限的基因發(fā)揮最大的作用，體現(xiàn)了BBMN68的遺傳優(yōu)勢。此外，ABC轉(zhuǎn)運子基因簇常與糖苷水解酶基因及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子基因毗鄰，表明轉(zhuǎn)錄子的特異性可能與糖苷水解酶的特異性相關，基因簇的表達可能受底物水平的調(diào)控。

圖1 碳水化合物轉(zhuǎn)運子基因簇Fig.1 Gene clusters of carbohydrate transporters

3.2 BBMN68寡糖相關基因功能驗證

3.2.1 生長試驗驗證 生長試驗結(jié)果顯示BBMN68對不同來源的寡糖具備利用能力。BBMN68在植物細胞壁來源的低聚半乳糖、低聚木糖培養(yǎng)基中生長良好。菌株在淀粉不完全降解寡糖產(chǎn)物——低聚異麥芽糖和低聚麥芽糖中亦可良好生長，而在未降解的淀粉中不生長（數(shù)據(jù)未顯示）。結(jié)果顯示BBMN68可在低聚果糖中生長，無法在動物來源的低聚甘露糖中生長。

3.2.2 碳水化合物轉(zhuǎn)運基因的驗證 RT-PCR結(jié)果顯示，在寡糖半合成培養(yǎng)基中，碳水化合物轉(zhuǎn)運子基因mRNA水平表達量發(fā)生了不同程度的變化，存在以下特點：（1）不同基因?qū)烟堑姆磻煌鏐BMN68_925，BBMN68_1022，BBMN68_1724基因?qū)υ囼灥孜锏姆磻^低，表明試驗所用寡糖可能并非其真正底物，或者上述基因?qū)儆诮M成型表達。（2）單糖組成相似，碳鏈長度不同的底物誘導表達的基因相似，如低聚果糖、果糖和蔗糖（數(shù)據(jù)未顯示）均可誘導BBMN68_74，BBMN68_75表達。（3）同種底物可誘導多個轉(zhuǎn)運子基因表達，例如：低聚麥芽糖可誘導BBMN68_1170，BBMN68_1422，BBMN68_1024，BBMN68_1169，BBMN68_1170，BBMN68_1422，BBMN68_1427，BBMN68_1597，BBMN68_1671基因表達。

表5 BBMN68預測寡糖底物中的生長情況Table5 Growth profile of BBMN68 in predicted oligosaccharide substrates

圖2 轉(zhuǎn)運子基因在預測寡糖底物中的表達變化Fig.2 Relative transcription levels of carbohydrate transporter-encoding genes from BBMN68 upon cultivation in MRS medium supplemented with various oligosaccharides

4 討論

本文預測并驗證了BBMN68對多種寡糖的影響，發(fā)現(xiàn)BBMN68具有轉(zhuǎn)運和降解低聚木糖、低聚半乳糖、低聚異麥芽糖、低聚麥芽糖、低聚果糖的酶系統(tǒng)，可有效利用上述寡糖。

研究顯示，BBMN68不能利用動物來源的低聚甘露糖，推測原因：（1）該菌株可能缺少特異性的甘露糖轉(zhuǎn)運子；（2）該菌株可能缺少利用甘露糖的基因。低聚甘露糖糖苷水解酶將低聚甘露糖水解成甘露糖單體，提供給其它腸道微生物，實現(xiàn)共生。

BBMN68糖類酶系明顯異于其它雙歧桿菌。BBMN68中26%（16/58）的糖苷水解酶位于胞外，比例顯著高于多數(shù)雙歧桿菌。其中，有12個胞外糖苷水解酶的預測底物為植物細胞壁多糖。結(jié)果顯示BBMN68可在常見植物細胞壁多糖降解寡糖產(chǎn)物中生長，卻無法在未降解的多糖中生長（數(shù)據(jù)未顯示）。推測原因：植物細胞壁多糖水解酶僅有外切活性，而植物細胞壁多糖結(jié)構(gòu)復雜，需多種糖苷水解酶共同降解。如B.longum B667中GH51家族的糖苷水解酶AbfB，僅可內(nèi)切阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖等多糖，推測AbfB與其它腸道共生菌群分泌的糖苷水解酶，共同實現(xiàn)對多糖的降解[28]。研究發(fā)現(xiàn)，將長雙歧桿菌與擬桿菌共同定植于無菌小鼠腸道后，擬桿菌細胞壁多糖降解基因表達量顯著高于擬桿菌單獨定植時，表明雙歧桿菌對擬桿菌的多糖代謝過程有促進作用[29]。胞外植物細胞壁多糖降解基因幫助BBMN68實現(xiàn)與其它腸道微生物的和諧共生。

本文發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌優(yōu)勢底物——淀粉，無法被BBMN68利用。BBMN68不具備胞外淀粉酶，無法降解淀粉，僅能利用糊精等淀粉部分降解產(chǎn)物，該特點與BBMN68的特殊來源相關。廣西巴馬長壽人群的飲食以未經(jīng)深加工的玉米及蔬菜為主，玉米是抗性淀粉的主要來源。攝入玉米后，小腸及糞便中可檢測到較高含量的糊精[30]。宿主為BBMN68提供足量的糊精，以保證其在腸道中穩(wěn)定的生態(tài)位。長壽老人腸道中含有大量擬桿菌，可降解膳食纖維，為BBMN68提供除淀粉以外的纖維寡糖，保證BBMN68在腸道中的定植生長。

受限于寡糖組成結(jié)構(gòu)的多樣性和糖苷水解酶的特異性兩點因素，本研究尚不能對全部寡糖進行精準預測。本文僅選取部分代表性寡糖，證明了寡糖代謝對BBMN68生態(tài)適應的重要性，對開發(fā)菌株特異性寡糖有重要意義。