張念平 劉浩 龍大宏

(1山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250011；2廣州醫(yī)科大學(xué)；3濟(jì)南市第三人民醫(yī)院)

核糖核酸(RNA)，是廣泛存在于生物體內(nèi)的重要遺傳信息載體。其中，能翻譯成蛋白質(zhì)的RNA分子稱為編碼RNA，也稱信使RNA(mRNA)，不能翻譯成蛋白質(zhì)的RNA分子稱非編碼RNA(ncRNA)。微小RNA(miRNA)是ncRNA的一種，于1993年首次在線蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)〔1〕。隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)microRNA在基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控方面發(fā)揮重要作用，它廣泛參與細(xì)胞間信號傳導(dǎo)及參與細(xì)胞代謝、生長、增殖、分化、凋亡等多方面的生物進(jìn)程。當(dāng)microRNA調(diào)控功能發(fā)生障礙，可能導(dǎo)致一些基因的異常表達(dá)〔2〕。

干細(xì)胞是一類具有自我更新能力和分化潛能的細(xì)胞，在一定條件下，它可以分化成多種功能的細(xì)胞。干細(xì)胞對重建或修復(fù)衰老病變的組織器官方面有著巨大的潛力，細(xì)胞替代治療已成為當(dāng)代醫(yī)學(xué)研究熱點(diǎn)之一。然而，干細(xì)胞的分化過程十分復(fù)雜，受多種誘導(dǎo)因子和細(xì)胞信號通路的調(diào)控，具體分化機(jī)制仍然不清楚。在干細(xì)胞分化過程中細(xì)胞多種miroRNA含量有著劇烈的變化，其含量或上調(diào)或下調(diào)〔3,4〕。另外有研究發(fā)現(xiàn)，人為干預(yù)microRNA的表達(dá)也能顯著影響干細(xì)胞的分化。這提示干細(xì)胞的分化過程受microRNA的調(diào)控〔5,6〕。本文就microRNA對干細(xì)胞的調(diào)控作用進(jìn)行綜述。

1 microRNA的命名規(guī)則

microRNA數(shù)量眾多，為了便于閱讀文獻(xiàn)，有必要在此簡單介紹microRNA的命名規(guī)則。除了最早發(fā)現(xiàn)的let-7和lin-4以外，其他成熟microRNA現(xiàn)在都用“miR-#”來表示，而相對應(yīng)的編碼基因則用“mir-#”或“MIR-#”表示〔7〕。#代表數(shù)字，表示microRNA發(fā)現(xiàn)的先后順序。一般在mir-#前面加三個字母的前綴來區(qū)分物種來源，然而有些文獻(xiàn)描述microRNA時也常常忽略此前綴。如：hsa(Homo sapiens)表示人類，mmu(Mus musculus)表示小鼠，hsa-miR-101，代表人miR-101。高度同源的microRNA在命名時常于數(shù)字后面加一個小寫英文字母進(jìn)行區(qū)分，例如mmu-miR-10a和mmu-miR-10b。位于不同位點(diǎn)而編碼相同的microRNA基因，在后面加一個數(shù)字后綴進(jìn)行區(qū)分，例如hsa-miR-521-1和hsa-miR-521-2。如果從同一個前體的2個臂分別加工產(chǎn)生microRNA，一般根據(jù)克隆試驗(yàn)已知相對表達(dá)量，以“*”號表示表達(dá)量相對較低的microRNA，比如hsa-miR-520d和hsa-miR-520d*。當(dāng)不能區(qū)分表達(dá)量多少時，則采用后綴標(biāo)注其起源的發(fā)夾臂端，例如mmu-miR-292-3p表示起源于發(fā)夾結(jié)構(gòu)的3′端，而mmu-miR-292-5p代表來源于5′端〔8〕。

2 microRNA的特征

microRNA是一類內(nèi)源性非編碼單鏈RNA分子，在真核生物中廣泛存在，其本身不具有開放閱讀框，一般不能編碼蛋白質(zhì)。microRNA通常的長度一般為22個核苷酸左右，但在3' 端因有poly A 尾的結(jié)構(gòu)，因此長度上可有1～2 個堿基的變化，可通過Northern印跡檢測到。成熟microRNA 的5'端有單一磷酸基團(tuán)，而3'端則為羥基，這是與相同長度的功能RNA降解片段區(qū)分的標(biāo)志。microRNA能以單拷貝、多拷貝或基因簇的形式存在，而都以成簇排列為主，其基因經(jīng)常協(xié)同表達(dá)。microRNA具有明顯的特異性，即microRNA的表達(dá)譜和序列特征在不同的組織和不同的細(xì)胞中表達(dá)不同。這些microRNA可能可以作為細(xì)胞或組織的特異性標(biāo)志物。處于不同發(fā)育階段的細(xì)胞microRNA組成不同，在特定發(fā)育階段的細(xì)胞會出現(xiàn)特定的microRNA，這決定細(xì)胞的分化方向及分化時相，同時也表明microRNA的表達(dá)具有一定的時序性。microRNA的表達(dá)及作用都具有高度的保守性，在不同種屬、不同組織及不同細(xì)胞中，相同或相似的microRNA 分子具有相似的調(diào)控功能〔9〕。microRNA作用具有多靶點(diǎn)性(網(wǎng)絡(luò)性)特點(diǎn)，即在生物體內(nèi)一個microRNA可以作用于多個靶mRNA，而單個靶mRNA也可以同時受多個microRNA調(diào)控。因此microRNA的調(diào)控作用很可能是一種調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，它需要接受某些信號的刺激，從整體上調(diào)控有機(jī)體。

3 microRNA的形成過程和作用機(jī)制

在哺乳動物中，細(xì)胞核內(nèi)編碼microRNA的基因在RNA聚合酶Ⅱ的作用下轉(zhuǎn)錄生成初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物microRNA前體(pri-microRNA)，進(jìn)而在細(xì)胞核內(nèi)被RNaseⅢ核酸內(nèi)切酶Drosha和其調(diào)節(jié)亞基DGCR8蛋白組成的復(fù)合物加工成長約70～100個核苷酸的pre-microRNA〔10〕。然后pre-microRNA被RAN蛋白-三磷酸鳥苷結(jié)合物(RAN-GTP)和exportin 5轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，在核酸酶Dicer的作用下，剪切形成microRNA:microRNA*雙鏈配對結(jié)構(gòu)。此雙鏈結(jié)構(gòu)在解旋酶的作用下解鏈，其中一條鏈被降解，另一條為成熟的單鏈microRNA(多為具有5'端小突起的一條鏈)。成熟的microRNA與Argonaute蛋白(AGO1)蛋白結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RISC)〔11〕。進(jìn)而通過microRNA 5'端與靶mRNAs 的3'端非翻譯區(qū)(3'UTR)特異性的堿基配對，降解mRNA或阻遏mRNA的翻譯,在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控蛋白的表達(dá)。

RISC對目的mRNA的作用機(jī)制主要有三種。當(dāng)microRNA與靶mRNA不完全互補(bǔ)結(jié)合時，可以抑制靶mRNA的翻譯但不影響其穩(wěn)定性，此種方式在動物中多見，如線蟲lin-4。當(dāng)microRNA與靶mRNA完全互補(bǔ)結(jié)合時，靶mRNA最終降解，此種方式常出現(xiàn)于植物中，如擬南芥miR-171。第三種作用方式包含了以上兩種作用機(jī)制，當(dāng)microRNA與靶mRNA完全互補(bǔ)結(jié)合時，可直接靶向切割mRNA，如HeLa細(xì)胞和果蠅中的let-7可直接介導(dǎo)RISC分裂切割靶mRNA。當(dāng)microRNA與靶mRNA不完全互補(bǔ)結(jié)合時，可起到調(diào)節(jié)基因表達(dá)的作用，如線蟲中的let-7與靶mRNA的3'UTR不完全互補(bǔ)結(jié)合后，可抑制基因翻譯〔12〕。由于microRNA可以結(jié)合到靶mRNAs的3'UTR來發(fā)揮調(diào)控作用，因此一個microRNA可以有上百個靶mRNA，而一個靶mRNA也可能被多個microRNA調(diào)控。據(jù)估計，microRNA調(diào)控超過60%的蛋白編碼基因〔13〕。

4 microRNA對干細(xì)胞的調(diào)控作用

目前已經(jīng)從哺乳動物中發(fā)現(xiàn)數(shù)百個microRNA，其中一些microRNA與干細(xì)胞類型相關(guān)，其在細(xì)胞內(nèi)的含量隨干細(xì)胞的分化而發(fā)生改變。通過研究microRNA在干細(xì)胞中的作用，可進(jìn)一步揭示干細(xì)胞增殖及分化過程的內(nèi)在機(jī)制。

胚胎干細(xì)胞(ESCs)具有無限的自我更新能力及分化成其他類型細(xì)胞的能力，研究發(fā)現(xiàn)microRNA與ESCs自我更新和分化方面有密切的關(guān)系。在未分化的ESCs中，僅有少數(shù)幾種microRNA高度表達(dá)：在鼠ESCs中為miR-292 和miR-302 家族；在人ESCs中為miR-371 和miR-302 家族〔1〕，這些microRNA可能在維持ESCs的特性方面發(fā)揮作用。另外有些microRNA對ESCs的分化起促進(jìn)作用，如miR-1和miR-133 可促進(jìn)ESCs向中胚層方向分化，miR-9可促進(jìn)ESCs向神經(jīng)細(xì)胞方向分化。miR-9通過抑制核受體核受體無尾蛋白(TLX)對神經(jīng)干細(xì)胞的增殖進(jìn)行負(fù)調(diào)控，并促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的分化。而當(dāng)表達(dá)缺少miR-9識別位點(diǎn)的TLX時，可以挽救miR-9所引起的細(xì)胞增殖障礙，并能抑制神經(jīng)干細(xì)胞的分化。這提示miR-9和核受體TLX形成了一個負(fù)調(diào)節(jié)環(huán)路，維持神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化的平衡〔14〕。此外miR-9對神經(jīng)祖細(xì)胞的增殖、遷移也有著調(diào)節(jié)作用。人ESCs分化為神經(jīng)祖細(xì)胞時，其細(xì)胞內(nèi)的miR-9表達(dá)被激活，同時miR-9也能促進(jìn)神經(jīng)祖細(xì)胞的增殖，在神經(jīng)祖細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞后，miR-9仍然持續(xù)表達(dá)。體外實(shí)驗(yàn)中miR-9的減少可以抑制神經(jīng)祖細(xì)胞的增殖，但卻能促進(jìn)神經(jīng)祖細(xì)胞的遷移。當(dāng)把無miR-9活性的神經(jīng)祖細(xì)胞移植入胚鼠腦內(nèi)或腦卒中模型的成年小鼠腦內(nèi)，這些細(xì)胞仍然顯示出較強(qiáng)的遷移能力。然而，盡管miR-9是完全保守的序列，但它在不同的生物體內(nèi)表達(dá)的模式和功能有著顯著的不同〔15〕。另外，microRNA在ESCs的細(xì)胞周期調(diào)控中起重要作用。ESCs細(xì)胞周期的特點(diǎn)是G1期很短，干細(xì)胞能很快進(jìn)入S期。而Dicer酶突變的ESCs表現(xiàn)出明顯的增殖缺陷，處于G0期和G1期的細(xì)胞小幅度增多。狄喬治綜合征關(guān)鍵區(qū)域基因(DGCR)8敲除的ESCs多停滯在G1期，雖然形態(tài)上看起來正常，也表達(dá)ESCs的特異性標(biāo)志物，但細(xì)胞倍增時間延長〔16〕。

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)是在形態(tài)、基因和蛋白表達(dá)、細(xì)胞增殖能力、分化能力等方面都與ESCs相似的一類細(xì)胞。將四種轉(zhuǎn)錄因子基因(Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc)以病毒載體導(dǎo)入已分化的體細(xì)胞中，使細(xì)胞重新編程，可以得到具有多向分化潛能的iPSCs。然而這種方式誘導(dǎo)效率較低，近幾年有研究嘗試使用microRNA與轉(zhuǎn)錄因子共同誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程，取得了較好的效果。在使用三個外源性轉(zhuǎn)錄因子Sox2、Klf4、Oct4的同時，過表達(dá)兩個microRNA家族：miR-106a-363及miR-302-367，可以有效提高小鼠成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)為iPSCs的效率〔17〕。除此以外，有些microRNA對iPSCs的定向分化也有促進(jìn)作用。Lahmy等〔18〕報道使用人包皮成纖維細(xì)胞重編程為iPSCs，在沒有其他誘導(dǎo)因子的情況下，以慢病毒為載體將miR-375在iPSCs中過表達(dá)，通過形態(tài)學(xué)評估、免疫細(xì)胞化學(xué)、胰島標(biāo)志基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，從過表達(dá)miR-375的iPSCs中可以得到胰島素樣細(xì)胞，而且這些胰島素樣細(xì)胞還能分泌胰島素。塞特1基因(Sirt1)是依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的組蛋白脫乙酰酶，與細(xì)胞的增殖、分化、衰老、凋亡和代謝密切相關(guān)。miR-34a是第一個被發(fā)現(xiàn)對Sirt1有調(diào)控作用的microRNA。miR-34a可以通過結(jié)合在Sirt1 mRNA的3′UTR上，從而減少Sirt1的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)Sirt1對iPSCs向神經(jīng)干細(xì)胞起負(fù)調(diào)控作用，即抑制iPSCs向神經(jīng)干細(xì)胞分化，并且這一過程可能被miR-34a調(diào)控。當(dāng)Sirt1表達(dá)下降時，miR-34a表達(dá)反而升高。當(dāng)抑制Sirt1時，能增強(qiáng)iPSCs向神經(jīng)干細(xì)胞的分化并促進(jìn)成熟神經(jīng)細(xì)胞的形成。因此在iPSCs分化過程中，通過miR-34a對Sirt1 mRNA轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控作用，可以抑制Sirt1的表達(dá)，這樣可以獲得更多的神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞〔19〕。

miR-122是第一個被鑒定的肝特異性microRNA分子，它在肝臟中高度表達(dá)，其表達(dá)量約占肝臟中所有microRNA的70%，而在其他組織器官中表達(dá)很低甚至檢測不到。它在肝臟胚胎發(fā)育、肝細(xì)胞生長及表型維持、應(yīng)激反應(yīng)、病毒感染、膽固醇與脂肪酸代謝等多種生物學(xué)過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。有研究通過攜帶miR-122的重組腺病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染ESCs源性肝前體細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-122后細(xì)胞肝特異性基因如ALB、TTR、AAT、G-6-P、CK8、CYP7A1和CYP3A4的mRNA表達(dá)水平明顯升高。這表明轉(zhuǎn)染miR-122后，細(xì)胞在功能學(xué)上接近成熟肝細(xì)胞水平，miR-122能有效地促進(jìn)小鼠ESCs源性肝前體細(xì)胞的分化和成熟〔20〕。miR-199a-5p是另外一種在ESCs向干細(xì)胞分化過程中起作用的microRNA，它在肝樣細(xì)胞中表達(dá)最高，其次是胎肝，成熟肝細(xì)胞中含量最少，幾乎檢測不到。miR-199a-5p對小鼠和人的ESCs分化起負(fù)調(diào)節(jié)作用，抑制miR-199a-5p能增強(qiáng)小鼠和人的ESCs向肝細(xì)胞分化。SMARCA4和MST1是miR-199a-5p的靶基因，在肝臟再生過程中能增加肝細(xì)胞的生成。降低miR-199a-5p的表達(dá)，導(dǎo)致SMARCA4和MST1表達(dá)上調(diào)，從而促使胚肝發(fā)育時期肝細(xì)胞形成〔21〕。

microRNA對造血過程也有調(diào)控作用，參與調(diào)節(jié)原始造血祖細(xì)胞多能性的維持和造血過程早期和晚期階段中細(xì)胞的分化。有些microRNA在造血干細(xì)胞(HSCs)和造血祖細(xì)胞(HPCs)內(nèi)表達(dá)，并發(fā)揮調(diào)控造血細(xì)胞分化功能，如miR-22、miR-29、miR-125和miR-126，在有些急性骨髓性白血病患者中，這些microRNA出現(xiàn)失調(diào)〔22〕。目前很多研究認(rèn)為miR-125家族(包括miR-125a、miR-125b1、miR-125b2)能增強(qiáng)干細(xì)胞的自我更新能力。miR-125家族在造血祖細(xì)胞中有較高的表達(dá)，以減少細(xì)胞的分化。然而miR-125家族的靶基因目前還不十分清楚，有可能是促凋亡的基因及與p53信號通路相關(guān)的基因。與紅細(xì)胞生成有關(guān)的microRNA有miR-15a、miR-24、miR-144、miR-451等。其中miR-24、miR-27a、miR-451能調(diào)控紅系轉(zhuǎn)錄因子GATA-1和GATA-2的表達(dá)，這兩種轉(zhuǎn)錄因子能促進(jìn)造血干細(xì)胞向髓系分化〔23〕。在臍血CD34+造血祖細(xì)胞向紅系發(fā)育過程中,miR-221和miR-222表達(dá)逐漸下降，這能促進(jìn)紅系發(fā)育。當(dāng)過表達(dá)這兩個microRNA后，能造成紅系增殖和分化障礙。另有研究表明miR-223與其他轉(zhuǎn)錄因子共同調(diào)控粒細(xì)胞的分化，過度表達(dá)miR-223能促進(jìn)粒細(xì)胞的分化過程〔24〕。

骨形成過程也受microRNA的調(diào)控。在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的成骨分化過程中miR-125b是明顯降低的〔25〕。Smad4 是骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)/轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β骨形成信號通路中的關(guān)鍵因子，miR-125b 通過抑制靶基因Smad4 的表達(dá)，抑制BMSCs向成骨細(xì)胞分化。通過向BMSCs細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-125b，雙熒光素報告檢測顯示miR-125b能特異性地與Smad4 mRNA 的3′UTR 結(jié)合，抑制Smad4表達(dá)〔26〕。相反，向BMSCs細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-125b抑制物，可以促進(jìn)BMSCs細(xì)胞的成骨分化，這間接證實(shí)了miR-125b對BMSCs細(xì)胞成骨能力的抑制作用〔25〕。另外miR-30家族通過對靶基因Smad1和Runx2的抑制，對成骨細(xì)胞的分化進(jìn)行負(fù)調(diào)控。過表達(dá)Smad1和Runx2可以顯著消除miR-30對成骨分化的抑制作用〔27〕。此外，microRNA還在脂肪基質(zhì)細(xì)胞分化、神經(jīng)干細(xì)胞分化、皮膚干細(xì)胞分化等諸多方面發(fā)揮不同的調(diào)控作用。

5 展望

干細(xì)胞具有自我更新能力及增殖分化的能力，干細(xì)胞的這些特性為細(xì)胞移植治療衰老、損傷的組織帶來了希望，干細(xì)胞的相關(guān)研究工作一直在如火如荼的進(jìn)行著。干細(xì)胞應(yīng)用于臨床之前，首先需要解決干細(xì)胞定向分化這一難題。干細(xì)胞在生物體內(nèi)所處的微環(huán)境十分復(fù)雜，許多因素影響著干細(xì)胞的增殖分化。microRNA對干細(xì)胞增殖分化的調(diào)控作用已經(jīng)被很多研究所證實(shí)，其中一些方面的研究已經(jīng)取得了可喜的成果。但是由于microRNA數(shù)量眾多，并且一個microRNA可能對數(shù)百個靶mRNA起調(diào)控作用，而一個靶mRNA可以被多個microRNA所調(diào)控，此外，microRNA還可能與其他信號通路中的相關(guān)因子發(fā)生聯(lián)系，因此microRNA對干細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制異常復(fù)雜，仍然存在著很多未知領(lǐng)域需要去研究。但是，我們相信隨著對microRNA研究的不斷深入，最終將會揭示其調(diào)控干細(xì)胞的具體作用機(jī)制。