王蓮萍, 李慶杰, 劉曉艷, 任躍英, 楊秀偉

(1. 吉林農(nóng)業(yè)大學中藥材學院, 長春 130000;2. 長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院實驗中心, 長春 130021;3. 北京大學藥學院, 北京 100191)

吳茱萸為蕓香科植物吳茱萸[Evodiarutaecarpa(Juss.) Benth.]、 石虎[Euodiarutaecarpa( Juss. ) Benth.var.officinalis(Dode) Huang]或疏毛吳茱萸[Euodiarutaecarpa(Juss. ) Benth.var.bodinieri(Dode) Huang]的干燥近成熟果實[1]. 吳茱萸具有溫中、 止痛、 理氣和燥濕的傳統(tǒng)功效, 臨床上主要用于治療寒滯肝脈、 寒疝腹痛、 肝胃虛寒、 濁陰上逆所致厥陰巔頂頭痛、 脾腎陽虛等癥[2,3], 其改善胃腸功能障礙作用確切[4,5]. 研究發(fā)現(xiàn), 吳茱萸含有生物堿、 萜類、 黃酮、 酚酸、 苯丙素、 揮發(fā)油和多糖等多種類型化合物, 其中生物堿和苦味素為其主要成分, 生物堿分為喹諾酮類生物堿、 吲哚類生物堿及其它生物堿[6].

實驗結(jié)果表明, 吳茱萸與黃連組成的藥物可通過調(diào)節(jié)膽堿能系統(tǒng)改善胃腸功能[7], 推測吳茱萸中可能含有抗膽堿酯酶活性成分. 本文分析了吳茱萸入血小分子化合物的體內(nèi)藥代動力學及各化合物與膽堿酯酶的結(jié)合情況, 并探討了各化合物的構(gòu)效關(guān)系及類藥性, 為尋找新的膽堿酯酶抑制劑提供了基礎(chǔ).

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

吳茱萸醇提取物為自制(產(chǎn)率為32.6%); 所用的對照品均為自制, 經(jīng)高效液相色譜法確認純度均大于95%; 內(nèi)標卡馬西平標準品(批號: 201404)購自食品藥品檢定研究院; 羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)購于陜西正一藥用輔料有限公司; 肝素鈉注射液(批號: 20161202)購自天津生化制藥有限公司; 甲醇和乙腈(質(zhì)譜級)均購于賽默飛世爾科技有限公司; 乙酸銨(色譜級)購于西格瑪奧德里奇有限公司; 去離子水由微孔阿爾法-Q水凈化系統(tǒng)制得. 其余試劑均為分析純.

清潔級雄性SD 大鼠9 只, 體重(220±20) g, 由北京大學醫(yī)學部實驗動物中心提供, 合格證號為SCXK(京)2016-0010. 將大鼠置于(24±2) ℃, 濕度為(60±5)% 的環(huán)境下, 晝夜節(jié)律光照, 自由進食飲水, 飼養(yǎng)7 d以適應環(huán)境.

UFLC-MS/MS-8050型液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本島津公司), 配備有LC-30A二元泵、 SIL-30AC自動進樣器、 SPD-M30A PDA 檢測器、 CTO-20AC 柱溫箱以及電噴霧離子源(ESI); Sigma3K15型高速(冷凍)離心機(德國Sigma公司); MVS-1型渦旋混合器(北京金北德工貿(mào)有限公司); KQ5200型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司); LGJ0.5型冷凍干燥機(北京四環(huán)科學儀器廠).

1.2 體內(nèi)藥代動力學實驗過程

1.2.1 色譜條件 ACQUITY UPLC?BEH Shield RP-C18色譜柱(1.7 μm, 100 mm×2.1 mm), 配備有同類型的RP-C18 Van Guard TM預柱(1.7 μm, 5 mm×2.1 mm); 以乙腈(B)-0.2 mmol/L乙酸銨水溶液(A)作為流動相, 梯度洗脫程序: 0～8 min, 40%～100%B; 8～10 min, 100%B; 10～10.1 min, 40%B; 10.1～14 min, 40%B; 流速0.4 mL/min; 柱溫30 ℃; 進樣量1 μL.

1.2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源, 干燥氣體N2流量10 L/min, 霧化氣體流量3 L/min, 加熱氣體流量10 L/min, 界面溫度300 ℃, 脫溶劑溫度250 ℃, 加熱溫度400 ℃, 接口電壓3 kV, 檢測電壓1.8 kV. 具體參數(shù)列于表1.

Table 1 Information of compound ionization*

*Q1: Quadrupole 1 pre-rod bias;Q3: quadrupole 3 pre-rod bias; CE: collision energy.

1.2.3 樣品制備 取30 g醇提取物粉末溶于適量的水中, 加入1 g CMC-Na助溶, 超聲溶解, 并加水定容至100 mL, 得均勻灌胃混懸藥液, 備用.

將SD雄性大鼠隨機分為2組: 空白組3只, 給藥組6只. 禁食12 h后, 對給藥組的大鼠均按照10 g/kg(藥材/體重)平行灌胃給藥, 空白組大鼠給予同等體積的飲用水, 并分別在0.16, 0.33, 0.5, 1.0, 1.5, 2, 3, 5, 6, 8, 12和24 h時眼眶靜脈叢取血適量, 置于提前準備好的肝素鈉EP管中, 以6000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min, 取上清液即得血漿樣品[8].

精確吸取100 μL血漿樣品于干凈的1.5 mL EP管中, 加入100 μL 1 μg/mL的卡馬西平內(nèi)標溶液, 再加入500 μL甲醇, 渦旋混勻5 min, 再以10000 r/min離心10 min, 取上清液至新的EP管中, 40 ℃條件下用N2氣吹干濃縮, 殘渣加入100 μL甲醇復溶, 超聲溶解5 min, 以10000 r/min離心10 min, 取上清液, 用0.22 μm微孔濾膜過濾, 于-20 ℃下儲存待UFLC-MS分析[8].

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 采用平均值±SD 表示, 所得數(shù)據(jù)用winnonlin6.4軟件進行處理, 選用統(tǒng)計矩模型, 計算各化合物的藥時曲線下面積(AUClast和AUC0→inf)、 平均滯留時間(MRT)及消除半衰期(t1/2z)等體內(nèi)藥代動力學參數(shù).

1.3 分子對接方法

從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)下載與多奈哌齊(donepezil)復合的乙酰膽堿酯酶(pdb ID 1EVE)[9,10]的晶體結(jié)構(gòu)[圖1(A)]. 采用AutoDock Tools制備受體pdbqt文件, 移除共結(jié)晶配體和水分子的轉(zhuǎn)移、 加氫和分配電荷. 使用AutoDock Vina[11]進行對接, 在由共結(jié)晶受體配體多奈哌齊定義的活性位點區(qū)域中產(chǎn)生對接網(wǎng)格, 對接盒子為2.0 nm×2.0 nm×2.0 nm, 中心坐標x=2.277,y=63.750,z=65.500. 每個配體進行5次對接, 均產(chǎn)生20個構(gòu)象, exhaustiveness為20. 為了確保分析的有效性, 有必要對方法進行驗證; 為此, 采用與配體相同的參數(shù)實現(xiàn)了共結(jié)晶配體多奈哌齊的重新對接. 比較了多奈哌齊和共結(jié)晶的最佳結(jié)果, 均方根偏差(RMSD)為0.11 nm, 低于0.15～0.2 nm, 適用于預測配體構(gòu)象[12]. 對最后的結(jié)果采用PyMOL, PLIP[13]和Discovery Studio Visualizer進行分析和對接構(gòu)象的可視化.

從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)下載丁酰膽堿酯酶(pdb ID 1P0I)[10,14]的晶體結(jié)構(gòu)[圖1(B)]. 采用AutoDock Tools制備受體pdbqt文件, 移除水分子, 加氫和分配電荷. 使用AutoDock Vina進行對接, 首先分析催化位點和外周位點, 其中Ser198為催化絲氨酸, Asp70為外周陰離子位點, 設(shè)置對接盒子為2.0 nm×2.0 nm×2.0 nm, 中心坐標x=138.006,y=119.308,z=42.047. 每個配體進行5次對接, 均產(chǎn)生20個構(gòu)象, exhaustiveness為20. 對最后的結(jié)果采用PyMOL, PLIP和Discovery Studio Visualizer進行分析和對接構(gòu)象的可視化.

Fig.1 Butt pocket of acetylcholinesterase(A) and butylcholinesterase(B)

所有的配體結(jié)構(gòu)式、 名稱及3D結(jié)構(gòu)生成方式列于表S1(見本文支持信息).

2 結(jié)果與討論

2.1 方法學考察

根據(jù)實驗[15,16]分析, 各個化合物的特異性結(jié)果見圖2.

Fig.2 Specificity of 10 compounds in fructus evodiae(A) Blank plasma samples added the standard compounds; (B) blank plasma samples. a—j. dehydroevodiamine, wuchuyuamide Ⅰ, evodiamine, rutaecarpine, 1-methyl-2-nonyl-4(1H)-quinolone, 1-methyl-2-[Z-6-undecenyl]-4(H)-quinolone, evocarpine, 1-methyl-2-pentadecadienyl-4(H)-quinolone, dihydroevocarpine, 1-methyl-2-pentadeceny-4(H)-quinolone, respectively.

血漿中各個化學成分的線性回歸方程、 定量限(LLOQ)和檢測限(LLOD)結(jié)果列于表S2(見本文支持信息). 可見, 所有標準曲線的R2≥0.9959, 表明線性關(guān)系良好.

根據(jù)分析結(jié)果可知, 吳茱萸中10個分析物的日內(nèi)、 日間精密度的相對標準偏差(RSD)值均小于13.13%, 準確度的RSD值均小于14.52%, 說明誤差在可控范圍內(nèi), 所建分析方法可行. 具體結(jié)果列于表S3(見本文支持信息).

血漿樣品在室溫放置、 反復凍融3次以及低溫條件下存放20 d后的穩(wěn)定性RSD值均小于6%, 說明穩(wěn)定性良好. 具體結(jié)果列于表S4(見本文支持信息).

吳茱萸中10個不同濃度分析物的提取回收率在63.2%～101.7% 之間, RSD均小于13.6%, 基質(zhì)效應在84.6%～109.3% 之間, 說明該分析方法可以用于吳茱萸中所標示化合物的快速檢測和分析. 具體信息列于表S5(見本文支持信息).

2.2 藥代動力學

所得化合物的血藥濃度-時間曲線見圖3, 體內(nèi)藥代動力學參數(shù)列于表S6(見本文支持信息).

從圖3可知, 將大鼠灌胃給予吳茱萸乙醇提取物之后, 10個化合物均能被胃腸道快速吸收, 給藥10 min左右均可測到血清中藥物濃度, 大多數(shù)藥物血藥濃度在1～2 h左右達到峰值. 而二氫吳茱萸卡品堿、 吳茱萸堿和1-甲基-2-十五二烯基-4(1H)-喹諾酮達到峰值時間約為2.5～3 h, 說明這3個化合物的胃腸吸收速度低于其它化合物. 4個喹諾酮類化合物達到峰值后, 隨著時間的延長, 血藥濃度迅速降低, 但經(jīng)過一段時間后在血漿內(nèi)仍能檢測到該類成分的存在, 可見其吸收具有吸收快, 消除快, 滯留時間久的特性.

此外, 大鼠在灌胃吳茱萸醇提物后, 去氫吳茱萸堿、 吳茱萸卡品堿和吳茱萸酰胺Ⅰ在血漿中存在一個緩慢下降的過程, 但基本在24 h內(nèi)消除完畢. 由表S6可知, 吳茱萸次堿的半衰期在13 h左右, 作為一種潛在的長半衰期藥物, 可以在繼續(xù)探究其活性和劑型的基礎(chǔ)上減少給藥次數(shù). 除吳茱萸次堿外, 其它化合物的平均半衰期約為1～3 h, 反映了這些化合物在體內(nèi)存在較快的生物轉(zhuǎn)化或消除過程.

同時, 吳茱萸給藥后, 去氫吳茱萸堿、 二氫吳茱萸卡品堿、 1-甲基-2-十五二烯基-4(1H)-喹諾酮、 1-甲基-2-十五烯基-4(1H)-喹諾酮、 吳茱萸堿、 吳茱萸卡品堿和1-甲基-2-壬基-4(1H)-喹諾酮暴露量較高, AUC范圍為2937.631～16514.501 ng·h/mL, 說明生物利用度高. 但1-甲基-2-[Z-6-十一烯基]-4(1H)-喹諾酮、 吳茱萸次堿和吳茱萸酰胺Ⅰ暴露量較低, AUC范圍為565.001～1819.277 ng·h/mL.

2.3 分子對接結(jié)果

2.3.1 10個生物堿與乙酰膽堿酯酶的對接 通過分子對接軟件Vina篩選10個生物堿, 發(fā)現(xiàn)10個生物堿均具有與乙酰膽堿酯酶對接的可能性, 其中活性最高的是去氫吳茱萸堿(-48.95 kJ/mol)、 吳茱萸堿(-48.53 kJ/mol)、 吳茱萸次堿(-47.28 kJ/mol)和吳茱萸酰胺Ⅰ(-46.02 kJ/mol), 其對接打分均在-46.02 kJ/mol以下.

乙酰膽堿酯酶的活性位點在受體表面腔深約2.0 nm處, 除了位于腔底部的酶的催化三聯(lián)體(Ser200, His440和Glu327)外, 已確定幾個殘基是配體相互作用的重要區(qū)域, 如Trp84, Phe330, Glu199和Gly441形成的中心陰離子位點(CAS)及Trp279, Tyr334, Tyr121和Tyr70形成的外周陰離子位點(PAS).

分析10個化合物與乙酰膽堿酯酶主要的作用殘基為Trp84, Phe330, Phe331, Tyr334的疏水貢獻和 Tyr334和Trp84的π-π堆積貢獻. 同樣的反應也存在共結(jié)晶配體多奈哌齊中, 如典型的Trp84, Phe330, Phe331, Tyr334的疏水反應, Trp84的π-π堆積反應[17,18]. 對接結(jié)果及結(jié)合模式分別列于表S7和圖S1～圖S4(見本文支持信息).

打分最好的4個化合物與乙酰膽堿酯酶作用模式如下: (1) 去氫吳茱萸堿, Tyr121與亞氨基形成氫鍵, 距離為0.279 nm, 角度為120°. 其中起結(jié)合能貢獻的主要作用為氨基酸殘基Trp84, Phe330, Phe331和Tyr334與其的疏水作用. (2) 吳茱萸堿, Ser122與其羰基形成氫鍵, 距離為0.35 nm, 角度為127.5°. 另一個典型的相互作用是與Tyr334的π-π堆積, 距離約在0.4 nm. Trp84, Phe330, Phe331和Tyr334與其的疏水作用貢獻主要的結(jié)合能. (3) 吳茱萸次堿, Tyr121與亞氨基形成氫鍵, 距離為0.268 nm, 角度為124.7°, 其中起結(jié)合能貢獻的主要作用為Trp84, Phe330, Phe331和Tyr334與其的疏水作用. (4) 吳茱萸酰胺Ⅰ, Tyr121和Ser122與其形成2個較弱的氫鍵, Trp84和Tyr334的π-π堆積及Phe330和Phe331的疏水作用貢獻主要的結(jié)合能.

其余6個化合物的對接打分較低, 均在-39.33 kJ/mol以上, 它們的典型特點是具有長的脂肪鏈, 由于結(jié)合口袋埋藏在腔內(nèi), 所以它們結(jié)合需要彎曲和折疊, 這些空間位阻導致它們具有較低的結(jié)合親和力[19～21].

2.3.2 10個生物堿與丁酰膽堿酯酶的對接 通過分子對接軟件Vina篩選10個生物堿, 發(fā)現(xiàn)10個生物堿均具有與丁酰膽堿脂酶對接的可能性, 其中活性最高的是吳茱萸酰胺Ⅰ(-46.86 kJ/mol)、 吳茱萸堿(-46.02 kJ/mol)、 去氫吳茱萸堿(-43.93 kJ/mol)和吳茱萸次堿(-42.67 kJ/mol), 其對接打分均在 -41.84 kJ/mol以下. 與乙酰膽堿酯酶的篩選結(jié)果一致.

分析10個化合物與丁酰膽堿脂酶主要的作用為Asp70, Trp82, Thr120, Trp231, Leu286, Val288, Ala328, Phe329, Tyr332, Phe398, Trp430和Tyr440的疏水以及Trp82, Trp231和phe329的π-π堆積. Thr120以及催化殘基Ser198與配體的羰基形成氫鍵. 對接結(jié)果及結(jié)合模式分別見表S8和圖S5～圖S8(見本文支持信息).

打分最好的4個化合物與丁酰膽堿酯酶作用模式如下: (1) 吳茱萸酰胺Ⅰ, Ser198與羰基形成氫鍵, 距離為0.29 nm, 角度為163.8°, His438與其亞氨基形成氫鍵, 距離為0.32 nm, 角度為136.1°. 6個疏水氨基酸Leu286, Val288, Ala328, Phe398, Trp430, Tyr440與其形成疏水相互作用. 2個色氨酸Trp82和Trp231具有大的芳香環(huán), 與其形成π-π堆積作用. (2) 吳茱萸堿, Ser198和His438與其亞氨基形成氫鍵, Thr120與其羰基形成氫鍵, 距離為0.31 nm, 角度為161.3°. 另一個典型的相互作用是與Trp231和Phe329形成π-π堆積作用, 距離約在0.5 nm以上. (3) 去氫吳茱萸堿, Ser198與羰基形成氫鍵, 距離為0.32 nm, 角度為168.9°, Asp70, Thr120, Trp231, Leu286, Val288和Phe398與其形成疏水作用. (4) 吳茱萸次堿, Ser198與羰基形成氫鍵, 距離為0.31 nm, 角度為169.0°, Asp70, Thr120, Trp231, Leu286, Val288, Phe398與其形成疏水作用. Trp231和phe329形成π-π堆積作用. 這4個化合物均與丁酰膽堿酯酶催化殘基Ser198形成氫鍵, 距離為0.3 nm, 角度為168°左右, 是一個較強的氫鍵.

其余6個化合物的對接打分較低, 均在 -35.15 kJ/mol以上, 這6個化合物典型的特點是具有長的脂肪鏈, 由于結(jié)合口袋埋藏在腔內(nèi), 所以這些化合物結(jié)合需要彎曲和折疊, 這些空間位阻導致它們具有較低的結(jié)合親和力[22,23].

3 結(jié) 論

建立了一套快速、 高效、 靈敏的檢測吳茱萸醇提取物中10種生物堿類成分(包括4種吲哚型生物堿及6種喹諾酮類生物堿)的生物學測定方法, 并測定了其體內(nèi)藥代動力學行為, 10個生物堿類化合物與乙酰膽堿脂酶和丁酰膽大堿脂酶對接結(jié)果表明, 吳茱萸堿、 吳茱萸次堿、 去氫吳茱萸堿和吳茱萸酰胺Ⅰ是2個對接體系中對接打分最好的4個化合物, 可能它們具有對乙酰膽堿脂酶和丁酰膽堿脂酶的雙重抑制, 是在吳茱萸總成分中起到主要抑制作用的活性化合物. 并發(fā)現(xiàn)10個化合物與乙酰及丁酰膽堿酯酶均進行模擬對接時, 吲哚型生物堿的結(jié)合力均較好, 明確了作用位點及構(gòu)效關(guān)系, 為開發(fā)新型膽堿酯酶抑制劑提供基礎(chǔ).

支持信息見http://www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20190311.