翁嘉灝 周 苗 孫思明

（上海市中醫(yī)醫(yī)院，上海200071）

血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）是構成血管壁組織結構及維持其正常生理功能的物質(zhì)基礎，其結構和功能的改變?nèi)绠惓Ｔ鲋?、遷移、表型轉(zhuǎn)化等是導致動脈粥樣硬化、高血壓和血管成形術后再狹窄等多種心血管疾病共同的細胞病理學基礎[1]。附子是“回陽救逆第一品”，自《傷寒論》開始，就被用于治療心力衰竭類似癥狀。近年來研究發(fā)現(xiàn)去甲烏藥堿作為附子主要水溶性單體，具有抗血小板凝集、增加心臟收縮力及收縮頻率、抗心肌細胞及神經(jīng)元細胞凋亡等作用[2-4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)去甲烏藥堿能夠通過β2/PI3K/AKT通路抑制成年小鼠心肌細胞氧化應激引起的凋亡，亦有研究證明其能夠通過興奮β2受體松弛氣管平滑肌，而對于VSMC的研究尚未見報道。因此本研究通過體外培養(yǎng)大鼠VSMC，觀察去甲烏藥堿對VSMC遷移和增殖的影響。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SD大鼠購自上海杰思捷實驗動物有限公司，體重180～200 g，雄性，許可證號：SCXK（滬）2018-0004。

1.2 試劑與儀器 去甲烏藥堿（上海同田生物技術有限公司，批號5843-65-2），水合氯醛（由上海市中醫(yī)醫(yī)院實驗中心提供），Ⅱ型膠原酶（美國Worthington Biochemical公司，批 號F8H18380），胰彈性蛋白酶（美國Sigma公司，批號SLBV9311），DMEM培養(yǎng)基（美國Hyclone公司，批號SH30243.01），磷酸緩沖鹽溶液（PBS，美國Hyclone公司，批號SH30256.01），胎牛血清（FBS，南美AnLite公司，批號170216），CCK-8試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，批號C0039）。

生物安全柜（Heal Force），隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海博迅），超凈工作臺（上海博迅），CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo公司），恒溫搖床（上海精宏實驗設備），酶標系統(tǒng)多功能儀（上海百基生物），倒置顯微鏡（萊卡），低溫高速離心機（Sigma公司），純水機Cascada TMIX（頗爾），6孔板、96孔板（美國Corning公司）。

2 實驗方法

2.1 血管平滑肌細胞的原代培養(yǎng) 雄性SD大鼠3～5只，用10%水合氯醛0.1 mL/100g腹腔注射麻醉，無菌條件下迅速取出胸主動脈，取出后用DMEM培養(yǎng)基將主動脈腔內(nèi)殘留的血液沖洗干凈。用鑷子去除血管周圍脂肪及結締組織，并用PBS沖洗3次。將沖洗干凈的胸主動脈放入0.1%Ⅱ型膠原酶培養(yǎng)皿中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中消化45 min左右，消化后的組織轉(zhuǎn)到DMEM培養(yǎng)基中。在顯微鏡下剝除外膜，刮除內(nèi)膜，再將剩余的血管中膜移至干凈的培養(yǎng)皿中剪碎（約1 mm×1 mm左右大?。?，加入0.1%的胰蛋白酶溶液和胰彈性蛋白酶的平衡鹽溶液，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中消化，放置1h后置37℃搖床中，消化過夜。將消化好的組織塊1000 r/min離心10 min（離心半徑10 cm），倒去上清液，加入20%FBS的DMEM培養(yǎng)基，吹打混勻后，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每3 d換液1次。實驗所用細胞選用4～6代細胞進行。

2.2 細胞劃痕試驗觀察去甲烏藥堿對細胞遷移能力的影響 待細胞生長至80%匯合時，將細胞分為不同濃度（0，10，30，100 μmol/L）去甲烏藥堿處理組。在備用的6孔板背面做好標記，每孔間隔相等距離水平橫向畫出3條線。選對數(shù)生長期的VSMC按照每孔5×105個細胞均勻接種于6孔板中，待細胞生長至均勻鋪滿時，按標記線以垂直方向平均相等距離使用無菌200 μL槍頭快速劃下，PBS漂洗，去除漂浮細胞，加入無血清DMEM培養(yǎng)液，使用倒置顯微鏡觀察細胞遷移程度并拍照，即0h細胞遷移狀態(tài)。再將細胞放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，拍照記錄。以上均用顯微鏡在4倍鏡下記錄細胞遷移狀態(tài)，每孔平均9張圖片，采用Image-Pro plus 6.0軟件對遷移距離進行分析。

細胞遷移率=（0h劃痕寬度－培養(yǎng)后劃痕寬度）/0h劃痕寬度×100%

2.3 CCK-8試驗檢測去甲烏藥堿對平滑肌細胞增殖功能的影響 在96孔細胞培養(yǎng)板中，將培養(yǎng)至80%左右的VSMC消化、離心、計數(shù)，用含10%血清的DMEM培養(yǎng)基將細胞濃度調(diào)整至5×104個/mL，每孔加入100 μL細胞懸液，每組設3個復孔，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。第2天將原培養(yǎng)基換成0.1%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后換含有去甲烏藥堿的培養(yǎng)基，濃度分別為0、10、30、100 μmol/L，孵育24 h后棄去培養(yǎng)基。棄去上清后，每孔加入100 μL、10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，再加入10 μL CCK-8液，將培養(yǎng)板繼續(xù)放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h。置酶聯(lián)檢測儀上測定各孔于450 nm處光密度（OD）值，根據(jù)每孔OD值計算藥物干預后細胞的增殖率。

增殖率（細胞活力）＝（OD實驗組－OD空白對照組）/（OD陰性對照組－ OD空白對照組）×100%。

2.4 統(tǒng)計學方法 以上試驗各組重復3次，所有數(shù)-據(jù)均使用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行處理分析，以（±s）表示。2組之間統(tǒng)計分析使用student’s分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結果

3.1 不同濃度去甲烏藥堿對平滑肌細胞遷移能力的影響 結果表明，30 μmol/L及以上濃度去甲烏藥堿具有明顯的抑制細胞遷移距離的作用，且呈劑量依賴性，見圖1。

3.2 不同濃度去甲烏藥堿對平滑肌細胞增殖能力的影響 本研究各劑量去甲烏藥堿均能明顯抑制血管平滑肌細胞增殖，且呈現(xiàn)劑量依賴性，見圖2。

圖1 不同濃度去甲烏藥堿對平滑肌細胞趨化遷移能力的影響

圖2 不同濃度去甲烏藥堿對平滑肌細胞增殖能力的影響

4 討論

血管重塑性疾病指因內(nèi)皮損傷、血管平滑肌細胞增生、細胞外基質(zhì)沉積所致的血管壁增厚和管腔狹窄性心血管疾病，包括動脈粥樣硬化、血管成形術后再狹窄、高血壓等，隨著病程的進展會不同程度地影響靶器官的功能[5]。VSMC是動脈中層的主要成分，主要分為收縮型和分泌型兩種表型。正常成人動脈血管的平滑肌細胞以收縮型為主，其主要功能是維持血管的彈性和收縮血管。在各種刺激下，VSMC在靜態(tài)收縮和增殖合成表型之間發(fā)生表型轉(zhuǎn)換，進而導致平滑肌細胞的異常活化、增殖、遷移以及表達SMC標記-α平滑肌肌動蛋白等，是病理性血管重建的重要病理標志，在動脈粥樣硬化、血管成形術后再狹窄、旁路靜脈移植失敗、同種異體移植血管病變等多種血管疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關鍵作用[6-8]。

冠狀動脈粥樣硬化心臟病可歸屬于中醫(yī)學“胸痹”“胸痛”“真心痛”等范疇，其主要病機是“瘀血阻滯，郁結于血脈”，根據(jù)“久病多瘀”“久病多虛”的理論，臨床以“活血，溫通”為治療大法。附子具有回陽救逆、溫陽散寒之效?，F(xiàn)代藥理學發(fā)現(xiàn)附子具有強心、抗心衰、抗心腦缺血和抗心律失常等功能[9]。有研究表明附子中表達強心作用的主要成分是去甲烏藥堿[10]。

去甲烏藥堿作為附子強心成分的主要水溶性單體，具有強心、擴血管、抗血小板凝集等心血管多靶點作用[11]?，F(xiàn)代藥理學認為，去甲烏藥堿還具有血流動力學作用，亦可作為一種血管擴張劑來降低主動脈阻抗和全身血管阻力以及降低后負荷。此外，相比其他正性肌力藥物，去甲烏藥堿還具有一個優(yōu)勢，其血流動力學作用只有幾分鐘，從而能快速達到所需的血流動力學反應，但也意味著輸液停止后去甲烏藥堿的作用也會迅速消失。去甲烏藥堿通過靜脈給藥后有短時間內(nèi)起效快的藥理作用，對急性心力衰竭的短期治療很有價值。同時，去甲烏藥堿的血管擴張作用，以及強大的正性肌力作用，除了可以作用于VSMC，還對血管內(nèi)皮細胞和巨噬細胞起到抗炎作用，從而抑制新生內(nèi)膜的形成[12-14]。因此，去甲烏藥堿通過抑制平滑肌細胞的合成狀態(tài)阻斷血管狹窄性疾病的發(fā)展代表了一種新的治療方法。本實驗結果顯示，去甲烏藥堿有抑制平滑肌細胞趨化遷移和增殖的作用，且濃度越高細胞的遷移能力越弱，增殖率越低。

本研究結果從體外證明了去甲烏藥堿能夠抑制平滑肌細胞的增殖和遷移能力，但是關于去甲烏藥堿引起VSMC功能改變的具體作用機制仍在探索中。在多種影響平滑肌細胞生物學行為和功能的因素中，血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）作為一種多功能肽，是VSMC重要的調(diào)節(jié)因素，對VSMC有著廣泛的調(diào)節(jié)。它能調(diào)節(jié)血管緊張度，調(diào)節(jié)VSMC生長凋亡，促進細胞遷移和胞外基質(zhì)沉積，促進細胞炎癥反應。因此，AngⅡ介導的VSMC信號通路機制也顯得十分重要。下一步我們將以AngⅡ信號通路作為切入點，從體內(nèi)及體外進一步深入研究去甲烏藥堿的具體作用機制，從而為心血管疾病的防治提供藥理學依據(jù)。