劉學(xué)謙 曹守沛 宋耀鴻

（1.太倉市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇太倉215400；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京中醫(yī)院，江蘇南京210001）

動脈粥樣硬化（astherosclerosis，AS）是一種以侵犯大中型動脈血管為主的慢性疾病[1]，是很多心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)。脂質(zhì)沉積是AS病灶發(fā)展的重要環(huán)節(jié)之一[2]，AS病灶中的脂質(zhì)主要來自富含膽固醇的低密度脂蛋白（LDL-C），并沉積于動脈壁，損傷動脈內(nèi)皮功能，促進(jìn)AS病變的發(fā)生發(fā)展[3]。隨著對AS機(jī)制研究的深入，研究者發(fā)現(xiàn)AS具有慢性炎癥反應(yīng)特征的病理過程，炎癥反應(yīng)貫穿從脂紋形成到斑塊破裂的整個動脈粥樣硬化發(fā)病的各個階段[4]。AS可歸屬于中醫(yī)學(xué)“頭痛”“眩暈”“胸痹”“脈積”“痰核”等范疇。國醫(yī)大師周仲瑛教授提出“瘀熱論”與瘀熱相搏證[5]。以往研究中，我們探究了不穩(wěn)定型心絞痛的瘀熱證型[6]，并采用宋耀鴻所擬之清心通脈飲治療獲得良好的療效，其機(jī)制可能是通過降低巨噬細(xì)胞凋亡抑制AS進(jìn)展[7]。本研究建立了新西蘭兔AS模型，觀察清心通脈飲對AS模型兔血清中相關(guān)炎癥因子、MAPK/NF-κB信號通路和動脈內(nèi)膜的影響，進(jìn)一步揭示清心通脈飲治療AS可能的機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 新西蘭大白兔60只，雄性，普通級，4月齡，體重2.0～2.5 kg，由南京青龍山動物繁殖場提供，合格證號：SCXK（蘇）2012-0008。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)（編號：ACU160808）

1.2 藥物與試劑 清心通脈飲（藥物組成：太子參10 g、麥冬10 g、生地黃10 g、丹參10 g、赤芍10 g、牛膝10 g、銀花10 g、甘松10 g），由南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京中醫(yī)院制劑室制備，濃縮，每毫升含生藥2.5 g。阿托伐他汀片劑，20 mg/片（輝瑞制藥有限公司，批號：170918）。

戊巴比妥鈉（德國進(jìn)口分裝，批號：922L0315）；青霉素鈉（哈藥集團(tuán)有限公司，批號：20170513）；β-肌動蛋白（β-actin）、核轉(zhuǎn)錄因子kappa B p65（NF-κB p65）、調(diào) 節(jié) 蛋 白 激 酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）、p38絲裂原活化蛋白酶（p38 MAPK）、磷酸化NF-κB p65（p-NF-κB p65）、p-ERK、p-JNK、p-p38 MAPK（美國CST公司，批號：03/2017，20170701，20161001，20161203，20161211，20160606，20160921，20160820，20160814）；兔C反應(yīng)蛋白（CRP）、白介素-1（IL-1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、干擾素-β（IFN-β）ELISA試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號：4339660，4327714，20171226，0510791）。

1.3 主要儀器 全自動生化分析儀（7600-020型，日本HITACHI公司；CA-1500型，日本Cysmex公司）；EnSpire酶標(biāo)儀（美國PerkinElmer公司）；5417R型高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；HZL-X160型恒溫振蕩培養(yǎng)箱；TS-1000型搖床（中國海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；Powerpac Basic型濕轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（美國伯樂公司）；Bio-rad型蛋白電泳儀/伯樂小型垂直電泳槽（美國伯樂公司）；Mini-protean Tetra Cell型蛋白轉(zhuǎn)印槽（美國伯樂公司）；MM400混合球磨儀（德國Retsch公司）；1.5 mm×15 mm PTCA擴(kuò)張導(dǎo)管（美國Boston Scientific公司）；0.014英寸導(dǎo)引導(dǎo)絲（美國Boston Scientific公司）；球囊擴(kuò)張壓力泵（美國Cordis公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 股動脈球囊擴(kuò)張術(shù)建立AS模型 造模白兔使用3%利多卡因麻醉，穿刺右側(cè)股動脈1.5～2 cm，沿0.014英寸導(dǎo)引導(dǎo)絲將球囊送入動脈中約15～20 cm，使用壓力泵加壓（6～8 atm）擴(kuò)張球囊，抗阻力向后牽拉球囊約8～10 cm，抽空球囊30 s，再次擴(kuò)張牽拉球囊，充分損傷腹主動脈內(nèi)膜。縫合，碘伏擦拭創(chuàng)口。術(shù)后連續(xù)7 d每日予肌肉注射青霉素80萬單位，并常規(guī)碘伏清創(chuàng)，預(yù)防感染。飼以配方高脂飼料（膽固醇2%，豬膽鹽0.5%，豬油10%，蛋黃粉5%，丙基硫氧嘧啶0.2%，與82.3%基礎(chǔ)飼料混合，由南京青龍山動物繁殖場配制）。12周后，取一只實(shí)驗(yàn)兔處死，截取主動脈根部至髂總動脈做病理切片，進(jìn)行HE染色，觀察造模情況。動脈可見內(nèi)膜變薄，內(nèi)皮破壞，纖維斑塊生成，視為造模成功。

2.2 分組與給藥 將造模成功的白兔隨機(jī)分為模型組、阿托伐他汀組（2.6 mg/kg）和清心通脈飲高、中、低劑量（3.33 g/kg、6.66 g/kg、13.32 g/kg）組，每組10只。另取10只正常白兔作為正常組，予正常飼料。各組分別灌胃給予相應(yīng)的藥物，正常組、模型組灌胃等容量生理鹽水，每日1次，連續(xù)4周。

2.3 指標(biāo)觀察

2.3.1 生化分析法檢測血脂 末次給藥后次日以3%戊巴比妥鈉，按照1 mL/kg麻醉動物，頸動脈采血。室溫靜置2 h，離心半徑10.27 cm，1800 r/min離心15 min，取上清置于-80℃冰箱保存，用HITCHI 7600全自動生化分析儀測定總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）。

2.3.2 HE染色觀察腹主動脈病理形態(tài) 各組白兔頸動脈采血后處死，開腹截取腹主動脈至髂動脈分叉處，生理鹽水沖洗干凈，剪取部分組織分別做病理學(xué)切片。動脈標(biāo)本置于4%的多聚甲醛中固定24 h（4℃），常規(guī)取材、脫水、石蠟包埋，沿動脈每隔1 mm橫斷面切取數(shù)張4 μm厚的切片，HE染色，光鏡下觀察。

2.3.3 Elisa法測定血清炎癥因子水平 按照Elisa試劑盒操作說明書檢測各組兔血清中CRP、IL-1、TNF-α、IFN-β水平。

2.3.4 Western Blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá) 取腹主動脈組織100 mg，加入1 mL細(xì)胞裂解液提取總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量，4倍蛋白上樣緩沖液煮沸5 min，蛋白變性。取蛋白樣品進(jìn)行10%分離膠和5%濃縮膠上樣電泳，電泳結(jié)束后濕法轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜完畢，置于封閉液中室溫非特異性封閉2 h。加入待檢測蛋白一抗（1∶1000），4℃緩慢搖動過夜。室溫TBST洗膜后孵育二抗（1∶1000，用5%BSA稀釋），置搖床上，室溫反應(yīng)2 h?？贵w結(jié)合區(qū)帶用化學(xué)發(fā)光法檢測，以β-actin作為內(nèi)參進(jìn)行相對定量，用Image J軟件分析灰度值。

2.4-統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)用SPSS 19.0軟件分析，以（±s）表示，先使用單因素方差分析，有差異后2組之間的比較用Student’s-t test檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組白兔腹主動脈病理形態(tài)比較 見圖1。模型組動脈內(nèi)膜破壞，結(jié)締組織增生，泡沫細(xì)胞形成，纖維斑塊鈣化，壞死；清心通脈飲低劑量組動脈脂質(zhì)沉積，動脈內(nèi)膜破壞，平滑肌細(xì)胞遷移，纖維帽形成，動脈管腔狹窄；清心通脈飲中劑量組可見脂質(zhì)沉積，動脈內(nèi)膜增厚；清心通脈飲高劑量組和阿托伐他汀組動脈壁規(guī)整，平滑，未見明顯脂質(zhì)沉積，動脈內(nèi)皮增生不明顯。

3.2 各組白兔血脂水平比較 見表1。

3.3 各組白兔血清中炎性細(xì)胞因子水平比較 見表2。

3.4 各組藥物對MAPK/NF-κB信號通路的影響 見圖2、表3。與正常組比較，模型組腹主動脈組織NF-κB p65、ERK、JNK、p38 MAPK表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差 異（P＞0.05），p-NF-κB p65、p-ERK、p-JNK、p-p38 MAPK表達(dá)明顯升高（P＜0.01）。清心通脈飲各劑量和阿托伐他汀均可不同程度地抑制p-NF-κB p65、p-ERK、p-JNK、p-p38 MAPK表達(dá)，與模型組比較具有顯著性 差 異（P＜0.01，P＜0.05），對NF-κB p65、p-ERK、JNK、p38 MAPK則無明顯調(diào)節(jié)作用。

圖1 各組白兔腹主動脈病理形態(tài)（HE染色，×200）

表1 各組白兔干預(yù)后血脂指標(biāo)比較（±s） 單位：mmol/L

表1 各組白兔干預(yù)后血脂指標(biāo)比較（±s） 單位：mmol/L

注：與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 動物數(shù)（只） T C T G H D L-C L D L-C正常組 10 1.44±0.53 0.78±0.62 0.56±0.08 0.55±0.28模型組 7 32.91±3.91## 22.01±1.92## 3.13±0.68## 27.05±1.22##阿托伐他汀組 8 18.48±2.13** 8.39±1.43** 7.51±1.38** 14.40±0.18**清心通脈飲低劑量組 7 28.23±1.74 19.01±1.14 4.45±1.07 25.28±1.15清心通脈飲中劑量組 7 25.25±3.21** 11.78±1.64** 5.10±1.61 21.45±1.08*清心通脈飲高劑量組 8 22.65±2.89** 11.24±1.58** 5.83±1.44** 11.99±1.43**

表2 各組白兔干預(yù)后血清CRP、IL-1、TNF-α、IFN-β水平比較（±s）

表2 各組白兔干預(yù)后血清CRP、IL-1、TNF-α、IFN-β水平比較（±s）

注： 與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01；與阿托伐他汀組比較，△△P＜0.01；與清心通脈飲中劑量組比較，☆☆P＜0.01。

組別 動物數(shù)（只） C R P/（μ g/m L） I L-1/（p g/m L） T N F-α/（p g/m L） I F N-β/（p g/m L）正常組 10 7.28±0.82 155.94±6.64 83.68±6.07 370.95±20.08模型組 7 15.13±0.93## 284.51±9.91## 237.28±13.56## 705.21±36.14##阿托伐他汀組 8 9.34±0.90** 172.29±7.83** 137.02±6.71** 463.24±22.70**清心通脈飲低劑量組 7 12.93±1.41**△△ 260.34±11.88**△△☆☆ 185.76±8.23△△**☆☆ 543.57±19.28**△△清心通脈飲中劑量組 7 12.45±0.66**△△ 212.21±10.14**△△ 124.56±13.64** 538.81±34.01**△△清心通脈飲高劑量組 8 8.95±0.56**☆☆ 200.47±6.28**△△ 104.75±7.84**△△ 422.48±25.55**△△☆☆

圖2 各組白兔MAPK/NF-κB信號通路表達(dá)

4 討論

動脈粥樣硬化的病理機(jī)制非常復(fù)雜，與多種因素有關(guān)，“炎癥學(xué)說”是現(xiàn)在普遍公認(rèn)的一種AS病理學(xué)說[8]。動脈粥樣硬化斑塊發(fā)展決定著疾病的病變，在AS進(jìn)展過程中，無論是早期脂質(zhì)條紋，到明顯硬化的纖維斑塊、粥樣斑塊、不穩(wěn)定斑塊，還是斑塊破裂和血栓形成等階段，始終伴有炎癥反應(yīng)的存在。炎癥細(xì)胞和促炎癥因子始終貫穿于整個病變的發(fā)展過程，促進(jìn)動脈粥樣硬化的進(jìn)展[4]。

TNF-α、IFN-β、IL-1、CRP是常見的致炎因子，在動脈粥樣硬化的發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[9]。TNF-α可以加劇脂質(zhì)和CRP、IL-1等相關(guān)脂質(zhì)的黏附，促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步破壞血管內(nèi)膜完整性，同時(shí)TNF-α參與了動脈斑塊的形成和破裂過程，加劇心血管事件的發(fā)生[10]。干擾素（IFN）是一類可以介導(dǎo)多種功能的相關(guān)細(xì)胞因子家族，其功能包括抗病毒、抗腫瘤、抗增殖和免疫調(diào)節(jié)活性等。但有研究顯示，在心肌梗死患者中可發(fā)現(xiàn)IFN-β信號傳導(dǎo)的增強(qiáng)，通過增加IFN-β給藥，也發(fā)現(xiàn)缺血血管的灌注恢復(fù)減慢[11]。CRP是一個經(jīng)典的致炎因子，很多研究顯示CRP可通過凝集素樣氧化低密度蛋白受體-1（LOX-1）和LDL相互作用導(dǎo)致動脈內(nèi)皮功能障礙[12]。CRP廣泛存在于AS斑塊中，被認(rèn)為是粥樣病灶不穩(wěn)定的標(biāo)志之一[13]。IL-1是一種多效性潛在促炎因子，現(xiàn)代研究也發(fā)現(xiàn)，采用藥理抑制或者IL-1信號傳導(dǎo)的遺傳性可降低AS斑塊的形成[14]。NF-κB是由Rel家族蛋白形成的同源或異源二聚體轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞生長中發(fā)揮重要作用[15]。絲裂原活化蛋白激酶家族（MAPKs）包括ERK1/2、JNK、p38 MAPK，每個MAPK信號通路由至少三個組分組成。MAPK途徑被多種細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)刺激激活，包括肽生長因子、細(xì)胞因子、激素和各種細(xì)胞應(yīng)激物，例如氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。這些信號傳導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)多種細(xì)胞活動，包括增殖、分化、存活和死亡[16]。ERK是將信號從表面受體轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核的關(guān)鍵信號分子，主要包括ERK1和ERK2兩種亞型，其磷酸化后由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核內(nèi)，可介導(dǎo)Elk-1、ATF、Ap-1、c-fos和c-Jun（JNK）等轉(zhuǎn)錄因子的活化，參與細(xì)胞形態(tài)的維持、細(xì)胞骨架的構(gòu)建和細(xì)胞的增殖與分化、凋亡、脂質(zhì)代謝甚至炎癥反應(yīng)等多種生物學(xué)反應(yīng)[17]。上游的p-ERK活化可激活p-JNK和cyclinD1促進(jìn)血管平滑肌的過度增殖[18]。p38 MAPK和JNK與細(xì)胞的凋亡及炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。p38 MAPK和JNK磷酸化可激活信號通路，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，抑制p38和JNK的磷酸化可以有效抗炎，降低ICAM-1、VCAM-1的表達(dá)，抑制動脈粥樣硬化的發(fā)展[19]。

表3 各組白兔MAPK/NF-κB信號通路表達(dá)比較（±s）

表3 各組白兔MAPK/NF-κB信號通路表達(dá)比較（±s）

注： 與正常組比較，##P＜0.01 ；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01 ；與阿托伐他汀組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01 ；與清心通脈飲低劑量組比較，○P＜0.05，○○P＜0.01；與清心通脈飲中劑量組比較，☆☆P＜0.01。

組別 NF-κB p65 p-NF-κB p65 ERK p-ERK JNK p-JNK p38 MAPK p-p38 MAPK正常組 1.52±0.01 0.28±0.06 0.36±0.01 0.19±0.02 0.52±0.03 0.19±0.01 0.97±0.04 0.43±0.04模型組 1.58±0.02 1.57±0.02## 0.34±0.03 0.35±0.01## 0.52±0.01 0.52±0.01## 1.03±0.02 2.06±0.02##阿托伐他汀組 1.49±0.01 0.30±0.05** 0.33±0.01 0.22±0.02** 0.51±0.01 0.20±0.01** 0.96±0.01 0.45±0.03**清心通脈飲低劑量組 1.47±0.01 0.63±0.02**△△ 0.33±0.02 0.30±0.02*△△ 0.51±0.02 0.26±0.01**△△ 1.06±0.02 1.27±0.04**△△清心通脈飲中劑量組 1.51±0.02 0.51±0.03**△△○○ 0.31±0.02 0.28±0.01**△△ 0.59±0.01 0.24±0.01**△△ 1.08±0.01 1.02±0.05**△△○○清心通脈飲高劑量組 1.47±0.01 0.40±0.02**△○○☆☆ 0.34±0.01 0.27±0.01**△ 0.52±0.02 0.23±0.01**△○ 0.92±0.02 0.79±0.03**△△○○☆☆

本研究結(jié)果表明，經(jīng)清心通脈飲與阿托伐他汀干預(yù)后，AS模型白兔血脂水平和炎癥因子含量均有不同程度的降低，腹主動脈病理程度減輕，p-NF-κB p65、p-p38 MAPK、p-JNK、p-ERK蛋白表達(dá)減少。本研究發(fā)現(xiàn)，造模后模型組兔LDL-C較正常組明顯升高，這可能是由于在慢性炎癥和高脂糖狀態(tài)下，HDL的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致血清淀粉樣蛋白A（SAA）增多，即“高密度脂蛋白失功能”[20]。而各給藥組的HDL-C又明顯高于模型組，可能與藥物改善LDL的功能有關(guān)[21]。

綜上，清心通脈飲對AS具有良好的干預(yù)作用，其作用機(jī)制可能是通過降低血脂，抑制MAPKs/NF-κB通路活化，減少炎癥因子的表達(dá)從而減輕血管炎癥，以達(dá)到抗動脈粥樣硬化的目的。但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究，才能指導(dǎo)臨床合理、安全、有效用藥。