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        “清心通脈飲”對動脈粥樣硬化兔模型相關(guān)炎癥因子的影響研究

        2020-01-15 01:11:50劉學(xué)謙曹守沛宋耀鴻
        江蘇中醫(yī)藥 2020年1期
        關(guān)鍵詞:白兔通脈阿托

        劉學(xué)謙 曹守沛 宋耀鴻

        (1.太倉市中醫(yī)醫(yī)院,江蘇太倉215400;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京中醫(yī)院,江蘇南京210001)

        動脈粥樣硬化(astherosclerosis,AS)是一種以侵犯大中型動脈血管為主的慢性疾病[1],是很多心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)。脂質(zhì)沉積是AS病灶發(fā)展的重要環(huán)節(jié)之一[2],AS病灶中的脂質(zhì)主要來自富含膽固醇的低密度脂蛋白(LDL-C),并沉積于動脈壁,損傷動脈內(nèi)皮功能,促進(jìn)AS病變的發(fā)生發(fā)展[3]。隨著對AS機(jī)制研究的深入,研究者發(fā)現(xiàn)AS具有慢性炎癥反應(yīng)特征的病理過程,炎癥反應(yīng)貫穿從脂紋形成到斑塊破裂的整個(gè)動脈粥樣硬化發(fā)病的各個(gè)階段[4]。AS可歸屬于中醫(yī)學(xué)“頭痛”“眩暈”“胸痹”“脈積”“痰核”等范疇。國醫(yī)大師周仲瑛教授提出“瘀熱論”與瘀熱相搏證[5]。以往研究中,我們探究了不穩(wěn)定型心絞痛的瘀熱證型[6],并采用宋耀鴻所擬之清心通脈飲治療獲得良好的療效,其機(jī)制可能是通過降低巨噬細(xì)胞凋亡抑制AS進(jìn)展[7]。本研究建立了新西蘭兔AS模型,觀察清心通脈飲對AS模型兔血清中相關(guān)炎癥因子、MAPK/NF-κB信號通路和動脈內(nèi)膜的影響,進(jìn)一步揭示清心通脈飲治療AS可能的機(jī)制,為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

        1 實(shí)驗(yàn)材料

        1.1 實(shí)驗(yàn)動物 新西蘭大白兔60只,雄性,普通級,4月齡,體重2.0~2.5 kg,由南京青龍山動物繁殖場提供,合格證號:SCXK(蘇)2012-0008。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)(編號:ACU160808)

        1.2 藥物與試劑 清心通脈飲(藥物組成:太子參10 g、麥冬10 g、生地黃10 g、丹參10 g、赤芍10 g、牛膝10 g、銀花10 g、甘松10 g),由南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京中醫(yī)院制劑室制備,濃縮,每毫升含生藥2.5 g。阿托伐他汀片劑,20 mg/片(輝瑞制藥有限公司,批號:170918)。

        戊巴比妥鈉(德國進(jìn)口分裝,批號:922L0315);青霉素鈉(哈藥集團(tuán)有限公司,批號:20170513);β-肌動蛋白(β-actin)、核轉(zhuǎn)錄因子kappa B p65(NF-κB p65)、調(diào) 節(jié) 蛋 白 激 酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、p38絲裂原活化蛋白酶(p38 MAPK)、磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)、p-ERK、p-JNK、p-p38 MAPK(美國CST公司,批號:03/2017,20170701,20161001,20161203,20161211,20160606,20160921,20160820,20160814);兔C反應(yīng)蛋白(CRP)、白介素-1(IL-1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、干擾素-β(IFN-β)ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司,批號:4339660,4327714,20171226,0510791)。

        1.3 主要儀器 全自動生化分析儀(7600-020型,日本HITACHI公司;CA-1500型,日本Cysmex公司);EnSpire酶標(biāo)儀(美國PerkinElmer公司);5417R型高速冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司);HZL-X160型恒溫振蕩培養(yǎng)箱;TS-1000型搖床(中國海門市其林貝爾儀器制造有限公司);Powerpac Basic型濕轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(美國伯樂公司);Bio-rad型蛋白電泳儀/伯樂小型垂直電泳槽(美國伯樂公司);Mini-protean Tetra Cell型蛋白轉(zhuǎn)印槽(美國伯樂公司);MM400混合球磨儀(德國Retsch公司);1.5 mm×15 mm PTCA擴(kuò)張導(dǎo)管(美國Boston Scientific公司);0.014英寸導(dǎo)引導(dǎo)絲(美國Boston Scientific公司);球囊擴(kuò)張壓力泵(美國Cordis公司)。

        2 實(shí)驗(yàn)方法

        2.1 股動脈球囊擴(kuò)張術(shù)建立AS模型 造模白兔使用3%利多卡因麻醉,穿刺右側(cè)股動脈1.5~2 cm,沿0.014英寸導(dǎo)引導(dǎo)絲將球囊送入動脈中約15~20 cm,使用壓力泵加壓(6~8 atm)擴(kuò)張球囊,抗阻力向后牽拉球囊約8~10 cm,抽空球囊30 s,再次擴(kuò)張牽拉球囊,充分損傷腹主動脈內(nèi)膜。縫合,碘伏擦拭創(chuàng)口。術(shù)后連續(xù)7 d每日予肌肉注射青霉素80萬單位,并常規(guī)碘伏清創(chuàng),預(yù)防感染。飼以配方高脂飼料(膽固醇2%,豬膽鹽0.5%,豬油10%,蛋黃粉5%,丙基硫氧嘧啶0.2%,與82.3%基礎(chǔ)飼料混合,由南京青龍山動物繁殖場配制)。12周后,取一只實(shí)驗(yàn)兔處死,截取主動脈根部至髂總動脈做病理切片,進(jìn)行HE染色,觀察造模情況。動脈可見內(nèi)膜變薄,內(nèi)皮破壞,纖維斑塊生成,視為造模成功。

        2.2 分組與給藥 將造模成功的白兔隨機(jī)分為模型組、阿托伐他汀組(2.6 mg/kg)和清心通脈飲高、中、低劑量(3.33 g/kg、6.66 g/kg、13.32 g/kg)組,每組10只。另取10只正常白兔作為正常組,予正常飼料。各組分別灌胃給予相應(yīng)的藥物,正常組、模型組灌胃等容量生理鹽水,每日1次,連續(xù)4周。

        2.3 指標(biāo)觀察

        2.3.1 生化分析法檢測血脂 末次給藥后次日以3%戊巴比妥鈉,按照1 mL/kg麻醉動物,頸動脈采血。室溫靜置2 h,離心半徑10.27 cm,1800 r/min離心15 min,取上清置于-80℃冰箱保存,用HITCHI 7600全自動生化分析儀測定總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)。

        2.3.2 HE染色觀察腹主動脈病理形態(tài) 各組白兔頸動脈采血后處死,開腹截取腹主動脈至髂動脈分叉處,生理鹽水沖洗干凈,剪取部分組織分別做病理學(xué)切片。動脈標(biāo)本置于4%的多聚甲醛中固定24 h(4℃),常規(guī)取材、脫水、石蠟包埋,沿動脈每隔1 mm橫斷面切取數(shù)張4 μm厚的切片,HE染色,光鏡下觀察。

        2.3.3 Elisa法測定血清炎癥因子水平 按照Elisa試劑盒操作說明書檢測各組兔血清中CRP、IL-1、TNF-α、IFN-β水平。

        2.3.4 Western Blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá) 取腹主動脈組織100 mg,加入1 mL細(xì)胞裂解液提取總蛋白,BCA法進(jìn)行蛋白定量,4倍蛋白上樣緩沖液煮沸5 min,蛋白變性。取蛋白樣品進(jìn)行10%分離膠和5%濃縮膠上樣電泳,電泳結(jié)束后濕法轉(zhuǎn)膜,轉(zhuǎn)膜完畢,置于封閉液中室溫非特異性封閉2 h。加入待檢測蛋白一抗(1∶1000),4℃緩慢搖動過夜。室溫TBST洗膜后孵育二抗(1∶1000,用5%BSA稀釋),置搖床上,室溫反應(yīng)2 h??贵w結(jié)合區(qū)帶用化學(xué)發(fā)光法檢測,以β-actin作為內(nèi)參進(jìn)行相對定量,用Image J軟件分析灰度值。

        2.4-統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)用SPSS 19.0軟件分析,以(±s)表示,先使用單因素方差分析,有差異后2組之間的比較用Student’s-t test檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

        3.1 各組白兔腹主動脈病理形態(tài)比較 見圖1。模型組動脈內(nèi)膜破壞,結(jié)締組織增生,泡沫細(xì)胞形成,纖維斑塊鈣化,壞死;清心通脈飲低劑量組動脈脂質(zhì)沉積,動脈內(nèi)膜破壞,平滑肌細(xì)胞遷移,纖維帽形成,動脈管腔狹窄;清心通脈飲中劑量組可見脂質(zhì)沉積,動脈內(nèi)膜增厚;清心通脈飲高劑量組和阿托伐他汀組動脈壁規(guī)整,平滑,未見明顯脂質(zhì)沉積,動脈內(nèi)皮增生不明顯。

        3.2 各組白兔血脂水平比較 見表1。

        3.3 各組白兔血清中炎性細(xì)胞因子水平比較 見表2。

        3.4 各組藥物對MAPK/NF-κB信號通路的影響 見圖2、表3。與正常組比較,模型組腹主動脈組織NF-κB p65、ERK、JNK、p38 MAPK表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差 異(P>0.05),p-NF-κB p65、p-ERK、p-JNK、p-p38 MAPK表達(dá)明顯升高(P<0.01)。清心通脈飲各劑量和阿托伐他汀均可不同程度地抑制p-NF-κB p65、p-ERK、p-JNK、p-p38 MAPK表達(dá),與模型組比較具有顯著性 差 異(P<0.01,P<0.05),對NF-κB p65、p-ERK、JNK、p38 MAPK則無明顯調(diào)節(jié)作用。

        圖1 各組白兔腹主動脈病理形態(tài)(HE染色,×200)

        表1 各組白兔干預(yù)后血脂指標(biāo)比較(±s) 單位:mmol/L

        表1 各組白兔干預(yù)后血脂指標(biāo)比較(±s) 單位:mmol/L

        注:與正常組比較,##P<0.01;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01。

        組別 動物數(shù)(只) T C T G H D L-C L D L-C正常組 10 1.44±0.53 0.78±0.62 0.56±0.08 0.55±0.28模型組 7 32.91±3.91## 22.01±1.92## 3.13±0.68## 27.05±1.22##阿托伐他汀組 8 18.48±2.13** 8.39±1.43** 7.51±1.38** 14.40±0.18**清心通脈飲低劑量組 7 28.23±1.74 19.01±1.14 4.45±1.07 25.28±1.15清心通脈飲中劑量組 7 25.25±3.21** 11.78±1.64** 5.10±1.61 21.45±1.08*清心通脈飲高劑量組 8 22.65±2.89** 11.24±1.58** 5.83±1.44** 11.99±1.43**

        表2 各組白兔干預(yù)后血清CRP、IL-1、TNF-α、IFN-β水平比較(±s)

        表2 各組白兔干預(yù)后血清CRP、IL-1、TNF-α、IFN-β水平比較(±s)

        注: 與正常組比較,##P<0.01;與模型組比較,**P<0.01;與阿托伐他汀組比較,△△P<0.01;與清心通脈飲中劑量組比較,☆☆P<0.01。

        組別 動物數(shù)(只) C R P/(μ g/m L) I L-1/(p g/m L) T N F-α/(p g/m L) I F N-β/(p g/m L)正常組 10 7.28±0.82 155.94±6.64 83.68±6.07 370.95±20.08模型組 7 15.13±0.93## 284.51±9.91## 237.28±13.56## 705.21±36.14##阿托伐他汀組 8 9.34±0.90** 172.29±7.83** 137.02±6.71** 463.24±22.70**清心通脈飲低劑量組 7 12.93±1.41**△△ 260.34±11.88**△△☆☆ 185.76±8.23△△**☆☆ 543.57±19.28**△△清心通脈飲中劑量組 7 12.45±0.66**△△ 212.21±10.14**△△ 124.56±13.64** 538.81±34.01**△△清心通脈飲高劑量組 8 8.95±0.56**☆☆ 200.47±6.28**△△ 104.75±7.84**△△ 422.48±25.55**△△☆☆

        圖2 各組白兔MAPK/NF-κB信號通路表達(dá)

        4 討論

        動脈粥樣硬化的病理機(jī)制非常復(fù)雜,與多種因素有關(guān),“炎癥學(xué)說”是現(xiàn)在普遍公認(rèn)的一種AS病理學(xué)說[8]。動脈粥樣硬化斑塊發(fā)展決定著疾病的病變,在AS進(jìn)展過程中,無論是早期脂質(zhì)條紋,到明顯硬化的纖維斑塊、粥樣斑塊、不穩(wěn)定斑塊,還是斑塊破裂和血栓形成等階段,始終伴有炎癥反應(yīng)的存在。炎癥細(xì)胞和促炎癥因子始終貫穿于整個(gè)病變的發(fā)展過程,促進(jìn)動脈粥樣硬化的進(jìn)展[4]。

        TNF-α、IFN-β、IL-1、CRP是常見的致炎因子,在動脈粥樣硬化的發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[9]。TNF-α可以加劇脂質(zhì)和CRP、IL-1等相關(guān)脂質(zhì)的黏附,促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡,進(jìn)一步破壞血管內(nèi)膜完整性,同時(shí)TNF-α參與了動脈斑塊的形成和破裂過程,加劇心血管事件的發(fā)生[10]。干擾素(IFN)是一類可以介導(dǎo)多種功能的相關(guān)細(xì)胞因子家族,其功能包括抗病毒、抗腫瘤、抗增殖和免疫調(diào)節(jié)活性等。但有研究顯示,在心肌梗死患者中可發(fā)現(xiàn)IFN-β信號傳導(dǎo)的增強(qiáng),通過增加IFN-β給藥,也發(fā)現(xiàn)缺血血管的灌注恢復(fù)減慢[11]。CRP是一個(gè)經(jīng)典的致炎因子,很多研究顯示CRP可通過凝集素樣氧化低密度蛋白受體-1(LOX-1)和LDL相互作用導(dǎo)致動脈內(nèi)皮功能障礙[12]。CRP廣泛存在于AS斑塊中,被認(rèn)為是粥樣病灶不穩(wěn)定的標(biāo)志之一[13]。IL-1是一種多效性潛在促炎因子,現(xiàn)代研究也發(fā)現(xiàn),采用藥理抑制或者IL-1信號傳導(dǎo)的遺傳性可降低AS斑塊的形成[14]。NF-κB是由Rel家族蛋白形成的同源或異源二聚體轉(zhuǎn)錄因子,在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞生長中發(fā)揮重要作用[15]。絲裂原活化蛋白激酶家族(MAPKs)包括ERK1/2、JNK、p38 MAPK,每個(gè)MAPK信號通路由至少三個(gè)組分組成。MAPK途徑被多種細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)刺激激活,包括肽生長因子、細(xì)胞因子、激素和各種細(xì)胞應(yīng)激物,例如氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。這些信號傳導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)多種細(xì)胞活動,包括增殖、分化、存活和死亡[16]。ERK是將信號從表面受體轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核的關(guān)鍵信號分子,主要包括ERK1和ERK2兩種亞型,其磷酸化后由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核內(nèi),可介導(dǎo)Elk-1、ATF、Ap-1、c-fos和c-Jun(JNK)等轉(zhuǎn)錄因子的活化,參與細(xì)胞形態(tài)的維持、細(xì)胞骨架的構(gòu)建和細(xì)胞的增殖與分化、凋亡、脂質(zhì)代謝甚至炎癥反應(yīng)等多種生物學(xué)反應(yīng)[17]。上游的p-ERK活化可激活p-JNK和cyclinD1促進(jìn)血管平滑肌的過度增殖[18]。p38 MAPK和JNK與細(xì)胞的凋亡及炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。p38 MAPK和JNK磷酸化可激活信號通路,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,抑制p38和JNK的磷酸化可以有效抗炎,降低ICAM-1、VCAM-1的表達(dá),抑制動脈粥樣硬化的發(fā)展[19]。

        表3 各組白兔MAPK/NF-κB信號通路表達(dá)比較(±s)

        表3 各組白兔MAPK/NF-κB信號通路表達(dá)比較(±s)

        注: 與正常組比較,##P<0.01 ;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01 ;與阿托伐他汀組比較,△P<0.05,△△P<0.01 ;與清心通脈飲低劑量組比較,○P<0.05,○○P<0.01;與清心通脈飲中劑量組比較,☆☆P<0.01。

        組別 NF-κB p65 p-NF-κB p65 ERK p-ERK JNK p-JNK p38 MAPK p-p38 MAPK正常組 1.52±0.01 0.28±0.06 0.36±0.01 0.19±0.02 0.52±0.03 0.19±0.01 0.97±0.04 0.43±0.04模型組 1.58±0.02 1.57±0.02## 0.34±0.03 0.35±0.01## 0.52±0.01 0.52±0.01## 1.03±0.02 2.06±0.02##阿托伐他汀組 1.49±0.01 0.30±0.05** 0.33±0.01 0.22±0.02** 0.51±0.01 0.20±0.01** 0.96±0.01 0.45±0.03**清心通脈飲低劑量組 1.47±0.01 0.63±0.02**△△ 0.33±0.02 0.30±0.02*△△ 0.51±0.02 0.26±0.01**△△ 1.06±0.02 1.27±0.04**△△清心通脈飲中劑量組 1.51±0.02 0.51±0.03**△△○○ 0.31±0.02 0.28±0.01**△△ 0.59±0.01 0.24±0.01**△△ 1.08±0.01 1.02±0.05**△△○○清心通脈飲高劑量組 1.47±0.01 0.40±0.02**△○○☆☆ 0.34±0.01 0.27±0.01**△ 0.52±0.02 0.23±0.01**△○ 0.92±0.02 0.79±0.03**△△○○☆☆

        本研究結(jié)果表明,經(jīng)清心通脈飲與阿托伐他汀干預(yù)后,AS模型白兔血脂水平和炎癥因子含量均有不同程度的降低,腹主動脈病理程度減輕,p-NF-κB p65、p-p38 MAPK、p-JNK、p-ERK蛋白表達(dá)減少。本研究發(fā)現(xiàn),造模后模型組兔LDL-C較正常組明顯升高,這可能是由于在慢性炎癥和高脂糖狀態(tài)下,HDL的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,導(dǎo)致血清淀粉樣蛋白A(SAA)增多,即“高密度脂蛋白失功能”[20]。而各給藥組的HDL-C又明顯高于模型組,可能與藥物改善LDL的功能有關(guān)[21]。

        綜上,清心通脈飲對AS具有良好的干預(yù)作用,其作用機(jī)制可能是通過降低血脂,抑制MAPKs/NF-κB通路活化,減少炎癥因子的表達(dá)從而減輕血管炎癥,以達(dá)到抗動脈粥樣硬化的目的。但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究,才能指導(dǎo)臨床合理、安全、有效用藥。

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