許 鉦 位正鵬 霍健聰，3* 劉亞楠 張思佳

（1 浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院 浙江舟山 316000

2 榮成泰祥食品股份有限公司 山東榮成 264300

3 浙江省海產(chǎn)品健康危害因素關(guān)鍵技術(shù)研究重點實驗室 浙江舟山 316000）

帶魚是舟山漁場傳統(tǒng)四大海產(chǎn)之一，也是近年來僅有的仍能維持漁汛的海產(chǎn)之一[1]。據(jù)《舟山市2015年國民經(jīng)濟(jì)和社會發(fā)展統(tǒng)計公報》統(tǒng)計，2015年舟山帶魚產(chǎn)量達(dá)11.71萬t，位居各海水魚產(chǎn)量之首。帶魚加工過程中會產(chǎn)生包括魚頭、魚尾、魚骨及內(nèi)臟等大量加工副產(chǎn)物，約占魚體重的40%～45%[2]。帶魚副產(chǎn)物中含有大量蛋白質(zhì)，國內(nèi)外學(xué)者對水產(chǎn)品加工副產(chǎn)物的利用研究主要在生產(chǎn)魚油、魚露、水解蛋白方面，可是仍存在工藝擴(kuò)大失真，生產(chǎn)成本高等問題[3-5]。如何高效利用這類蛋白資源成為當(dāng)前的研究熱點。

洛泗座油是浙江舟山市知名特產(chǎn)，以其色深汁濃、醬香醇厚、咸甜適中、滋味鮮美、久藏不霉等特點深受人們青睞。醬醪的發(fā)酵和陳化是釀造高品質(zhì)醬油的關(guān)鍵步驟之一。發(fā)酵過程中，大豆蛋白在多種微生物分泌的生物酶的共同作用下，進(jìn)一步分解成氨基酸、肽等小分子物質(zhì)，賦予醬油獨有的風(fēng)味。目前，國內(nèi)絕大部分醬醪中的蛋白均以大豆蛋白為主，關(guān)于醬醪品質(zhì)的研究也多集中于醬醪發(fā)酵過程中微生物區(qū)系變化，以及發(fā)酵工藝對醬油品質(zhì)的影響，而對醬醪制備過程中蛋白成分對醬醪品質(zhì)影響的研究成果寥寥無幾[6-8]?；谶@一情況，本研究將舟山帶魚加工副產(chǎn)物添加到醬醪中，探討添加帶魚副產(chǎn)物蛋白對醬醪品質(zhì)的影響，不僅有望進(jìn)一步提高舟山醬油的風(fēng)味品質(zhì)，而且為帶魚加工副產(chǎn)物的綜合利用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

帶魚加工副產(chǎn)物（整條帶魚經(jīng)采肉后的剩余部分），浙江興業(yè)集團(tuán)有限公司。副產(chǎn)物到實驗室后進(jìn)行絞碎、烘干（水分含量4.20%）、粉碎（過80目篩），密封后冰箱冷藏室貯藏備用；醬油種曲，上海佳民釀造食品有限公司，為蛋白酶和淀粉酶活性較高的中科3.951（即滬釀3.042）米曲霉孢子；魯氏酵母為實驗室自備（提前配制成108個/mL的菌懸液）；其余原料如大豆、面粉等均為市售；試驗用甲醛、鹽酸、福林試劑等常用分析純級化學(xué)試劑、乙腈等色譜用色譜純級試劑，國藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器及設(shè)備

紫外分光光度計（U-2800），日本日立公司；固相微萃取設(shè)備（SUPELCO，57330-U），上海楚定分析儀器有限公司；萃取頭（100μm PDMS，聚二甲基硅氧烷），北京康林科技有限責(zé)任公司；氣質(zhì)聯(lián)用設(shè)備（安捷倫7890B），美國安捷倫科技有限公司；其余均為實驗室常用設(shè)備。

1.3 試驗方法

1.3.1 醬醪制備 參考舟山裕大釀造有限公司醬醪制備工藝。首先制備醬油曲：優(yōu)質(zhì)黃豆1 000 g，加入1.3倍的水，浸泡過夜后（10 h）蒸汽滅菌處理（100℃，20min），蒸汽處理后的黃豆冷水沖淋至40℃后瀝干，并拌入300 g面粉，攪拌均勻后加入1.95 g種曲（即原料質(zhì)量的0.15%）和10mL魯氏酵母菌懸液，同時分別加入占曲料質(zhì)量分別為2.0%（A組）、4.0%（B組）和6.0%（C組）的帶魚副產(chǎn)物魚粉（以不加魚粉為對照），醬油曲進(jìn)行后期培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度33℃，培養(yǎng)時間12 h，翻曲1次，24 h后再翻曲1次；而后培養(yǎng)溫度降低至28℃，繼續(xù)培養(yǎng)36 h后制曲結(jié)束；醬油曲制備好后放到玻璃罐中，按1∶2.1的比例加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%的食鹽水后密封罐體，置于培養(yǎng)箱中恒溫發(fā)酵（30℃）。前1周每天用玻璃棒翻攪1次，1周后每3 d翻攪1次，到30 d時發(fā)酵結(jié)束。

1.3.2 醬油曲酵母總數(shù)、孢子數(shù)量及質(zhì)量評定孢子及酵母菌數(shù)的測定分別參考SB/T 10315-1999和GB 4789.15-2010；同時觀察不同時間醬油曲的外形色澤品質(zhì)。

1.3.3 蛋白酶活力的測定 蛋白酶活力測定參照GB/T 23527-2009，即40℃下水解酪蛋白每分鐘生成1μg酪氨酸所需的酶量，定義為1個蛋白酶活力單位。

1.3.4 醬醪中氨基酸態(tài)氮測定 氨基酸態(tài)氮參考國標(biāo)GB18186-2000，采用甲醛滴定法測定。

1.3.5 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)鑒定 參考馮笑軍等[9]的方法，略有變動，具體操作：稱取10 g樣品置于100mL螺口瓶中，加入24mL蒸餾水和8 g NaCl，聚四氟乙烯密封后于磁力攪拌器上60℃攪拌處理15min，而后用DVB/CAR/PDMS（二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷）萃取頭吸附60 min，插入氣相色譜進(jìn)樣，解析5min。色譜柱采用安捷倫毛細(xì)柱，升溫速度2℃/min，到90℃后保溫5 min；而后升溫速度調(diào)至8℃/min，到250℃后保溫1min；載氣為氦氣，流量1.0mL/min；質(zhì)譜條件：電子能力80 eV，電壓350 V，離子源溫度240℃，四極桿溫度150℃，質(zhì)量掃描范圍m/z 50～450。測定完畢后進(jìn)行定性定量鑒定，其中定量鑒定采用面積歸一化法，定量鑒定參考風(fēng)味物質(zhì)數(shù)據(jù)庫。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理 用SPSS 13.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。利用ANOVA方差分析軟件進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 醬醪制曲過程中種曲孢子及酵母菌數(shù)量的變化

圖1和圖2分別是醬油曲制備過程中魯氏酵母數(shù)和米曲霉孢子數(shù)變化。由圖1可以看出，在制曲的4～20 h階段包括對照組在內(nèi)的各試驗組中，酵母總數(shù)均呈上升趨勢，之后各組酵母總數(shù)反而降低，各處理組在制曲過程中均顯著高于對照組（P＜0.05，除4 h外）。酵母總數(shù)的變化可能與曲料水分含量有關(guān)，制曲開始階段曲料水分含量較高，適于酵母生長，而后期隨著水分蒸發(fā)，生長環(huán)境對酵母數(shù)量增殖不利；而對孢子而言（圖2），在制曲過程中36 h時各組孢子數(shù)均達(dá)到 8.5×108/g以上，在相同制曲時間下，總體來看，各試驗組與對照之間差異不大，表明添加的帶魚魚粉對米曲霉生長無任何影響。

2.2 醬醪制曲過程中蛋白酶活力的變化

圖1 制曲過程中酵母菌總數(shù)變化Fig.1 The changes of the total number of yeasts in koji-making

圖2 制曲過程中孢子總數(shù)變化Fig.2 The changes of the spores in koji-making

圖3 發(fā)酵過程中蛋白酶活力變化Fig.3 Protease activity changes during fermentation

蛋白酶是影響醬油質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)，醬油中氨基酸態(tài)氮、短肽等風(fēng)味物質(zhì)的形成都是蛋白酶的貢獻(xiàn)[10]。此外，蛋白酶降解蛋白形成的氨基酸也是醬油中的酯等重要風(fēng)味物質(zhì)形成的前提[11]。滬釀3.042米曲霉是一種廣泛用于醬油生產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)曲霉菌種，具有適應(yīng)性好，蛋白酶活力高，分泌蛋白酶種類多等優(yōu)點。從圖3可以看出，除24 h外，其余發(fā)酵時間內(nèi)各處理組的蛋白酶活力均顯著高于對照組（P＜0.05），表明添加帶魚魚粉對醬油曲的酶活力有正向促進(jìn)作用；此外，各試驗組間也表現(xiàn)出不同的蛋白酶活力，發(fā)酵時間28 h時，各試驗組間蛋白酶活力存在顯著性差異（P＜0.05），此后A組同B、C兩組間均存在顯著性差異（P＜0.05），而B組、C組間差異不顯著，表明帶魚魚粉添加量增大后對蛋白酶活力提升無顯著作用。除帶魚魚粉外，前期研究發(fā)現(xiàn)，在醬油曲的制備過程中添加1.3%的北太魷魚骨骨粉也有類似效果，這可能同魷魚骨及帶魚魚粉中蛋白質(zhì)含量較高有關(guān)。

圖4 制曲過程中不同發(fā)酵時間種曲外觀形態(tài)變化Fig.4 Morphological changes of soy sauce koji during different fermentation time

2.3 醬醪發(fā)酵過程中外形色澤變化

圖4是B組醬醪發(fā)酵過程中的外形和色澤變化。從圖4a中可以看出，發(fā)酵時間為20 h的醬油曲表面附著有大量黃綠色菌絲，菌絲蓬松柔軟，同時曲料也較為松散，有特殊的曲香味，無酸味、氨味等不良異味；圖4b是曲料加鹽水繼續(xù)發(fā)酵后12 d的圖片，從中可知醬醪黏度較高，大部分大豆外形不完整，醬醪呈誘人的黃褐色，有醬醪特有的醬香味，然而流動性較差；繼續(xù)發(fā)酵到30 d后，大豆基本全部破碎，醬醪黏稠度增加，流動性變差，而色澤基本不變，且醬香味更加濃郁。同B組相比，除帶魚魚粉添加過多（圖4d，C組）會導(dǎo)致醬醪的流動性明顯降低之外，其余試驗組和對照組在外觀色澤上相差不大，表明添加帶魚魚粉對醬醪外觀和色澤影響不顯著。

2.4 醬醪發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮變化

一般而言，醬油中氨基酸態(tài)氮含量越高，醬油品質(zhì)越好，因而氨基酸態(tài)氮是衡量醬油品質(zhì)的重要指標(biāo)[12]。醬醪發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮變化如圖5所示。從圖中可以看出，在30 d的發(fā)酵過程中，各組的氨基酸態(tài)氮含量持續(xù)增加，其中試驗組氨基酸態(tài)氮含量普遍高于對照組，到30 d時分別高于對照組14.5%，18.8%和19.4%。由此可知，添加帶魚魚粉對醬醪品質(zhì)有較為顯著的提升效果。前期研究發(fā)現(xiàn)帶魚副產(chǎn)物營養(yǎng)豐富，其中粗蛋白、粗脂肪含量分別達(dá)到15.36%和10.35%，水解后的副產(chǎn)物含有多種必需氨基酸，其中異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、胱氨酸、蘇氨酸、色氨酸及纈氨酸達(dá)到FAO/WHO（1973）提出的理想氨基酸模式中相應(yīng)氨基酸的88%～100%[13]。較高的蛋白含量和質(zhì)量可能為醬醪中各種微生物提供了更為優(yōu)質(zhì)的氮源，從而提高了醬醪品質(zhì)。

2.5 醬醪揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

圖5 醬醪發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮變化Fig.5 Changes of amino acid nitrogen during fermentation of soy sauce

表1是不同醬醪樣品的揮發(fā)性香氣成分檢測結(jié)果（30 d）。由表1可知，所有樣品檢出成分可分為醇類、酯類、酸類、醛類、酚類及其它雜環(huán)化合物，共計33種，顯著少于趙國忠等[14-16]的研究結(jié)果，這可能與檢測方法、試驗原料及發(fā)酵工藝有關(guān)，然而這一結(jié)果同前期添加魷魚骨粉的結(jié)果類似；從對照組與試驗組的成分結(jié)果對比來看，大部分化合物成分含量均高于試驗組，其各試驗組揮發(fā)性成分總含量均明顯高于對照組，表明添加帶魚魚粉對醬醪主體成分具有一定促進(jìn)效應(yīng)；此外，盡管C組中揮發(fā)性成分含量比B組高3.16%，而值得關(guān)注的是C組高于B組的揮發(fā)性成分主要是辛醛、壬醛、庚醛和2-辛烯醛，而這些醛類物質(zhì)廣泛分布于魚類中，是構(gòu)成魚腥味的主要化學(xué)成分，在醬醪的實際釀造過程中也發(fā)現(xiàn)，帶魚魚粉添加量越高，則發(fā)酵后期醬醪的醬香味中魚腥味也越明顯，這可能與魚粉新鮮度或魚粉自身化學(xué)成分有關(guān)。

表1 醬醪揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分SDE/GC-MS分析結(jié)果（30 d）Table1 The result of volatile flavor compounds analyzed by GC-MS（30 d）

（續(xù)表1）

3 結(jié)論

添加適量帶魚魚粉對醬醪制曲過程中米曲霉的生長及蛋白酶等有一定促進(jìn)效應(yīng)，米曲霉孢子數(shù)和酵母數(shù)均高于對照組，其中帶魚魚粉添加量為4%的B組顯著高于A組，然而同C組無顯著差異；在發(fā)酵過程中添加帶魚魚粉對醬油曲和醬醪的色澤、香氣、流動性等方面無明顯影響，而加入過多魚粉會導(dǎo)致醬醪流動性降低；魚粉的加入可提高醬醪氨基酸態(tài)氮含量，這可能與魚粉中優(yōu)質(zhì)蛋白含量較高有關(guān)；30 d時各組醬醪中揮發(fā)性成分種類基本相同，而4%試驗組中揮發(fā)性成分較高，且辛醛、壬醛等具有魚腥味的成分含量較低，且揮發(fā)性成分含量顯著高于對照組，對醬醪品質(zhì)有一定的提升作用。