許 鉦 位正鵬 霍健聰，3* 劉亞楠 張思佳

（1 浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院 浙江舟山 316000

2 榮成泰祥食品股份有限公司 山東榮成 264300

3 浙江省海產(chǎn)品健康危害因素關(guān)鍵技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 浙江舟山 316000）

帶魚是舟山漁場傳統(tǒng)四大海產(chǎn)之一，也是近年來僅有的仍能維持漁汛的海產(chǎn)之一[1]。據(jù)《舟山市2015年國民經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展統(tǒng)計(jì)公報(bào)》統(tǒng)計(jì)，2015年舟山帶魚產(chǎn)量達(dá)11.71萬t，位居各海水魚產(chǎn)量之首。帶魚加工過程中會(huì)產(chǎn)生包括魚頭、魚尾、魚骨及內(nèi)臟等大量加工副產(chǎn)物，約占魚體重的40%～45%[2]。帶魚副產(chǎn)物中含有大量蛋白質(zhì)，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)水產(chǎn)品加工副產(chǎn)物的利用研究主要在生產(chǎn)魚油、魚露、水解蛋白方面，可是仍存在工藝擴(kuò)大失真，生產(chǎn)成本高等問題[3-5]。如何高效利用這類蛋白資源成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。

洛泗座油是浙江舟山市知名特產(chǎn)，以其色深汁濃、醬香醇厚、咸甜適中、滋味鮮美、久藏不霉等特點(diǎn)深受人們青睞。醬醪的發(fā)酵和陳化是釀造高品質(zhì)醬油的關(guān)鍵步驟之一。發(fā)酵過程中，大豆蛋白在多種微生物分泌的生物酶的共同作用下，進(jìn)一步分解成氨基酸、肽等小分子物質(zhì)，賦予醬油獨(dú)有的風(fēng)味。目前，國內(nèi)絕大部分醬醪中的蛋白均以大豆蛋白為主，關(guān)于醬醪品質(zhì)的研究也多集中于醬醪發(fā)酵過程中微生物區(qū)系變化，以及發(fā)酵工藝對(duì)醬油品質(zhì)的影響，而對(duì)醬醪制備過程中蛋白成分對(duì)醬醪品質(zhì)影響的研究成果寥寥無幾[6-8]?；谶@一情況，本研究將舟山帶魚加工副產(chǎn)物添加到醬醪中，探討添加帶魚副產(chǎn)物蛋白對(duì)醬醪品質(zhì)的影響，不僅有望進(jìn)一步提高舟山醬油的風(fēng)味品質(zhì)，而且為帶魚加工副產(chǎn)物的綜合利用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

帶魚加工副產(chǎn)物（整條帶魚經(jīng)采肉后的剩余部分），浙江興業(yè)集團(tuán)有限公司。副產(chǎn)物到實(shí)驗(yàn)室后進(jìn)行絞碎、烘干（水分含量4.20%）、粉碎（過80目篩），密封后冰箱冷藏室貯藏備用；醬油種曲，上海佳民釀造食品有限公司，為蛋白酶和淀粉酶活性較高的中科3.951（即滬釀3.042）米曲霉孢子；魯氏酵母為實(shí)驗(yàn)室自備（提前配制成108個(gè)/mL的菌懸液）；其余原料如大豆、面粉等均為市售；試驗(yàn)用甲醛、鹽酸、福林試劑等常用分析純級(jí)化學(xué)試劑、乙腈等色譜用色譜純級(jí)試劑，國藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器及設(shè)備

紫外分光光度計(jì)（U-2800），日本日立公司；固相微萃取設(shè)備（SUPELCO，57330-U），上海楚定分析儀器有限公司；萃取頭（100μm PDMS，聚二甲基硅氧烷），北京康林科技有限責(zé)任公司；氣質(zhì)聯(lián)用設(shè)備（安捷倫7890B），美國安捷倫科技有限公司；其余均為實(shí)驗(yàn)室常用設(shè)備。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 醬醪制備 參考舟山裕大釀造有限公司醬醪制備工藝。首先制備醬油曲：優(yōu)質(zhì)黃豆1 000 g，加入1.3倍的水，浸泡過夜后（10 h）蒸汽滅菌處理（100℃，20min），蒸汽處理后的黃豆冷水沖淋至40℃后瀝干，并拌入300 g面粉，攪拌均勻后加入1.95 g種曲（即原料質(zhì)量的0.15%）和10mL魯氏酵母菌懸液，同時(shí)分別加入占曲料質(zhì)量分別為2.0%（A組）、4.0%（B組）和6.0%（C組）的帶魚副產(chǎn)物魚粉（以不加魚粉為對(duì)照），醬油曲進(jìn)行后期培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度33℃，培養(yǎng)時(shí)間12 h，翻曲1次，24 h后再翻曲1次；而后培養(yǎng)溫度降低至28℃，繼續(xù)培養(yǎng)36 h后制曲結(jié)束；醬油曲制備好后放到玻璃罐中，按1∶2.1的比例加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%的食鹽水后密封罐體，置于培養(yǎng)箱中恒溫發(fā)酵（30℃）。前1周每天用玻璃棒翻攪1次，1周后每3 d翻攪1次，到30 d時(shí)發(fā)酵結(jié)束。

1.3.2 醬油曲酵母總數(shù)、孢子數(shù)量及質(zhì)量評(píng)定孢子及酵母菌數(shù)的測定分別參考SB/T 10315-1999和GB 4789.15-2010；同時(shí)觀察不同時(shí)間醬油曲的外形色澤品質(zhì)。

1.3.3 蛋白酶活力的測定 蛋白酶活力測定參照GB/T 23527-2009，即40℃下水解酪蛋白每分鐘生成1μg酪氨酸所需的酶量，定義為1個(gè)蛋白酶活力單位。

1.3.4 醬醪中氨基酸態(tài)氮測定 氨基酸態(tài)氮參考國標(biāo)GB18186-2000，采用甲醛滴定法測定。

1.3.5 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)鑒定 參考馮笑軍等[9]的方法，略有變動(dòng)，具體操作：稱取10 g樣品置于100mL螺口瓶中，加入24mL蒸餾水和8 g NaCl，聚四氟乙烯密封后于磁力攪拌器上60℃攪拌處理15min，而后用DVB/CAR/PDMS（二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷）萃取頭吸附60 min，插入氣相色譜進(jìn)樣，解析5min。色譜柱采用安捷倫毛細(xì)柱，升溫速度2℃/min，到90℃后保溫5 min；而后升溫速度調(diào)至8℃/min，到250℃后保溫1min；載氣為氦氣，流量1.0mL/min；質(zhì)譜條件：電子能力80 eV，電壓350 V，離子源溫度240℃，四極桿溫度150℃，質(zhì)量掃描范圍m/z 50～450。測定完畢后進(jìn)行定性定量鑒定，其中定量鑒定采用面積歸一化法，定量鑒定參考風(fēng)味物質(zhì)數(shù)據(jù)庫。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理 用SPSS 13.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。利用ANOVA方差分析軟件進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 醬醪制曲過程中種曲孢子及酵母菌數(shù)量的變化

圖1和圖2分別是醬油曲制備過程中魯氏酵母數(shù)和米曲霉孢子數(shù)變化。由圖1可以看出，在制曲的4～20 h階段包括對(duì)照組在內(nèi)的各試驗(yàn)組中，酵母總數(shù)均呈上升趨勢，之后各組酵母總數(shù)反而降低，各處理組在制曲過程中均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05，除4 h外）。酵母總數(shù)的變化可能與曲料水分含量有關(guān)，制曲開始階段曲料水分含量較高，適于酵母生長，而后期隨著水分蒸發(fā)，生長環(huán)境對(duì)酵母數(shù)量增殖不利；而對(duì)孢子而言（圖2），在制曲過程中36 h時(shí)各組孢子數(shù)均達(dá)到 8.5×108/g以上，在相同制曲時(shí)間下，總體來看，各試驗(yàn)組與對(duì)照之間差異不大，表明添加的帶魚魚粉對(duì)米曲霉生長無任何影響。

2.2 醬醪制曲過程中蛋白酶活力的變化

圖1 制曲過程中酵母菌總數(shù)變化Fig.1 The changes of the total number of yeasts in koji-making

圖2 制曲過程中孢子總數(shù)變化Fig.2 The changes of the spores in koji-making

圖3 發(fā)酵過程中蛋白酶活力變化Fig.3 Protease activity changes during fermentation

蛋白酶是影響醬油質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)，醬油中氨基酸態(tài)氮、短肽等風(fēng)味物質(zhì)的形成都是蛋白酶的貢獻(xiàn)[10]。此外，蛋白酶降解蛋白形成的氨基酸也是醬油中的酯等重要風(fēng)味物質(zhì)形成的前提[11]。滬釀3.042米曲霉是一種廣泛用于醬油生產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)曲霉菌種，具有適應(yīng)性好，蛋白酶活力高，分泌蛋白酶種類多等優(yōu)點(diǎn)。從圖3可以看出，除24 h外，其余發(fā)酵時(shí)間內(nèi)各處理組的蛋白酶活力均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），表明添加帶魚魚粉對(duì)醬油曲的酶活力有正向促進(jìn)作用；此外，各試驗(yàn)組間也表現(xiàn)出不同的蛋白酶活力，發(fā)酵時(shí)間28 h時(shí)，各試驗(yàn)組間蛋白酶活力存在顯著性差異（P＜0.05），此后A組同B、C兩組間均存在顯著性差異（P＜0.05），而B組、C組間差異不顯著，表明帶魚魚粉添加量增大后對(duì)蛋白酶活力提升無顯著作用。除帶魚魚粉外，前期研究發(fā)現(xiàn)，在醬油曲的制備過程中添加1.3%的北太魷魚骨骨粉也有類似效果，這可能同魷魚骨及帶魚魚粉中蛋白質(zhì)含量較高有關(guān)。

圖4 制曲過程中不同發(fā)酵時(shí)間種曲外觀形態(tài)變化Fig.4 Morphological changes of soy sauce koji during different fermentation time

2.3 醬醪發(fā)酵過程中外形色澤變化

圖4是B組醬醪發(fā)酵過程中的外形和色澤變化。從圖4a中可以看出，發(fā)酵時(shí)間為20 h的醬油曲表面附著有大量黃綠色菌絲，菌絲蓬松柔軟，同時(shí)曲料也較為松散，有特殊的曲香味，無酸味、氨味等不良異味；圖4b是曲料加鹽水繼續(xù)發(fā)酵后12 d的圖片，從中可知醬醪黏度較高，大部分大豆外形不完整，醬醪呈誘人的黃褐色，有醬醪特有的醬香味，然而流動(dòng)性較差；繼續(xù)發(fā)酵到30 d后，大豆基本全部破碎，醬醪黏稠度增加，流動(dòng)性變差，而色澤基本不變，且醬香味更加濃郁。同B組相比，除帶魚魚粉添加過多（圖4d，C組）會(huì)導(dǎo)致醬醪的流動(dòng)性明顯降低之外，其余試驗(yàn)組和對(duì)照組在外觀色澤上相差不大，表明添加帶魚魚粉對(duì)醬醪外觀和色澤影響不顯著。

2.4 醬醪發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮變化

一般而言，醬油中氨基酸態(tài)氮含量越高，醬油品質(zhì)越好，因而氨基酸態(tài)氮是衡量醬油品質(zhì)的重要指標(biāo)[12]。醬醪發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮變化如圖5所示。從圖中可以看出，在30 d的發(fā)酵過程中，各組的氨基酸態(tài)氮含量持續(xù)增加，其中試驗(yàn)組氨基酸態(tài)氮含量普遍高于對(duì)照組，到30 d時(shí)分別高于對(duì)照組14.5%，18.8%和19.4%。由此可知，添加帶魚魚粉對(duì)醬醪品質(zhì)有較為顯著的提升效果。前期研究發(fā)現(xiàn)帶魚副產(chǎn)物營養(yǎng)豐富，其中粗蛋白、粗脂肪含量分別達(dá)到15.36%和10.35%，水解后的副產(chǎn)物含有多種必需氨基酸，其中異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、胱氨酸、蘇氨酸、色氨酸及纈氨酸達(dá)到FAO/WHO（1973）提出的理想氨基酸模式中相應(yīng)氨基酸的88%～100%[13]。較高的蛋白含量和質(zhì)量可能為醬醪中各種微生物提供了更為優(yōu)質(zhì)的氮源，從而提高了醬醪品質(zhì)。

2.5 醬醪揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

圖5 醬醪發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮變化Fig.5 Changes of amino acid nitrogen during fermentation of soy sauce

表1是不同醬醪樣品的揮發(fā)性香氣成分檢測結(jié)果（30 d）。由表1可知，所有樣品檢出成分可分為醇類、酯類、酸類、醛類、酚類及其它雜環(huán)化合物，共計(jì)33種，顯著少于趙國忠等[14-16]的研究結(jié)果，這可能與檢測方法、試驗(yàn)原料及發(fā)酵工藝有關(guān)，然而這一結(jié)果同前期添加魷魚骨粉的結(jié)果類似；從對(duì)照組與試驗(yàn)組的成分結(jié)果對(duì)比來看，大部分化合物成分含量均高于試驗(yàn)組，其各試驗(yàn)組揮發(fā)性成分總含量均明顯高于對(duì)照組，表明添加帶魚魚粉對(duì)醬醪主體成分具有一定促進(jìn)效應(yīng)；此外，盡管C組中揮發(fā)性成分含量比B組高3.16%，而值得關(guān)注的是C組高于B組的揮發(fā)性成分主要是辛醛、壬醛、庚醛和2-辛烯醛，而這些醛類物質(zhì)廣泛分布于魚類中，是構(gòu)成魚腥味的主要化學(xué)成分，在醬醪的實(shí)際釀造過程中也發(fā)現(xiàn)，帶魚魚粉添加量越高，則發(fā)酵后期醬醪的醬香味中魚腥味也越明顯，這可能與魚粉新鮮度或魚粉自身化學(xué)成分有關(guān)。

表1 醬醪揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分SDE/GC-MS分析結(jié)果（30 d）Table1 The result of volatile flavor compounds analyzed by GC-MS（30 d）

（續(xù)表1）

3 結(jié)論

添加適量帶魚魚粉對(duì)醬醪制曲過程中米曲霉的生長及蛋白酶等有一定促進(jìn)效應(yīng)，米曲霉孢子數(shù)和酵母數(shù)均高于對(duì)照組，其中帶魚魚粉添加量為4%的B組顯著高于A組，然而同C組無顯著差異；在發(fā)酵過程中添加帶魚魚粉對(duì)醬油曲和醬醪的色澤、香氣、流動(dòng)性等方面無明顯影響，而加入過多魚粉會(huì)導(dǎo)致醬醪流動(dòng)性降低；魚粉的加入可提高醬醪氨基酸態(tài)氮含量，這可能與魚粉中優(yōu)質(zhì)蛋白含量較高有關(guān)；30 d時(shí)各組醬醪中揮發(fā)性成分種類基本相同，而4%試驗(yàn)組中揮發(fā)性成分較高，且辛醛、壬醛等具有魚腥味的成分含量較低，且揮發(fā)性成分含量顯著高于對(duì)照組，對(duì)醬醪品質(zhì)有一定的提升作用。