李鑫鑫 楊春雪 吳虹燕 魏麗娜 侯紅漫 張公亮

（大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 遼寧大連 116034）

食用香料是一類能增添食物香味和香氣的食品添加劑[1]。在食用香料中，含硫香料占據(jù)非常重要的位置。由于硫的香氣閾值低，特點(diǎn)強(qiáng)，體積小，可廣泛應(yīng)用于食品香精，特別針對(duì)肉類風(fēng)味的不足，對(duì)提高風(fēng)味質(zhì)量起重要作用。其中硫醚的化合物是含有R-（S）n-R'結(jié)構(gòu)，在可食用含硫化合物這一類中含量最多的物質(zhì)[2]。二烯丙基二硫醚（Diallyl disulfide，DADS）在蔥屬植物中比較常見，為大蒜素中存在硫醚的有效成分之一，是綠色、安全的天然添加劑[3]，并且具有特有的風(fēng)味及良好的抑菌、抗腫瘤、抗癌等特性[4]。

產(chǎn)志賀毒性大腸桿菌（Shiga toxin-producing Escherichia coli，STEC）能引發(fā)一系列的人類疾病，包括出血性腸炎（HE）、水樣腹瀉、溶血性尿毒綜合征（Hemolytic-uremic syndrome，HUS）、血小板減少性紫癜（TTP）等。截至目前，由STEC引起的胃腸道疾病的爆發(fā)情況顯示，這種病原體已經(jīng)成為威脅人類健康最重要的病原體之一[5]。至今，已報(bào)道的由STEC引發(fā)的人類疾病，除了包含O157∶H7血清型之外，還有其它血清型，例如：O111，O26，O146 等，也占有重要比例[6]，因此，非O157產(chǎn)志賀毒性大腸桿菌的研究也尤為重要。STEC相關(guān)毒力因子的表達(dá)是其致病性的關(guān)鍵，志賀毒素（Shiga toxin，stx）是主要的毒力因子，Stx 家族由Stx1基因和Stx2基因組成，能夠特異結(jié)合到許多組織的內(nèi)皮細(xì)胞，從而引發(fā)各種疾病[7]。eaeA是緊密黏附素基因，它編碼的蛋白有助于細(xì)菌黏附在腸黏膜不被排出；ehxA基因編碼EHEC溶血素（EHEC－h(huán)emolysin，ehxA）是一種用普通方法檢測不到的特異性溶血素，與出血性腸炎等疾病密切相關(guān)[8]。

本文以二烯丙基二硫醚為試驗(yàn)原料，探究DADS對(duì)大腸桿菌的作用機(jī)理及生物學(xué)特性，研究其對(duì)非O157產(chǎn)志賀毒性大腸桿菌的抑制作用。選取其亞抑菌濃度對(duì)大腸桿菌作用，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法，探究非O157產(chǎn)志賀毒性大腸桿菌中典型毒力因子stx2，eaeA和ehxA的表達(dá)情況，研究其對(duì)大腸桿菌游動(dòng)能力的影響，為后續(xù)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

產(chǎn)志賀毒性大腸桿菌（Shiga toxin-producing Escherichia coli，STEC）編號(hào)：CICC 10670，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（China center of industrial culture collection，CICC）。

1.2 材料與試劑

二烯丙基二硫醚（Diallyl disulfide，DADS），美國Sigma公司；氫氧化鈉、瓊脂粉、牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉，博諾試劑公司；RNAprep pure培養(yǎng)細(xì)胞/細(xì)菌總RNA提取試劑盒，根生化科技（北京）有限公司；SYBRPremix Ex TaqTM，寶生物工程（大連）有限公司；RNase-free Water、熒光定量PCR用引物，生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

ZHJH-C1112C超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；YSQ-LS-50Sll立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DPR-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱、DGG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；202-OAB電熱恒溫干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；電子分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；UV-1750型紫外分光光度計(jì)，日本島津儀器有限公司；微量臺(tái)式離心機(jī)，Thermo Scientific；MyiQ TM 2 型熒光定量PCR儀，美國BIO-RAD公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 培養(yǎng)基的配制 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：蛋白胨 1 g，牛肉膏 0.3 g，氯化鈉 0.5 g，瓊脂 1.5 g，去離子水100mL，調(diào)pH值至7.0左右，121℃下滅菌20min。

Swimming 培養(yǎng)基：蛋白胨 1 g，NaCl 0.25 g，瓊脂0.3 g，去離子水100mL，121℃下滅菌20 min。

1.4.2 菌種的活化 取-80℃凍存的菌液，吸取50μL置于5mL液體培養(yǎng)基中，150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，第一次活化；將上述菌液劃平板過夜培養(yǎng)，第二次活化；挑取平板上的單菌落，轉(zhuǎn)接至液體培養(yǎng)基中用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.4.3 硫化物的處理 根據(jù)已知原液的分子質(zhì)量和密度，按照如下公式稀釋DADS至所需濃度，半數(shù)稀釋至適當(dāng)濃度，密封備用[9]。公式如下：

式中，n——摩爾質(zhì)量，mol/L；M——分子質(zhì)量；m——原液質(zhì)量，g；ρ——密度，g/mL；V1——加入原液的體積，L；V總-V1——加入溶劑的體積，L。

1.4.4 最低抑菌濃度的測定 按照公式稀釋DADS至5mol/L，再半數(shù)稀釋為所需濃度。加入1 mL菌液到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，吸取40 μL不同濃度的DADS分別加至100mL液體培養(yǎng)基中，致 DADS 終濃度達(dá)到 4，2，1，0.5，0.25，0.125,0.625mol/L，充分振蕩均勻，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在12 h內(nèi)，利用紫外分光光度計(jì)每隔3 h測量其OD600值，繪制生長動(dòng)力學(xué)曲線。以O(shè)D600值為縱坐標(biāo)，時(shí)間t為橫坐標(biāo)，繪制試驗(yàn)組和對(duì)照組生長曲線。與對(duì)照相比，若有細(xì)菌生長，記為陽性（+）；若無細(xì)菌生長，記為陰性（-）。以無細(xì)菌生長的DADS最低濃度記為MIC。每個(gè)濃度3組平行，試驗(yàn)結(jié)果取平均值。添加等體積DMSO作為陰性對(duì)照[10]。

1.4.5 RNA的提取及cDNA的合成 參照Upadhyay等和Knudsen等[11-12]，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，分別添加不同亞抑菌濃度DADS，以未添加DADS的作為對(duì)照組，培養(yǎng)12 h，取適量的菌液按照細(xì)菌總RNA提取試劑盒說明書步驟提取RNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用酶標(biāo)儀測得OD260/OD280比率，檢測RNA純度。

1.4.6 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中大腸桿菌基因全長序列為模板，設(shè)計(jì)stx2、eaeA、ehxA的上下游引物序列，另外內(nèi)參基因16SrRNA的上下游引物序列來自Andino等[13]的報(bào)道，4種基因的bp長度在200以內(nèi)。引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。引物序列及擴(kuò)增片段長度見表1。

1.4.7 實(shí)時(shí)定量熒光PCR 用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀測定stx2、eaeA、ehxA基因在亞抑菌濃度DADS作用下的相對(duì)表達(dá)量。RT-qPCR反應(yīng)條件如下：初始變性 95℃，1min后，95℃，20 s；62℃，20 s；80℃，15 s反應(yīng)40個(gè)循環(huán)，60℃處停留 15 s。在60℃時(shí)進(jìn)行熒光信號(hào)采集，反應(yīng)結(jié)束后，系統(tǒng)根據(jù)熒光值的變化規(guī)律自動(dòng)生成熔融曲線。得到目的基因和內(nèi)參基因的Ct值，用2-⊿⊿Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量[14]：

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物Table1 The qRT-PCR primers

1.4.8 DADS對(duì)大腸桿菌游動(dòng)能力的影響 方法參考Abreu等和Butler等[15-16]大腸桿菌游動(dòng)能力的抑制試驗(yàn)，取1mL大腸桿菌種子液接種于100 mL液體培養(yǎng)基中，37℃，150 r/min培養(yǎng)18 h。將20mL泳動(dòng)培養(yǎng)基滅菌后冷卻至45℃左右時(shí)，分別加入不同濃度DADS溶液，加生理鹽水作為陽性對(duì)照。倒板，取3μL菌液點(diǎn)到平板中央。培養(yǎng)18 h后，用游標(biāo)卡尺測量擴(kuò)散圈直徑，根據(jù)擴(kuò)散圈直徑大小判斷DADS對(duì)大腸桿菌游動(dòng)能力的抑制作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 DADS對(duì)大腸桿菌的最低抑菌濃度影響

DADS對(duì)大腸桿菌有明顯的抑菌作用。DADS對(duì)大腸桿菌最低抑菌濃度見表2。通過測定，當(dāng)DADS的添加濃度大于2mmol/L時(shí)，抑制大腸桿菌的生長。該結(jié)果與前期研究相一致[17]，DADS對(duì)革蘭氏陽性菌包括大腸桿菌有良好的抑制效果。與吳楠等[18]的研究結(jié)果相符，以大蒜精油為原料研究對(duì)包括大腸桿菌在內(nèi)8種菌的抑菌效果，提取的大蒜精油中DADS占19.35%。DADS對(duì)大腸桿菌生長曲線的影響如圖1所示，陽性對(duì)照組大腸桿菌生長曲線呈正常典型的生長曲線，在DADS濃度為MIC時(shí)，DADS可以明顯抑制大腸桿菌生長，使細(xì)菌無法生長，1/2MIC的DADS使細(xì)菌無法進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，非典型生長狀態(tài)，曲線平緩。在1/4MIC、1/8MIC、1/16MIC和1/32MIC的DADS作用下，大腸桿菌雖然可以進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，但由于DADS的抑制作用，生長數(shù)量處于略低狀態(tài)，吸光度值始終低于陽性對(duì)照組。培養(yǎng)12 h時(shí)，陽性對(duì)照組的OD600值達(dá)到1.31，而1/2MIC的DADS的OD600值為0.73。DADS對(duì)大腸桿菌的抑菌作用在1/4MIC～MIC之間具有一定的濃度依賴性。

2.2 RNA提取的結(jié)果

RNA提取結(jié)果如圖2所示，分別為未添加DADS的對(duì)照組和添加 1/4MIC、1/8MIC、1/16MIC和1/32 MIC的DADS試驗(yàn)組。瓊脂糖凝膠電泳顯示條帶清晰，提取濃度和純度都符合要求，滿足后續(xù)試驗(yàn)要求。

表2 二烯丙基二硫醚對(duì)大腸桿菌的最低抑菌濃度Table2 Minimum antibacterial concentration of diallyl disulfide

圖1 DADS對(duì)大腸桿菌生長曲線的影響Fig.1 Effect of Diallyl disulfide on the growth curve of E.coli

2.3 二烯丙基二硫醚對(duì)大腸桿菌毒力基因表達(dá)的影響

探究二烯丙基二硫醚（DADS）對(duì)非O157產(chǎn)志賀毒性大腸桿菌毒力因子stx2，eaeA，ehxA表達(dá)的影響。結(jié)果如圖3所示，隨著二烯丙基二硫醚添加量的增加，3種毒力基因的相對(duì)表達(dá)量都呈濃度依賴性。與未添加DADS組相比，DADS濃度為1/4MIC時(shí)，stx2基因的表達(dá)量降低了90.37%，有顯著差異性，而當(dāng)濃度為1/32MIC時(shí)，stx2基因的表達(dá)量也下降了43.42%，當(dāng)濃度為1/4MIC時(shí)，eaeA基因的相對(duì)表達(dá)量降低87.05%，ehxA基因降低了91.74%。

圖2 大腸桿菌總RNA瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 Agarose gel electrophoresis of RNA samples for E.coli

圖3 DADS對(duì)大腸桿菌相關(guān)毒力基因表達(dá)的影響Fig.3 Effect of DADS on related virulence genes of E.coli

不同抑制劑對(duì)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的毒力基因均有抑制作用，對(duì)革蘭氏陰性菌毒力基因表達(dá)的影響：馬宗兵等[19]在研究大蒜素對(duì)副豬嗜血桿菌抑制作用機(jī)理時(shí)，通過定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，通過8μg/mL和16μg/mL大蒜素處理的副豬嗜血桿菌，溶血毒素基因hhdA、mviN以及抗生素外排泵基因norM表達(dá)下調(diào)，結(jié)果說明含硫化合物對(duì)副豬嗜血桿菌有明顯的抑制效果，并且可抑制溶血毒素、毒力因子以及抗生素外排泵等基因的表達(dá)。Crane等[20]以鋅為抑制劑研究產(chǎn)志賀毒性大腸桿菌stx基因及其相關(guān)蛋白的表達(dá)，濃度為0.4mmol/L的鋅可以抑制stx1和stx2的表達(dá)，抑制率達(dá)到90%以上。對(duì)革蘭氏陽性菌毒力基因表達(dá)的影響：Shi等[21]得到類似結(jié)論，在37℃和4℃下，Nisin對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌毒力基因inlA，prfA，plcA和hlyA均有一定程度的抑制，Nisin濃度越高，毒力基因表達(dá)量越小；亞抑菌濃度魚腥草醇提物對(duì)革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌α-溶血素呈劑量依賴式抑制[22]。

此外，其它研究結(jié)果表明，外源抑制劑不僅對(duì)大腸桿菌有應(yīng)答，對(duì)真核細(xì)胞也有抑制作用，如Di等[23]得到結(jié)論，在研究果膠寡糖對(duì)大腸桿菌O157∶H7黏附性和HT29細(xì)胞志賀毒素毒性影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，在HT29細(xì)胞中POS1抑制志賀毒素效果最好，并呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。

圖4 DADS對(duì)大腸桿菌游動(dòng)能力的影響Fig.4 Effect of DADS on swimming ability of E.coli

圖5 DADS對(duì)大腸桿菌游動(dòng)能力的抑制率Fig.5 The inhibition rate of DADS on swimming ability of E.coli

2.4 DADS對(duì)大腸桿菌游動(dòng)能力的抑制作用

添加不同濃度的DADS對(duì)大腸桿菌游動(dòng)能力的影響如圖4和圖5所示，亞抑菌濃度下的DADS即可抑制大腸桿菌的游動(dòng)能力，并呈濃度依賴性。與對(duì)照組相比，當(dāng)添加1/4MIC的DADS時(shí)，即0.5 mmol/L，大腸桿菌產(chǎn)生的擴(kuò)散圈直徑為（24.6±0.6）mm，抑制率達(dá)到 61.18%，添加 1/8MIC、1/16MIC和1/32MIC的DADS，大腸桿菌擴(kuò)散圈的抑制率分別達(dá)到52.42%，29.38%，8.86%。隨著DADS添加濃度的增加，大腸桿菌的遷移能力減小，遷移距離縮短，游動(dòng)能力降低。

在其它外源抑制劑對(duì)微生物游動(dòng)能力的研究中，Abreu等[15]也得到類似結(jié)論，以異硫氰酸酯類的異硫氰酸苯乙酯（PITC）為原料，PITC抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的游動(dòng)能力。游動(dòng)能力與鞭毛基因有關(guān)，楊丙燁等[24]在研究西瓜細(xì)菌性果斑病菌鞭毛基因fliS的功能分析時(shí)，得到結(jié)論：即鞭毛基因fliS對(duì)果斑病菌鞭毛絲的形成、游動(dòng)性、菌膜形成能力、生長速率、菌落形態(tài)、致病性等均有調(diào)控作用。游動(dòng)能力和黏附基因也有關(guān)，Iversen等[25]研究腸出血性大腸桿菌毒力基因調(diào)控得到的結(jié)論。Li等[26]研究表明1/16MIC和1/32MIC的石榴皮對(duì)沙門氏菌群體感應(yīng)系統(tǒng)（QS）、毒力因子有抑制作用，對(duì)沙門氏菌的游動(dòng)能力有明顯的抑制作用，結(jié)果表明，石榴皮作為群體感應(yīng)抑制劑對(duì)毒力基因和游動(dòng)能力都有一定的調(diào)控作用。

圖6 DADS對(duì)大腸桿菌游動(dòng)能力抑制作用Fig.6 Inhibition of the swimming ability of E.coli by DADS

3 結(jié)論

經(jīng)測定，DADS的MIC是2mmol/L。在不同濃度二烯丙基二硫醚（DADS）的作用下，非O157產(chǎn)志賀毒性大腸桿菌的生長受到不同程度的抑制，當(dāng)DADS的濃度為MIC時(shí)，大腸桿菌完全不生長；當(dāng)濃度為1/2MIC時(shí)，抑制大腸桿菌生長；當(dāng)濃度為1/4MIC到1/32MIC時(shí)，對(duì)大腸桿菌沒有抑制作用。添加亞抑菌濃度的二烯丙基二硫醚后，與對(duì)照相比，stx2、eaeA和ehxA基因均下調(diào)，并呈濃度依賴性。隨著DADS添加濃度的增加，大腸桿菌的游動(dòng)能力減小，呈濃度依賴性。本試驗(yàn)以含硫香料作為健康、高效的抑菌劑，為今后應(yīng)用于食品行業(yè)提供理論依據(jù)，為研究致病性大腸桿菌提供了新的思路。