霍彩云，霍 華，唐玉玲，郭曉桐，楊光輝，李穎鑫，王書揚(yáng)，胡艷欣

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀 100193；2.北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，北京 海淀 100097；3.呂梁市中心醫(yī)院，山西 呂梁 033000)

外泌體是指由磷脂雙分子層膜包裹蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸形成的囊泡結(jié)構(gòu)，可以由幾乎所有種類的細(xì)胞分泌，并存在于各種體液之中，包括血液、尿液、唾液、乳汁、羊水、惡性腫瘤、腹水等，是細(xì)胞間信號運(yùn)輸?shù)闹饕d體[1]。近年來，由于其獨(dú)特的生物學(xué)功能，使外泌體被越來越多的科學(xué)家關(guān)注，并且常被用于腫瘤診斷的早期檢測標(biāo)志物和疾病的臨床治療中。本文從外泌體的分離鑒定、生物學(xué)功能以及在疾病中的臨床應(yīng)用等方面加以綜述，以期為外泌體在臨床中的診斷和治療提供參考依據(jù)。

1 分離

目前對外泌體的分離主要采用4種方法，包括分級超速離心法、梯度密度離心法、超濾法和使用試劑盒提取。其中，分級超速離心法是分離高純度外泌體的經(jīng)典方法，具有操作簡單、技術(shù)難度低等優(yōu)勢。由于活細(xì)胞釋放多樣的胞外囊泡，例如外泌體、微泡或凋亡小體等，其具有不同的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性[2]。外泌體直徑約為50～100 nm，微囊泡尺寸直徑約為100～1 000 nm，凋亡細(xì)胞所釋放的凋亡小體直徑約為50～1 000 nm，通常可通過分級超速離心法將這些尺寸不等的囊泡分離出。當(dāng)離心力為2 000 g時(shí)可分離出大的囊泡，而離心力為100 000 g 時(shí)即分離出尺寸小于150 nm的囊泡，可稱為外泌體。然而，有文獻(xiàn)證實(shí)這些尺寸小于150 nm的囊泡不僅是外泌體，還包括其他的囊泡[3]。梯度密度離心法、超濾法也經(jīng)常用于外泌體的提取，但是其純度較超速離心法低。然而，這3種方法均對樣本的需求量大且提取過程中外泌體的損失量較多，對于如血清等稀少樣品而言，存在一定的缺陷。隨著技術(shù)的進(jìn)步，外泌體抽提試劑盒被用于樣品的外泌體分離中，尤其適用于稀少樣本或外泌體分泌量少的樣本。該試劑盒通?；诰酆衔锍恋矸ǎ硎求w積排阻的聚合物通過奪取水分子使外泌體溶解度降低，進(jìn)而在低速離心條件下發(fā)生沉降。盡管該方法具有快速、靈敏、節(jié)約樣本和產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)，但因其得到的外泌體純度低而影響了外泌體功能等研究結(jié)果的可信度。因此，這4種方法各有利弊，在實(shí)際中應(yīng)根據(jù)試驗(yàn)要求選用合適的提取方法，以期分離到高純度的外泌體。

2 鑒定

外泌體鑒定可分為3個層面：形態(tài)學(xué)特征、蛋白標(biāo)志物、粒徑和濃度。首先，外泌體的鑒定可通過電鏡法來進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。在普通透射電鏡下，外泌體多位于細(xì)胞外周并呈典型的扁平球狀圓形膜性囊泡結(jié)構(gòu)，其粒子大小和部分形態(tài)結(jié)構(gòu)與流感病毒極其相似[4-5]。近年來，冷凍電鏡技術(shù)也常被用于囊泡的形態(tài)學(xué)研究中，該方法是在普通透射電鏡上加裝樣品冷凍設(shè)備，應(yīng)用冷凍固定術(shù)將樣品冷卻到液氮溫度，用于觀察蛋白、生物切片等對溫度敏感的樣品，可以降低電子束對樣品的損傷，減小樣品的形變，從而得到更加真實(shí)的樣品形貌。該方法不僅可觀察囊泡的外部結(jié)構(gòu)、細(xì)胞膜和內(nèi)腔，還可清晰地觀察脂質(zhì)雙分子層和囊泡內(nèi)部結(jié)構(gòu)。已有研究通過該方法證實(shí)了單一類型細(xì)胞分泌的外泌體具有形態(tài)多樣性，發(fā)現(xiàn)人源肥大細(xì)胞釋放的外泌體在冷凍電鏡下呈現(xiàn)多種不同的形態(tài)特征，根據(jù)其形態(tài)差異可將其分為9個亞群，例如含脂質(zhì)雙分子層的圓形的單一囊泡、大囊泡內(nèi)和小囊泡共存的圓形或略長方形的雙囊泡和含脂質(zhì)雙分子層的細(xì)長的管狀囊泡等，而這些不同亞群具有不同的功能和理化性質(zhì)[6]。

此外，外泌體的進(jìn)一步鑒定可通過Western Blot技術(shù)加以輔助。外泌體包含的蛋白質(zhì)成分具有多樣性，很大程度上取決于其來源的細(xì)胞種類。由于維持外泌體生物發(fā)生、結(jié)構(gòu)及功能的蛋白質(zhì)組成具有保守性，包括生物大分子運(yùn)輸所需的內(nèi)含體分選轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體的組成蛋白Alix和TSG101、四跨膜蛋白超家族的CD63、CD9和CD81等，這些蛋白在外泌體中具有較高的豐度，常被用作研究外泌體的特異性標(biāo)志物[7-8]。

近年來，納米顆粒追蹤分析(NTA)技術(shù)也被用于外泌體的表征鑒定。該技術(shù)旨在對10～2 000 nm范圍內(nèi)的納米顆粒進(jìn)行快速實(shí)時(shí)動態(tài)檢測，測量參數(shù)包括顆粒粒徑、散射光強(qiáng)、濃度等。納米顆粒跟蹤分析儀的光束用于照射外泌體樣品中的顆粒，其攝像頭能夠捕捉布朗運(yùn)動下移動顆粒的視頻文件，并通過分析技術(shù)軟件單獨(dú)追蹤多個顆粒并利用愛因斯坦方程式計(jì)算顆粒濃度和粒度分布。相比于其他表征方式，NTA技術(shù)不破壞外泌體原始狀態(tài)，并且可搭配相應(yīng)濾光片用于測量熒光抗體(如CD9,CD63,CD81等)標(biāo)記的外泌體來確定外泌體純度，而且具有檢測速度快的特點(diǎn)。有研究利用該技術(shù)成功的發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外囊泡在機(jī)體內(nèi)的分布依賴于細(xì)胞類型、人為注射囊泡的方式和劑量以及靶器官等因素[9]。

3 生物學(xué)功能

外泌體承擔(dān)著細(xì)胞間通訊分子的角色，攜帶著多種蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)等信息物質(zhì)，廣泛參與了細(xì)胞間物質(zhì)和信息的傳遞，在細(xì)胞間交流、免疫應(yīng)答及腫瘤發(fā)生、發(fā)展等生理和病理過程中起重要的作用。外泌體經(jīng)胞吐方式分泌后，其攜帶物質(zhì)可影響局部微環(huán)境或通過體液循環(huán)在遠(yuǎn)離母細(xì)胞的部位發(fā)揮作用[10]。外泌體作用于靶細(xì)胞參與細(xì)胞間信息傳遞主要有3種方式：一是外泌體上特殊的表面蛋白可與靶細(xì)胞的受體結(jié)合，而不需要被靶細(xì)胞攝取，進(jìn)行跨膜信號的傳導(dǎo)(如抗原呈遞的過程)；二是與細(xì)胞膜融合，攜帶的蛋白質(zhì)和核酸被轉(zhuǎn)運(yùn)至靶細(xì)胞內(nèi)；三是以胞吞形式被攝取。當(dāng)進(jìn)入靶細(xì)胞后，外泌體所攜帶的信息物質(zhì)發(fā)揮其重要功能，外泌體中的mRNA進(jìn)入到靶細(xì)胞后，能利用靶細(xì)胞的蛋白質(zhì)翻譯系統(tǒng)，翻譯成相應(yīng)蛋白，從而調(diào)控靶細(xì)胞的功能。研究表明，結(jié)腸直腸癌細(xì)胞分泌的外泌體含細(xì)胞周期相關(guān)的mRNA，可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，并在局部和遠(yuǎn)處的轉(zhuǎn)移位點(diǎn)形成有利于轉(zhuǎn)移和侵襲的細(xì)胞微環(huán)境[11-12]。除此之外，利用二代測序等技術(shù)發(fā)現(xiàn)，外泌體中還包含了小分子RNA(microRNA)、長鏈非編碼RNA (IncRNA)、線粒體DNA (mtDNA)、雙鏈DNA (dsDNA)、基因組DNA (gDNA) 和環(huán)狀RNA (cirRNA)等特殊核酸，對靶細(xì)胞的基因表達(dá)和生物學(xué)功能起到調(diào)控作用[13-15]。例如，肝細(xì)胞癌來源的外泌體miR-21促進(jìn)成纖維細(xì)胞向腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAF)的轉(zhuǎn)化，活化的CAF通過分泌血管生成細(xì)胞因子進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[16]。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的主要參與者和協(xié)調(diào)者，可極化為M1型或M2型巨噬細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)，M2型巨噬細(xì)胞衍生的外泌體高表達(dá)的miR-21-5p 和miR-155-5可介導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲[17]。最新研究表明，巨噬細(xì)胞衍生的外泌體可將miR-223這種microRNA遞送至卵巢癌細(xì)胞，通過miR-223/PTEN-PI3K/AKT信號傳導(dǎo)途徑引起腫瘤細(xì)胞化療耐藥性[18]。cirRNA被認(rèn)為是腫瘤發(fā)展的關(guān)鍵因子，有研究發(fā)現(xiàn)，高轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞可通過分泌含有circCPTGR1的外泌體來促進(jìn)較低轉(zhuǎn)移或無轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲能力[19]。

不同類型細(xì)胞分泌的外泌體中蛋白質(zhì)的種類也存在差異，例如人類樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells,DC細(xì)胞)產(chǎn)生的外泌體含有主要組織相容性復(fù)合體(Major histocompatibility complex,MHC)I類和II類分子，這類分子與外源性抗原的肽段結(jié)合，使T淋巴細(xì)胞有效活化，從而誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞的免疫應(yīng)答，在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[20]。最新研究發(fā)現(xiàn)，外泌體介導(dǎo)的干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白IFITM2向樹突狀細(xì)胞的傳遞抑制了IFNα途徑的活化并阻斷外源IFNα的抗慢性乙型肝炎功效[21]。

在一些病毒感染過程中，外泌體可以攜帶病毒的核酸、蛋白質(zhì)甚至整個病毒粒子，產(chǎn)生影響靶細(xì)胞生長，增強(qiáng)靶細(xì)胞的易感性，創(chuàng)造有利于病毒感染的微環(huán)境等效應(yīng)。有的病毒可以讓外泌體攜帶病毒需要的細(xì)胞表面受體，增加易感細(xì)胞的類型，擴(kuò)大病毒的感染范圍。如肝癌感染的細(xì)胞具有針對性，需要宿主細(xì)胞上存在特異的受體(CD4分子和輔助受體CXCR4或CCR5)，外泌體可以攜帶來自宿主細(xì)胞的CXCR4或CCR5，將其傳遞給受體陰性的細(xì)胞，使其產(chǎn)生易感性，最終促進(jìn)小鼠肝癌細(xì)胞的遷移、侵襲和淋巴管的生成[22]。在丙肝病毒(Hepatitis C virus,HCV)的研究中發(fā)現(xiàn)，HCV可以留存在晚期胞內(nèi)體的腔內(nèi)囊泡中，并通過外泌體直接將整個病毒粒子或病毒的RNA和蛋白遞送至臨近的細(xì)胞來擴(kuò)大感染[23-24]。

4 外泌體在疾病中的應(yīng)用

作為細(xì)胞間物質(zhì)或信息交流的重要載體，外泌體因其獨(dú)特的生物學(xué)結(jié)構(gòu)和功能被廣泛的應(yīng)用于疾病的診斷和治療中。外泌體攜帶有生物信息物質(zhì)，可以作為一種生物標(biāo)志物，用于心血管疾病、腎臟疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和癌癥的早期篩查以及診斷中。其中，外泌體在實(shí)體腫瘤領(lǐng)域研究比較廣泛。相比正常細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞可分泌更多的外泌體，并且缺氧微環(huán)境促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的外泌體釋放和誘導(dǎo)促血管生成微囊泡的脫落增加[25]。在癌癥的早期檢測中，腫瘤衍生的外泌體攜帶有腫瘤特定的蛋白質(zhì)，有助于腫瘤的篩選和診斷。在某些癌癥(如結(jié)腸直腸癌、胰腺癌和卵巢癌)中，外泌體中腫瘤相關(guān)性蛋白性生物標(biāo)志物的類型和表達(dá)水平與癌癥類別的存在和進(jìn)展密切相關(guān)，研究證明腸道間質(zhì)瘤分泌的外泌體富含豐富的診斷標(biāo)志，如CD34和ENG等[26-27]。由于外泌體具有體積小、含脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)、良好的生物相容性、可通過血腦屏障等優(yōu)點(diǎn)，使其成為先進(jìn)藥物遞送和治療的新一代內(nèi)源性納米材料[28]。例如在腫瘤治療中，針對特定癌癥類型的癌細(xì)胞的表面受體，設(shè)計(jì)高親和的配體來修飾裝載了藥物的外泌體，能達(dá)到靶向遞藥的效果[29]。在組織損傷和修復(fù)過程中，外泌體也發(fā)揮關(guān)鍵性作用。干細(xì)胞及其分泌的外泌體在促進(jìn)骨再生方面具有相似的作用，有研究者發(fā)現(xiàn)，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體可通過缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α介導(dǎo)的血管生成促進(jìn)大鼠骨折愈合[30]。

5 展望

外泌體不僅是細(xì)胞分泌的內(nèi)容物，同時(shí)也代表了一種復(fù)雜的胞內(nèi)處理特異性分子的方式，已逐漸成為疾病相關(guān)研究的熱點(diǎn)。由于獨(dú)特的生物學(xué)特性和在體內(nèi)的廣泛分布，使外泌體成為用于疾病診斷和治療的有力“武器”，在相關(guān)臨床診斷中具備廣闊的應(yīng)用前景。然而，外泌體的分子機(jī)制、檢測和治療方法還需進(jìn)一步研究。例如，臨床中用以準(zhǔn)確快速區(qū)分外泌體和其他囊泡的平臺仍未健全，在未來研究中仍需探索新型高度靈敏地鑒定不同種類囊泡的方法。此外，研究能夠提取大量外泌體的新策略、提高外泌體靶向給藥的效率等依然是外泌體用于癌癥診斷和治療領(lǐng)域亟待解決的問題。隨著外泌體的不斷深入研究，我們相信其在疾病診斷和治療中將有著廣闊的發(fā)展前景。