李 帥，鮑翠玉，李 晶

(湖北科技學院1. 藥學院、2. 糖尿病心腦血管病變湖北省重點實驗室，湖北 咸寧 437100)

據報道，高脂刺激可誘發(fā)心肌細胞出現內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)異常激活或線粒體介導的凋亡[1]。吲哚三甲醇(indole-3-carbinol，I3C)屬于如甘藍、白菜等十字花科蔬菜中的有效成分[2,3]，I3C對心肌細胞脂毒性損傷的保護作用及其機制目前尚無報道。本研究將探討I3C對高脂所致心肌細胞損傷的保護作用及其機制與ERS-線粒體凋亡通路的相關性。

1 材料與方法

1.1 材料H9c2心肌細胞，購自上海美軒生物科技有限公司；活性氧(reactive oxygen species，ROS)檢測試劑盒購自上海貝博生物科技公司；線粒體膜電位檢測試劑盒購自上海聯邁生物工程有限公司；胎牛血清購自北京裕恒豐科技有限公司；MTT檢測試劑盒、I3C、PA購自Sigma公司；一抗和二抗購自CST公司。

1.2 方法

1.2.1MTT檢測 細胞加入96孔板，37 ℃內放置24 h，細胞貼壁后分組給藥進行孵育，加入 MTT孵育4 h，再加入 150 μL DMSO，振蕩混勻后，檢測570 nm處OD值。

1.2.2ROS水平檢測 6孔板內加入玻片，并加入細胞在37℃二氧化碳培養(yǎng)箱內放置24 h，細胞貼壁后分組給藥，經洗滌、固定、再洗滌后，加入DHE(10 mmol·L-1)探針，37℃孵育30 min，洗滌、封片后檢測細胞內熒光。

1.2.3線粒體膜電位檢測 6孔板內加入玻片，并加入細胞在37℃二氧化碳培養(yǎng)箱內放置24 h，細胞貼壁后分組給藥，經洗滌、固定、再洗滌后，加入JC-1探針，37℃孵育20 min，洗滌、封片后檢測細胞內熒光。

1.2.4免疫印跡法檢測 取20 μL的蛋白樣品，分組加入樣品槽內，進行蛋白電泳，并經轉模及封閉后，進行下列抗體的孵育：GRP78、CHOP、p-PERK、p-IRE1、Bax、cleaved caspase-3、Bcl-2。一抗孵育結束后進行二抗孵育，經ECL化學發(fā)光，凝膠成像系統(tǒng)檢測蛋白。

1.3 統(tǒng)計學方法數據采用GraphPad Prism5軟件進行統(tǒng)計學分析，組間差異的分析采用t檢驗和單因素方差分析。

2 結果

2.1 I3C對高脂誘導的心肌細胞增殖能力低下的影響我們用MTT實驗觀察了心肌細胞增殖率，發(fā)現PA刺激心肌細胞出現濃度依賴性及時間依賴性降低趨勢，尤其PA在0.4 mmol·L-1刺激24 h時心肌細胞增殖率出現明顯降低，并具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。I3C在200 μmol·L-1時，細胞增殖率明顯恢復至正常水平，因此在下一步實驗中I3C濃度設置為200 μmol·L-1。

2.2 I3C對高脂誘導的細胞內氧化應激及線粒體膜電位的影響ROS用紅色熒光標記，PA組出現顯著增強，PA+I3C組較PA組顯著降低，說明PA顯著增加細胞內氧化應激水平，I3C預處理可以逆轉此改變；另一組數據表明，PA組線粒體膜電位顯著下降，I3C預處理可以逆轉此改變。

2.3 I3C對高脂誘導的心肌細胞ERS-線粒體凋亡通路的影響PA組GRP78、CHOP、p-PERK及p-IRE1蛋白表達明顯升高(P<0.05)；預處理I3C可以顯著降低上述蛋白的表達水平(P<0.05)。PA組Bcl-2水平明顯下降(P<0.05)，Bax、cleaved caspase-3水平均明顯升高(P<0.05)，而預處理I3C組可以明顯逆轉上述改變(P<0.05)。

3 討論

本研究證實，心肌細胞對脂毒性損傷損傷比較敏感，會導致生存率的降低及氧化應激產物的增加，最終誘發(fā)凋亡，預處理吲哚三甲醇可以明顯逆轉這些改變，有效抑制心肌細胞的損傷。

我們進一步觀察了ERS-線粒體凋亡通路和吲哚三甲醇作用機制的相關性。據報道，ERS的活化與線粒體細胞凋亡通路有一定相關性[4]。本研究結果提示，當心肌細胞受到脂毒性損傷時，細胞內ERS相關蛋白及線粒體促凋亡通路相關蛋白表達出現顯著增加趨勢，抗凋亡蛋白表達明顯減少，而吲哚三甲醇預處理可以明顯逆轉上述變化。

綜上，I3C能成功逆轉高脂所致的心肌細胞增殖力下降，緩解氧化應激損傷及線粒體功能紊亂，本研究證實此作用與ERS-線粒體凋亡通路的調控密切相關。