方芳(江西省地質(zhì)調(diào)查研究院，江西 南昌 330000)

0 引言

砷元素作為常見的有毒非金屬元素之一，極易被動(dòng)植物吸收并積累到體內(nèi)。因其具有極大的致毒致癌性，威脅到人體的生命健康，所以越來(lái)越受到社會(huì)的廣泛關(guān)注。而砷在動(dòng)植物體內(nèi)又常以多種形態(tài)存在，不同形態(tài)砷之間的毒性差異較大[1]。對(duì)植物樣品中的無(wú)機(jī)砷分析測(cè)定在保護(hù)環(huán)境和人體健康中起著重要作用，因此，為了真實(shí)反映植物中砷的安全性，對(duì)砷元素的各種形態(tài)進(jìn)行有效分離和檢測(cè)是非常必要的。

目前，液相色譜-原子熒光光譜法作為當(dāng)前我國(guó)無(wú)機(jī)砷測(cè)定最常用的檢測(cè)方法，也是國(guó)家食品安全標(biāo)準(zhǔn)中使用的第一測(cè)定方法[2]。該法測(cè)試原理是在植物試樣經(jīng)稀硝酸前處理提取出無(wú)機(jī)砷化合物，再以液相色譜柱分離，分離后的目標(biāo)化合物在酸性環(huán)境下與硼氫化鉀反應(yīng)，生成氣態(tài)砷化合物，最后以原子熒光光譜儀進(jìn)行測(cè)定[3]。

1 無(wú)機(jī)砷形態(tài)分離方法——高效液相色譜法

目前，對(duì)于砷形態(tài)分析的常用分離方法主要有色譜法、溶劑萃取法、離子交換法、有氫化物發(fā)生法等。而色譜法是當(dāng)前對(duì)砷形態(tài)分析研究中應(yīng)用最為廣泛的分離方法，色譜法又分為液相色譜和氣相色譜，在對(duì)砷的形態(tài)分析過(guò)程中，液相色譜法比氣相色譜法更具有優(yōu)越性。其一，在液相色譜中分析樣品不需要衍生，在正常室溫下經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單處理就可以投入使用。這樣不僅能夠減少植物樣品在檢測(cè)過(guò)程中所受的污染程度以及氧化過(guò)程中的形態(tài)轉(zhuǎn)化誤差，還能夠節(jié)約對(duì)于樣品的分析檢時(shí)間，一定程度上增加分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，提高分析數(shù)據(jù)的可靠性。其二，選擇液相色譜法進(jìn)行測(cè)定，可以有多種類的固定相和流動(dòng)相作為分離介質(zhì)以供選擇。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，根據(jù)不同樣品的性質(zhì)來(lái)選擇適當(dāng)?shù)纳V體系，就使實(shí)驗(yàn)過(guò)程在技術(shù)分離方面的選擇更具有靈活性。色譜分離法以其簡(jiǎn)單快捷的操作以及可與其他檢測(cè)技術(shù)多樣性關(guān)聯(lián)使用進(jìn)行在線分析，成為目前進(jìn)行砷形態(tài)分析過(guò)程中最常用的分離方法[4]。

2 液相色譜法與原子熒光光譜聯(lián)用技術(shù)

原子熒光光譜法是近幾年砷檢測(cè)過(guò)程中運(yùn)用最多的檢測(cè)方法，其原理是利用原子熒光譜線的波長(zhǎng)和強(qiáng)度進(jìn)行物質(zhì)的定性以及定量分析方法，是介于原子吸收光譜和原子發(fā)射光譜之間的光譜分析技術(shù)，具有檢出限較低、靈敏度高，譜線簡(jiǎn)單、干擾較少，分析校準(zhǔn)曲線線性范圍寬，實(shí)現(xiàn)多元素同時(shí)測(cè)定的優(yōu)點(diǎn)。原子熒光光譜法與液相色譜技術(shù)聯(lián)用，能夠有效改善傳統(tǒng)分析技術(shù)檢測(cè)中對(duì)多形態(tài)元素檢測(cè)不足的缺點(diǎn)，利用液相色譜分離技術(shù)分離不同元素的不同形態(tài)，再利用原子熒光光譜技術(shù)來(lái)對(duì)檢測(cè)樣本進(jìn)行定量檢測(cè)，在砷、汞等有毒有害元素及其化合物的形態(tài)分析檢測(cè)方面更具有競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)[5]。

3 確立研究對(duì)象

在實(shí)驗(yàn)方法的研究過(guò)程中，具有代表性確立代表性的實(shí)驗(yàn)對(duì)象對(duì)選擇研究方法優(yōu)化研究過(guò)程具有重要作用，因此在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中選取代表性的植物樣品作為研究對(duì)象尤為重要。而植物樣品種類繁多，要對(duì)多種不同植物種類中的無(wú)機(jī)砷形態(tài)進(jìn)行分析，其實(shí)驗(yàn)過(guò)程更為復(fù)雜困難。而由于直接測(cè)量樣品中的總砷含量操作過(guò)程較為方便簡(jiǎn)單，且樣品中總砷含量高有利于對(duì)樣品進(jìn)行分析比較，所以基于前人對(duì)不同植物中總砷含量的研究總結(jié)，我們選取總砷含量最高的蕨類植物作為方法研究樣品。

4 材料與方法

4.1 儀器與試劑

儀器：SAP-20液相色譜-原子熒光聯(lián)用儀(HG-AFS)(北京吉天儀器有限公司)；PRPX-100陰離子交換色譜柱(250×4.6mm，30cm，100A)、砷空心陰極燈、超生清洗器、離心管、燒杯、容量瓶等器皿。

試劑：磷酸二氫銨(分析純)、硼氫化鉀(分析純)、氫氧化鉀(分析純)、硝酸、鹽酸、氨水(優(yōu)級(jí)純)、正己烷。

4.2 實(shí)驗(yàn)方法

4.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

亞砷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取三氧化二砷0.0132g，加100g/L氫氧化鉀溶液1mL和少量水溶解，轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中，加入適量鹽酸調(diào)整其酸度近中性，加水稀釋至刻度，4℃保存，保存一年?；蛸?gòu)買經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)溶液物質(zhì)。

砷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取砷酸二氫鉀0.0240g，水溶解，轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中并用水稀釋至刻度，4℃保存，保存一年。

五價(jià)砷和三價(jià)砷混合標(biāo)準(zhǔn)使用液：分別準(zhǔn)確吸取1.0mL三價(jià)砷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液、1.0mL五價(jià)砷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于100mL容量瓶中，加水稀釋并定容至刻度，現(xiàn)用現(xiàn)配。

4.2.2 儀器條件

液相色譜條件：流動(dòng)相15mmol/L磷酸二氫銨，pH=6.0；等度流速為1mL/min；梯度流速為0～5min:1mL/min；進(jìn)樣量為100μL。

原子熒光條件：原子化器負(fù)高壓為320V；砷空心陰極燈總電流為90mA；鹽酸作為載流適宜濃度為20%；30g/L硼氫化鉀作為還原劑；載氣流速為400mL/min；輔助氣流速為400mL/min。

4.2.3 前處理方法的確立

首先稱取大約5g的待測(cè)植物樣品置于30mL的檢測(cè)離心管中，接著向待測(cè)樣品中加入10mL1:1甲醇水并將其混合均勻，用超聲波以5000r/min的轉(zhuǎn)速進(jìn)行超聲提取20min, 離心，20min之后將離心后離心管中樣品的上清液置于提前準(zhǔn)備好的小燒杯中，并在離心后的樣品殘?jiān)屑尤?mL甲醇水混合均勻繼續(xù)以5000r/min的轉(zhuǎn)速超聲提取20min和離心20min, 最后重復(fù)兩次上述提取過(guò)程。將提取過(guò)程中轉(zhuǎn)移至小燒杯后的上清液進(jìn)行氮吹處理，靜待燒杯中的上清液體積小于氮吹前的1/2體積時(shí)即可停止。靜置后將之前實(shí)驗(yàn)中的燒杯溶液全部轉(zhuǎn)移至之前準(zhǔn)備好的20mL的比色管中，再加超純水進(jìn)行定容。最后選取相關(guān)濾器來(lái)提取實(shí)驗(yàn)所需的樣本液，經(jīng)過(guò)水相濾膜過(guò)濾后進(jìn)行上機(jī)測(cè)定。

4.3 方法驗(yàn)證

4.3.1 檢出限

檢出限是指生物樣品中按照分析方法的要求進(jìn)行提取處理并檢測(cè)，能區(qū)分于噪聲的最低檢出濃度。檢出限的對(duì)應(yīng)響應(yīng)值至少為噪聲的3～5倍。本實(shí)驗(yàn)過(guò)程通過(guò)多次對(duì)樣本進(jìn)行空白重復(fù)，得到儀器噪聲的平均值，并在三價(jià)砷和五價(jià)砷濃度為范圍內(nèi)制作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，找到了對(duì)應(yīng)無(wú)機(jī)砷的儀器測(cè)量度，得到無(wú)機(jī)砷的最小檢測(cè)濃度，結(jié)果表明標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，檢出限符合檢測(cè)需求。

4.3.2 方法準(zhǔn)確度

為了進(jìn)一步檢測(cè)此研究方法的準(zhǔn)確性和精密度，在空白植物樣本中加入濃度為20.00μg/L的無(wú)機(jī)砷形態(tài)進(jìn)行連續(xù)進(jìn)樣，經(jīng)過(guò)甲醇水超聲提取后，測(cè)量植物中的無(wú)機(jī)砷加標(biāo)回收率。因植物樣本中本身含水量大，增加了基體的干擾性，所以樣本中無(wú)機(jī)砷回收率達(dá)到80%即可達(dá)到要求。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)并對(duì)樣本中的無(wú)機(jī)砷微量進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，通過(guò)本方法檢測(cè)的回收率達(dá)到80%，滿足形態(tài)分析要求，從而證明了此研究方法有較高的準(zhǔn)確度。

4.3.3 方法重復(fù)性

以砷濃度為100μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液為基礎(chǔ)，連續(xù)測(cè)定四次，通過(guò)分析其峰高測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同一植物樣本的四次測(cè)定中，無(wú)機(jī)砷的測(cè)定值相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差都控制在5%以內(nèi)，這表明此研究方法重復(fù)性好，更夠滿足植物樣品中無(wú)機(jī)砷的檢測(cè)要求。

5 結(jié)果與分析

5.1 流動(dòng)相優(yōu)化處理

在液相色譜分離中，廣泛使用的流動(dòng)相有磷酸鹽、有機(jī)二元酸、檸檬酸鹽等，將這些溶液與其相應(yīng)的酸進(jìn)行混合。本次實(shí)驗(yàn)過(guò)程選擇磷酸銨鹽緩沖液作為流動(dòng)相，考察pH值為6.0時(shí)不同濃度的流動(dòng)相對(duì)無(wú)機(jī)砷保留時(shí)間的影響。經(jīng)實(shí)驗(yàn)可知，當(dāng)pH為6.0時(shí)，無(wú)機(jī)砷的保留時(shí)間隨流動(dòng)相濃度的變化而變化：當(dāng)流動(dòng)相的濃度增加大于25mmol/L時(shí)，無(wú)機(jī)砷的保留時(shí)間緩慢縮短，無(wú)機(jī)砷不能得到很好的分離；當(dāng)流動(dòng)相濃度小于15mmol/L時(shí)，無(wú)機(jī)砷形態(tài)得到了清晰的分離；而當(dāng)流動(dòng)相濃度較低為10mmol/L時(shí)，由于保留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，不利于對(duì)其定量。因此選擇15mmol/L作為流動(dòng)相的優(yōu)化濃度。

5.2 提取劑優(yōu)化處理

不同于總砷的檢測(cè)方法，為了在檢測(cè)過(guò)程中不造成對(duì)有機(jī)砷的轉(zhuǎn)化，無(wú)機(jī)砷的檢測(cè)過(guò)程一般不對(duì)植物樣品進(jìn)行消解處理，因此，提取效率是準(zhǔn)確測(cè)定無(wú)機(jī)砷的關(guān)鍵因素[6]。提取劑作為實(shí)驗(yàn)過(guò)程前處理階段保證所測(cè)樣品無(wú)機(jī)砷形態(tài)高提取率的關(guān)鍵，也是檢測(cè)實(shí)驗(yàn)方法準(zhǔn)確度至關(guān)重要的因素。因此在本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中選取最優(yōu)提取劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)尤為重要。在提取劑優(yōu)化處理過(guò)程中，采用超聲提取方式進(jìn)行優(yōu)化，并分別考察甲醇溶液、乙醇溶液、鹽酸溶液等提取劑對(duì)植物樣本中砷形態(tài)的總提取量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，乙醇溶液溶解的有機(jī)物較多，雖然能夠輕松提取樣品中的可溶性有機(jī)物，但其強(qiáng)溶解性也使樣品溶解液變色且粘稠，這種情況會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果中對(duì)樣品的提純不完全，不利于樣品無(wú)機(jī)砷的提取。而無(wú)論對(duì)于陸生植物還是水生植物，甲醇水樣品提取率都較為理想，且操作過(guò)程簡(jiǎn)單，因而被廣泛使用。用體積比為1:1、1:2、2:1、3:1的甲醇水對(duì)蕨類植物進(jìn)行提取后測(cè)量總砷含量可得，在一定操作范圍內(nèi)，樣品中無(wú)機(jī)砷的提取率會(huì)隨著甲醇溶液濃度的變化而變化，甲醇溶液濃度高提取率就高，但樣品提取率增大到一定程度又會(huì)隨著甲醇溶液濃度的增大而降低，這一定程度上是因?yàn)榧状己窟^(guò)大而導(dǎo)致提取出樣品中的有機(jī)物而導(dǎo)致，會(huì)干擾到測(cè)定的準(zhǔn)確度，因此選擇1:1作為提取劑的體積比[7]。

6 結(jié)語(yǔ)

本試驗(yàn)采用液相色譜-原子熒光光譜法測(cè)定植物樣本中的無(wú)機(jī)砷，并在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)儀器參數(shù)設(shè)定和工作條件進(jìn)行優(yōu)化，測(cè)得試驗(yàn)樣品平均回收率在80.0%～88.0%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差都控制在5%以內(nèi)。因此表明該檢測(cè)方法具有良好的準(zhǔn)確性。但在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中也存在很多不足。首先因?yàn)橹参锓N類繁多、基體復(fù)雜，不能對(duì)全部種類植物進(jìn)行檢測(cè)，可能使本研究確立的無(wú)機(jī)砷形態(tài)分析法對(duì)個(gè)別樣品存在不適用情況，因此應(yīng)該做到具體問(wèn)題具體分析。由于植物樣中的含水量較大，總砷含量較低，因此對(duì)此類樣品中的無(wú)機(jī)砷含量測(cè)定存在不穩(wěn)定性，有望向檢出限更低、回收率更高、靈敏度更強(qiáng)的檢測(cè)方向發(fā)展。