柳方遠，李雙星，印春生，單 虎，才學鵬，劉業(yè)兵

（1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 10081；2.青島農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，青島 266109）

弓形蟲（Toxoplasma gondii）是一種專性細胞內(nèi)寄生的機會性致病原蟲，哺乳動物、鳥類、人都是它的中間宿主。弓形蟲不僅能夠感染健康人群，對免疫功能缺陷的個體造成嚴重損傷，還可以感染多種陸生動物，引起母畜流產(chǎn)，是危害嚴重的人獸共患寄生蟲病。弓形蟲作為胞內(nèi)寄生蟲，入侵宿主的過程是由多種分泌蛋白介導完成的。弓形蟲分泌蛋白通過調(diào)控宿主的免疫反應，保證蟲體的生長發(fā)育，從而維持宿主與蟲體之間復雜的平衡機制。這些分泌蛋白主要來自弓形蟲頂端復合體的微線體（microneme，MIC）、棒狀體（rhoptry，ROP）和致密顆粒（dense granule，GRA）3種分泌型細胞器。

弓形蟲入侵宿主細胞早期，微線體蛋白（microneme proteins，MICs）最先從速殖子頂端分泌，識別、附著宿主細胞膜。隨后棒狀體蛋白（rhoptry proteins，ROPs）釋放，與MICs相互作用入侵宿主細胞，形成納蟲空泡（parasitophorous vacuole，PV）。最后，致密顆粒蛋白（dense granule proteins，GRAs）開始分泌，修飾PV，便于蟲體獲取生存和復制所需的營養(yǎng)[1]。弓形蟲的致病機制復雜，分泌蛋白在弓形蟲與宿主細胞的相互作用中發(fā)揮著重要作用。本文綜述了弓形蟲主要分泌蛋白生物學功能的研究進展，旨在為研究弓形蟲致病機理和疫苗研制提供思路。

1 棒狀體蛋白（ROP）

棒狀體是位于弓形蟲頂端的一種棒狀細胞器，依據(jù)棒狀體蛋白在棒狀體細胞器的不同定位，將其分為棒狀體基部蛋白（ROPs）和棒狀體頸部蛋白（rhoptry neck proteins，RONs）兩類。ROPs陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了50余種，是弓形蟲特異性的棒狀蛋白激酶，在蟲體入侵及宿主細胞增殖方面發(fā)揮調(diào)控作用，對納蟲泡膜（parasitophorous vacuole membrane，PVM）和納蟲泡網(wǎng)狀結(jié)構（parasitophorous vacuole network，PVN）的形成和維持具有重要作用[2]。ROPs代表成員包括ROP1、ROP2、ROP3、ROP4、ROP5、ROP7、ROP8、ROP16、ROP18等蛋白。RONs囊括RON1-10，分泌至蟲體膜和宿主細胞膜之間，與弓形蟲的入侵、運動連接（moving junction，MJ）的形成有關，代表成員有RON1、RON2、RON3、RON4、RON5、RON6、RON8等[3]。

1.1 ROP1ROP1是弓形蟲特有的一種可溶性分泌抗原。作為穿透宿主細胞的增強因子，ROP1能與其他蛋白形成復合體，影響弓形蟲對宿主細胞的黏附，參與蟲體入侵宿主細胞。ROP1在弓形蟲早期診斷中具有應用價值，是開發(fā)弓形蟲病疫苗的潛在候選抗原之一，Sonaimuthu等[4]研究表明，利用ROP1構建的重組疫苗能使小鼠產(chǎn)生特異性體液免疫和細胞免疫。

1.2 ROP2ROP2在弓形蟲的速殖子、緩殖子和子孢子期均有表達。當弓形蟲入侵宿主細胞時，ROP2分泌至PVM，其羧基端的跨膜結(jié)構整合至PVM氨基端，其結(jié)構域在宿主細胞胞質(zhì)中起著聯(lián)系宿主細胞和PV的作用[5]。ROP2還可結(jié)合乳鐵蛋白，在蟲體分裂增殖、棒狀體蛋白產(chǎn)生、入侵宿主細胞等過程中發(fā)揮著關鍵作用。此外，ROP2介導細胞免疫反應，促進γ-干擾素等細胞因子的產(chǎn)生，影響蟲體增殖[6]。重組ROP2應用于弓形蟲病IgA、IgM和IgG抗體的檢測，在急性感染和先天性弓形蟲病的血清學診斷中具有重要作用。ROP2是弓形蟲疫苗較重要的候選抗原之一，Wang等[7]研究表明，重組ROP2可以使小鼠產(chǎn)生強烈的體液免疫和細胞免疫反應，并明顯延長小鼠的存活時間。

1.3 ROP4ROP4蛋白序列有2個疏水區(qū)，具有前體蛋白和成熟蛋白兩種形式，是調(diào)節(jié)宿主細胞蛋白質(zhì)磷酸化的重要靶蛋白。ROP4分泌后能迅速整合到PV中，參與并調(diào)節(jié)PV的形成。ROP4也可結(jié)合乳鐵蛋白，與宿主細胞的黏附、入侵和細胞內(nèi)的復制等方面密切相關。ROP4與其他蛋白構成重組嵌合蛋白免疫小鼠后，產(chǎn)生高水平的特異性抗體，引起強烈的體液免疫和細胞免疫反應，是弓形蟲病的多抗原疫苗候選分子[8]。

1.4 ROP5由于ROP5蛋白的生物合成過程中沒有經(jīng)過加工和修飾，因此它是一類具有酶折疊結(jié)構但沒有酶活性的假性激酶。ROP5的合成是發(fā)生在蟲體入侵宿主細胞和形成PVM的過程中，ROP5直接與PVM相互作用，使宿主細胞重要的免疫應答分子失調(diào)。ROP5是弓形蟲入侵宿主細胞的一個重要毒力因子，通過抑制巨噬細胞內(nèi)γ干擾素（IFN-γ）的調(diào)節(jié)作用來控制弓形蟲的毒力[9]。ROP5是ROP18發(fā)揮催化活性所必需的效應物，ROP18和ROP5、ROP17形成復合物磷酸化免疫相關GTP酶（immunityrelated GTPases，IRGs），使IRGs不能富集于PVM，進而控制弓形蟲的急性毒力作用，保護弓形蟲免被清除[10]。目前，ROP5主要應用于弓形蟲DNA疫苗的研究。

1.5 ROP13ROP13是可溶性棒狀體蛋白，無可識別域，與目前已知的ROPs無任何同源性。ROP13分泌后到達宿主的細胞質(zhì)，不參與PV的形成，其大量表達能夠破環(huán)宿主細胞的功能。將重組ROP13免疫小鼠后，引起小鼠體內(nèi)血清抗體水平升高，產(chǎn)生強烈的細胞免疫反應[11]。

1.6 ROP16ROP16是一種具有酪氨酸激酶活性的可溶性蛋白，由頂端復合體釋放，進入宿主細胞后借助核定位結(jié)構（nuclear localization sequence，NLS）轉(zhuǎn)運到宿主細胞核，影響宿主基因的表達，并參與宿主細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子（activate signal transducer and activator of transcription，STAT）的相關磷酸化。ROP16可調(diào)控STAT3和STAT6信號通路，通過激活STAT3和STAT6，促進白細胞介素12（interleukin 12，IL-12）的釋放，參與調(diào)節(jié)宿主的免疫應答[12]。ROP16是弓形蟲的重要毒力因子，依靠調(diào)控因子IFN-γ誘導NO的生成，調(diào)控宿主對弓形蟲的抑制作用，ROP16還可以通過基于脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的細胞因子的合成，參與調(diào)控宿主細胞[13]。目前，ROP16廣泛應用于弓形蟲疫苗的研究。

1.7 ROP18ROP18蛋白是一種絲氨酸-蘇氨酸激酶，定位于PVM，是弓形蟲毒力相關基因，其毒力隨著表達量的增加而增加。ROP18作用的發(fā)揮與IRGs、轉(zhuǎn)錄激活因子ATF6β（activating transcription factor，ATF）和P65（protein 65）等密切相關[14]。ROP18通過識別并清除宿主細胞內(nèi)的IRGs，保護PVM不被免疫細胞清除。ROP18通過調(diào)節(jié)ATF6β，誘導ROP18的毒力作用，從而抑制宿主的免疫應答，逃避巨噬細胞的吞噬作用。Du等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，ROP18通過促進P65的降解來抑制宿主的NF-κB信號通路。目前已發(fā)現(xiàn)多種ROP18的宿主互作因子，包括：Irgb6、Irgb10、Irga6和ATF6β等，這些互作因子積極參與蟲體對宿主細胞的黏附、蛋白降解、DNA修復、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及翻譯后修飾等過程。目前，ROP18主要應用于弓形蟲疫苗的研究，是重要的疫苗候選分子，帶有ROP18基因的載體疫苗在未來疫苗研發(fā)中具有巨大的潛力。

1.8 ROP38ROP38定位于PVM，是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種活性激酶，是一種重要的調(diào)節(jié)蛋白，宿主細胞的1000多種基因表達都與它有關。ROP38在不同基因型的蟲株中表達量有顯著差異。ROP38通過調(diào)控宿主細胞有絲分裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinases，MAPK）信號通路，參與宿主信號通路、細胞增殖和凋亡等過程[16]。ROP38主要應用于弓形蟲DNA疫苗的研究。

1.9 ROP46ROP46是一種蛋白激酶，當弓形蟲從速殖子轉(zhuǎn)化為緩殖子時，ROP46的表達量明顯升高。ROP46是弓形蟲從速殖子向緩殖子轉(zhuǎn)化過程中的關鍵蛋白，與弓形蟲入侵宿主細胞和調(diào)節(jié)毒力有密切關系。ROP46可能參與PVM的形成和修飾過程[17]。

1.10 RONsRONs與ROPs相比較為保守，RONs分泌后靶向定位于宿主細胞質(zhì)膜。在弓形蟲入侵宿主細胞的過程中，RONs最先釋放，以響應MICs觸發(fā)的入侵信號。RONs參與MJ的形成，該結(jié)構由RON2、4、5、8形成的大分子復合物及頂膜抗原1（apical membrane antigen 1，AMA1）構成[18]。MJ的主要功能是建立弓形蟲與宿主細胞之間的連接，使弓形蟲進入宿主細胞。研究表明，RON9和RON10形成的復合物不出現(xiàn)于MJ結(jié)構中，目前關于RONs遷移形成MJ結(jié)構的具體機制仍不清楚。RON2在結(jié)構功能上將蟲體與宿主細胞串聯(lián)起來，對于蟲體入侵至關重要，是重要的疫苗候選分子[19]。RON4定位在移動復合體，已經(jīng)證實是磷酸蛋白，具有激酶和磷酸酶的潛在功能。

2 微線體（MIC）蛋白

微線體蛋白分泌釋放到蟲體頂端或表面，參與弓形蟲的滑行運動和入侵宿主細胞。微線體蛋白由多種跨膜蛋白和黏附蛋白組成，目前，已知至少20余種，包括MICs、菱形體蛋白酶（rhomboid protease，ROMs）、AMA1、MIC2相關蛋白（microneme proteinⅡassociated protein，M2AP）、穿孔素樣蛋白1（perforin-like protein 1，PLP1）、解毒素4（toxolysin 4，TLN4）、枯草桿菌蛋白酶1（subtilisin 1，SUB1）、改變血小板反應素重復域的子孢子蛋白（the sporozoite protein with an altered thrombospondin repeat，SPATR）等[20]。MICs具有黏附結(jié)構域，可以結(jié)合宿主細胞表面受體和糖類，形成與宿主細胞受體相互作用的復合物，分泌到弓形蟲的表面，在弓形蟲毒力和致病性方面發(fā)揮了重要的作用。

2.1 MIC1MIC1無跨膜區(qū)，屬于可溶性蛋白。MIC1具有凝集素特性，可能參與蟲體與宿主細胞表面結(jié)合過程。MIC1蛋白含有兩個微線體黏合重復域（microneme adhesive repeat，MAR）和兩個血小板結(jié)合蛋白（thrombospondin，TSP）樣結(jié)構，MAR與唾液酸寡糖結(jié)合后，參與弓形蟲入侵宿主細胞的過程。MIC1與MIC4、MIC6相連，組成MIC1-MIC4-MIC6復合體。當前，MIC1主要應用于弓形蟲診斷。

2.2 MIC2MIC2的氨基酸結(jié)構中含有I或A結(jié)構域和6個TSP樣結(jié)構，與蟲體識別宿主細胞的黏多糖有關系。MIC2與其同源蛋白質(zhì)血小板反應蛋白相關匿名蛋白（thrombospondin related anonymous proteins，TRAP）具有相同的結(jié)構域，而TRAP能夠驅(qū)動瘧原蟲進行滑翔運動和入侵紅細胞，因此，MIC2可能參與弓形蟲的滑翔運動和入侵過程[21]。MIC2和M2AP以1∶1的比例形成MIC2-M2AP六聚復合體，在弓形蟲入侵宿主細胞的過程中發(fā)揮重要作用。MIC2在蟲體的各期均有表達，是弓形蟲感染的主要毒力因子，目前關于MIC2的應用研究主要致力于構建MIC2缺陷株，開發(fā)有效弱毒活疫苗。

2.3 MIC3MIC3由微線體分泌，經(jīng)蟲體修飾后以二聚體的形式存在，是重要的黏附分子，參與蟲體對宿主細胞的識別、黏附及入侵過程。MIC3在蟲體各個時期均能表達，該蛋白質(zhì)在護航蛋白MIC8的保護作用下分泌至細胞外膜[22]。MIC3含5個表皮生長因子樣結(jié)構域（epithelial growth factor-like domain，EGF-like domain）和1個幾丁質(zhì)連接樣結(jié)構域（chitin binding-like domain，CBL）。EGF有助于MIC3形成正確的空間結(jié)構，在MIC3和MIC8形成復合體的過程中起重要作用。CBL參與MIC3對宿主細胞的黏附，可能與蛋白質(zhì)間及碳水化合物間的相互作用有關。目前已有利用MIC3研制核酸疫苗和活載體疫苗的報道，該蛋白是在弓形蟲病診斷和疫苗研制中非常有前景的候選分子[23]。

2.4 MIC4MIC4無跨膜區(qū)，含有6個蘋果結(jié)構域（apple motif），其C端的App6結(jié)構具有黏附功能。MIC4在弓形蟲的所有感染階段都有表達，參與蟲體對宿主細胞的黏附過程、蛋白水解和血液凝固過程，MIC4和MIC1、MIC6組成復合體[24]。MIC4可以作為弓形蟲感染診斷的候選分子。

2.5 MIC5-9MIC5不含黏附結(jié)構，參與MIC2-M2AP復合體的運輸過程，在弓形蟲黏附于宿主細胞表面的過程中起間接相關的作用。MIC6在弓形蟲速殖子期表達，作為跨膜蛋白攜帶MIC1和MIC4到達微線體，在微線體中形成MIC1-MIC4-MIC6復合體。MIC7結(jié)構中含有內(nèi)含子，在弓形蟲包囊內(nèi)表達。MIC8在弓形蟲的速殖子和緩殖子期均有表達。MIC9氨基酸結(jié)構中含有EGF樣域，主要在裂殖子期表達[25]。

2.6 MIC10MIC10為小分子蛋白，無跨膜區(qū)，不含有黏附結(jié)構。MIC10在速殖子期的表達量是緩殖子期的3倍，因此檢測MIC10有利于區(qū)分急性和隱性感染。MIC10不參與宿主細胞的配體受體作用，該蛋白可能在蟲體入侵時進入到組織中，作為一種循環(huán)抗原被檢測到[26]。MIC10可作為高敏感性弓形蟲感染診斷方法檢測的靶標，重組MIC10蛋白及其特異性抗體可作為檢測試劑用于建立檢測患者體內(nèi)弓形蟲天然抗原或抗體方法。

2.7 其他微線體蛋白AMA1參與弓形蟲自身的復制。弓形蟲入侵細胞時，AMA1分泌到弓形蟲表面與RON2結(jié)合形成移動連接，參與弓形蟲的入侵過程。AMA1免疫能促進IFN-γ的產(chǎn)生，比MIC2、M2AP基因免疫有更好的保護效果[27]。MIC11位于微線體前端，屬于鈣離子依賴性蛋白，具有在成熟之前移除內(nèi)部前肽的特性，MIC11在速殖子和緩殖子中表達[28]。MIC6、MIC8、AMA1和MIC16都能與醛縮酶相互作用，對細胞膜的敏感性和轉(zhuǎn)運信號的傳導都有重要的作用[29]。

2.8 MIC2-M2AP復合體MIC2與M2AP以1∶1的比例，形成MIC2-M2AP六聚復合體，復合體先轉(zhuǎn)運到高爾基體，再到達微線體。MIC2-M2AP六聚復合體在蟲體入侵宿主細胞時外排出蟲體，與宿主細胞表面受體結(jié)合，參與蟲體的滑行運動和快速入侵，在蟲體入侵宿主細胞過程中起著重要的作用[30]。

2.9 MIC1-MIC4-MIC6復合體MIC1與MIC4相互作用，使MIC4的App6結(jié)合到宿主細胞上。MIC6作為護航蛋白護送MIC1和MIC4到達微線體，使MIC1、MIC4連接在弓形蟲表面，形成MIC1-MIC4-MIC6復合體。MIC1-MIC4-MIC6復合體在分泌運輸過程中，3種蛋白相互作用，有助于蟲體的黏附和入侵。

2.10 MIC3-MIC8復合體MIC3在護航蛋白MIC8的護送下，到達微線體。當弓形蟲入侵宿主細胞時，MIC3排出蟲體，黏附到宿主細胞表面。MIC3-MIC8復合物與棒狀體的分泌密切相關[31]。

3 致密顆粒蛋白（GRA）

GRAs是由致密顆粒細胞器分泌的一類免疫活性蛋白，與蟲體在宿主細胞內(nèi)的存活和營養(yǎng)代謝交換機制相關。GRAs分別從蟲體頂端、側(cè)面及末端分泌進入PV，對PV和PVN的形成和維持具有重要作用。GRAs可以抵抗宿主細胞溶酶體的酸化和裂解，抵抗宿主細胞對弓形蟲的攻擊，確保弓形蟲在細胞內(nèi)的生存。GRAs在宿主體內(nèi)具有較好的免疫原性，是宿主感染后血液循環(huán)抗原的重要組成部分[32]。目前已發(fā)現(xiàn)的GRAs有50余種，包括GRA1-17、GRA23-25、GRA39、組織蛋白酶（cathepsins，CPC）、三磷酸核苷酸水解酶（nucleoside triphosphate hydrolase，NTPase）、蛋白酶抑制劑（protease inhibitors，PI）、STAT1 轉(zhuǎn)錄活性抑制因子（inhibitor of STAT1 transcriptional activity，IST）、Myc調(diào)節(jié)因子（Myc regulation，MYR）等。

3.1 GRA1GRA1（P24），為分泌型可溶性蛋白，是弓形蟲分泌排泄抗原（excretory secreting antigens，ESAs）的重要組成成份之一。GRA1有兩個鈣離子結(jié)合區(qū)域，可作為緩沖分子參與蟲體內(nèi)鈣離子的攝入與釋放。GRA1可分泌到PV空間管狀囊泡結(jié)構的外圍，激活和穩(wěn)定PVN結(jié)構，在修飾調(diào)節(jié)PV結(jié)構中起重要作用。GRA1在速殖子和緩殖子期均能表達，與弓形蟲速殖子侵入宿主細胞的信號轉(zhuǎn)導有關，可作為致密顆粒蛋白的標記基因[33]。GRA1應用于弓形蟲感染診斷，具有較好的免疫原性，可作為疫苗的候選分子。

3.2 GRA2GRA2（P28），是弓形蟲毒力相關基因，在弓形蟲入侵宿主細胞后，GRA2分泌到PV，誘導PVM表面網(wǎng)絡的形成[34]。GRA2可與GRA4、GRA6在PVM上結(jié)合并形成一個多聚復合體，參與PV蛋白質(zhì)以及營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運[35]。GRA2在速殖子和緩殖子期均可表達，是潛在的抗原標記物。GRA2可應用于人和動物弓形蟲診斷，GRA2在弓形蟲感染早期階段檢測中具有較高的敏感性，能夠用于研發(fā)檢測弓形蟲的膠體金免疫層析試紙條，是弓形蟲疫苗研制的候選分子。

3.3 GRA3GRA3位于PVM，無跨膜結(jié)構域，其N端的信號肽序列和跨膜區(qū)使GRA3以低聚物聚合，嵌入PV的脂質(zhì)雙分子層，參與PVM的形成。GRA3在弓形蟲入侵宿主細胞后發(fā)揮著重要的作用，在蟲體內(nèi)具有較高的轉(zhuǎn)錄水平。GRA3主要在速殖子期表達，可能是蟲體復制的一個前提條件[36]。

3.4 GRA4GRA4同GRA1、GRA2一樣存在于PV的網(wǎng)狀結(jié)構中。在PV形成初期，GRA4分布于PV中，通過蛋白間相互作用及疏水作用與GRA2和GRA6形成復合物穩(wěn)定PVN，確保細胞營養(yǎng)物質(zhì)進入PV[37]。GRA4有較強的抗原性，可以引起機體產(chǎn)生多種抗體，誘導機體產(chǎn)生保護性免疫。GRA4能與弓形蟲IgA、IgM、IgG等抗體發(fā)生免疫反應，主要應用于弓形蟲病的診斷及疫苗研究。

3.5 GRA5GRA5（P21），存在于弓形蟲的所有生命階段，為可溶性蛋白和疏水性聚合物。GRA5與GRA3相似，都定位于PVM，這兩個蛋白可與宿主細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣離子調(diào)節(jié)配體（Calcium modulating ligand，CAMLG）結(jié)合，使PV和宿主細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相連[38]。當弓形蟲入侵宿主細胞時，可溶性的跨膜蛋白GRA5分泌到PV，維持PV的結(jié)構穩(wěn)定并參與入侵宿主細胞。GRA5在多種抗原聯(lián)合診斷中是一個很好的補充抗原，是弓形蟲疫苗研制的候選分子。

3.6 GRA6GRA6定位于PV，為單拷貝基因，其C端具有多態(tài)性，可以通過鈣調(diào)節(jié)配體激活T細胞核因子4（nuclear factor of activated T cells，NFAT），導致宿主選擇性誘導免疫調(diào)控基因或細胞因子，使趨化因子的合成量升高，招募炎性細胞到達弓形蟲感染部位，產(chǎn)生免疫應答[39]。GRA6通常用來檢測孕婦血清中的弓形蟲IgG抗體滴度，區(qū)分弓形蟲急性感染和慢性感染。

3.7 GRA7GRA7（P29）是一種酸性可溶性蛋白。GRA7是目前發(fā)現(xiàn)的唯一一個將蟲體膜與宿主細胞膜連接的膜內(nèi)在蛋白質(zhì)。GRA7定位于速殖子的PVN和PVM。GRA7與納蟲泡的結(jié)構形成相關，可免除宿主細胞器對蟲體的內(nèi)吞作用。GRA7具有較高的抗原性，是弓形蟲毒力相關因子，免疫GRA7蛋白可誘導機體產(chǎn)生免疫反應，對于觸發(fā)巨噬細胞的腫瘤壞死因子受體相關因子6（TNF receptor associated factor 6，TRAF6）機制和誘導NF-κB的活化具有至關重要的作用[40]。Alaganan等[41]研究發(fā)現(xiàn)，在弓形蟲入侵過程中，GRA7與ROP2、ROP8、ROP18能形成復合體作用于GTPases。GRA7常用作診斷弓形蟲急慢性感染的工具，是弓形蟲疫苗的候選分子之一，已有學者將GRA7蛋白衍生的限制性表位組裝成納米球，制備納米疫苗制劑，增強了源自弓形蟲蟲體抗原的免疫原性[42]。

3.8 GRA15GRA15是一種多態(tài)性分泌蛋白，主要在弓形蟲速殖子期表達。GRA15可與TRAF6互相作用，激活NF-κB信號通路，誘導IL-12分泌，進而激發(fā)細胞凋亡、免疫反應和炎癥反應等信號[43]。在弓形蟲入侵時，GRA15能夠誘導CD8+T淋巴細胞介導的免疫效應。Chen等[44]將GRA15與其他抗原聯(lián)合免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合免疫可以引發(fā)小鼠細胞免疫和體液免疫反應，提高保護效率。

3.9 GRA16GRA16與弓形蟲的致病性相關。GRA16通過與宿主泛素特異性蛋白酶（ubiquitin-specific protease，HAUSP）和蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A，PP2A）的相互作用進入宿主細胞核，調(diào)節(jié)腫瘤抑制因子P53的水平，進而調(diào)控宿主細胞的轉(zhuǎn)錄功能，包括調(diào)節(jié)宿主細胞代謝和細胞周期等[45]。

3.10 GRA24,25 GRA24與GRA16結(jié)構相似，能越過PVM到達宿主細胞胞質(zhì)中。GRA24與宿主的p38αMAPK結(jié)合形成復合物，在宿主細胞核內(nèi)發(fā)揮作用，參與調(diào)節(jié)細胞因子，促使單核細胞趨化蛋白1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）和IL-12的產(chǎn)生，具有調(diào)節(jié)宿主細胞轉(zhuǎn)錄的功能[46]。GRA25是與弓形蟲毒力相關的分泌蛋白。GRA25含有8個B細胞抗原表位，影響宿主巨噬細胞分泌炎性趨化因子CCL2和CXCL1，從而影響免疫應答[47]。

3.11 其他致密顆粒蛋白IST能抑制STAT1依賴的干擾素反應，IST可以直接進入宿主細胞核，改變?nèi)旧|(zhì)環(huán)境，阻止干擾素反應的發(fā)生，從而減少宿主細胞免疫反應對PV的破壞[48]。PI參與弓形蟲入侵宿主細胞的過程，對糜蛋白酶、胰蛋白酶、中性白細胞彈性蛋白酶具有特異性抑制作用，PI在先天性免疫中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[49]。GRA17和GRA23可以在PVM形成微孔，介導小分子物質(zhì)在PVM中的轉(zhuǎn)運，弓形蟲可以通過這種方式獲取宿主細胞的營養(yǎng)物質(zhì)，同時保持PVM的穩(wěn)定性。GRA22可以調(diào)節(jié)鈣離子濃度，參與調(diào)控蟲體在宿主細胞內(nèi)的逸出[50]。MYR1定位于PV和PVM，參與弓形蟲分泌蛋白由PV轉(zhuǎn)運到宿主細胞胞質(zhì)的過程，可作為一種中心調(diào)控蛋白參與調(diào)節(jié)蟲體GRAs。MYR1、MYR2和MYR3都能影響GRA24的運輸。GRA39具有通過脂質(zhì)調(diào)控來影響蟲體生長的重要作用。GRA41參與調(diào)節(jié)鈣離子和?；D(zhuǎn)移酶（cholesterol acyltransferase，LCAT）的催化活性，維持蟲體內(nèi)部環(huán)境的脂質(zhì)代謝平衡[51]。

4 小結(jié)與展望

近幾年來，研究人員對弓形蟲的多種蛋白都做了大量研究，已經(jīng)報道了數(shù)種弓形蟲蛋白質(zhì)的功能和特性，使我們從蛋白質(zhì)層面全面認識弓形蟲的致病機制，并研制了多種弓形蟲疫苗，但其免疫效果都不十分理想。因此，對弓形蟲蛋白質(zhì)組分和功能的探索、免疫學特性、新抗原的鑒定評估等都亟需更深入的研究。目前，在弓形蟲疫苗研究方面，大多數(shù)具有免疫原性的分泌蛋白都可用于亞單位疫苗的研究；ROP5、ROP16、ROP18、ROP38、ROP54、MIC3、MIC6等蛋白常見于DNA疫苗的研究；ROP2、ROP18、GRA6、AMA1等蛋白可用來研究RNA疫苗[52]。MIC1、MIC10、GRA1、GRA2、GRA4、GRA6等常應用于弓形蟲感染的診斷。

弓形蟲依賴不同的分泌蛋白協(xié)助蟲體完成整個胞內(nèi)生長周期，在入侵宿主細胞過程中，參與宿主的免疫應答，弓形蟲分泌蛋白在蟲體生長發(fā)育和免疫逃避過程中扮演著重要角色。分泌蛋白在蟲體不同階段內(nèi)的表達和發(fā)揮作用不同，通過上文可知，ROP13、ROP18、RON2、GRA24在弓形蟲某一階段的表達具有較強的致病性和免疫原性；ROP5、ROP8、ROP16、ROP38、ROP48、RON4、MIC1、MIC5、GRA2、GRA4、GRA10、GRA12、GRA15、GRA16在弓形蟲速殖子和緩殖子階段均表達；而ROP2、MIC3、MIC4、MIC13、GRA1、GRA6、GRA8在弓形蟲三個階段均表達。ROP5、ROP17、ROP18能形成復合物保護弓形蟲免于被清除；微線體蛋白相互結(jié)合形成復合體，參與蟲體生長發(fā)育和入侵宿主細胞；GRA7與ROP2、ROP8、ROP18形成復合體，作用于免疫相關的GTPases。因此，篩選在弓形蟲多個階段表達且具有高致病性和免疫原性的關鍵蛋白作為候選抗原，以及研究蛋白之間的互作，開發(fā)包含多種抗原的疫苗或聯(lián)合疫苗是今后弓形蟲疫苗研制的兩條重要思路。

隨著研究的發(fā)展，ROPs、MICs、GRAs家族成員被一一揭示，許多新型蛋白被成功鑒定，比如ROP54、ROMs、GRA35、GRA39、GRA41、GRA42、GRA43等，但是對于這些新型分泌蛋白在蟲體發(fā)育階段的遷移、入侵、復制和免疫逃避等機制中的功能和角色我們還尚不清楚，這些都值得我們進行探索，對了解弓形蟲的致病機制、抗原特性、誘導宿主產(chǎn)生免疫應答及免疫保護等方面均具重要價值。