王 平 羅君琴 聶振朋 柯甫志 徐建國

（浙江省柑橘研究所/國家品種改良分中心 臺州318026）

三倍體材料因其果實無籽、抗性強等優(yōu)點而倍受育種工作者的青睞。柑橘三倍體小種子是由于二倍體母本在雜交過程中產(chǎn)生不完全減數(shù)的配子而形成，其在柑橘二倍體雜交后代中普遍存在，是選育柑橘可遺傳三倍體材料的一個重要途徑[1～3]。但小種子胚弱，自然播種萌發(fā)率極低，需要通過組培技術(shù)提高植株再生率[4]。本研究以多籽凱旋柑品種為材料，利用流式細胞術(shù)快速篩選出三倍體組培苗，為進一步改良多籽柑橘品種、豐富柑橘三倍體種質(zhì)資源奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

自然授粉的凱旋柑成熟果實晴天采摘于浙江省柑橘研究所山站試驗園，剔除病蟲害果、畸形果后室溫放置。隨機挑選50個果實進行小種子重量和出現(xiàn)頻率統(tǒng)計。

1.2 小種子組培成苗技術(shù)體系

在無菌環(huán)境下，凱旋柑整果用消毒刀繞橫徑切1圈，扭成兩半，用滅過菌的鑷子挑出小種子，75%乙醇溶液滅菌處理10 min，再用無菌水清洗一次，去除種皮后分類選出中粒小種子種胚、小粒小種子種胚、中粒癟籽種胚和小粒癟籽種胚，接種于含0.5mg/L KT+0.5mg/L IBA 激素組合的培養(yǎng)基，在溫度24±2℃、光強2000Lux、光照時間12h/d的模擬光照條件下培養(yǎng)成苗。

1.3 倍性鑒定

組培苗倍性鑒定采用流式細胞術(shù)法，檢測儀器采用CyFlow?Space PARTEC 流式細胞儀，檢測試劑采用CyStain UV Precise T（Sysmex Partec公司）試劑盒。

剪取組培苗嫩葉置于培養(yǎng)皿中，先加0.4ml 提取液置于葉片表面，用刀片切碎葉片并靜置培養(yǎng)30s，過濾出液體，再加1.6 ml DNA染色液待測用。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同類型種子出現(xiàn)頻率分析

對隨機選取的50 個果實種子進行統(tǒng)計分析，結(jié)果（表1）顯示自然授粉的凱旋柑平均每果種子多達10顆以上，小種子重量均在正常種子的1/3 以下，平均每個果實中出現(xiàn)0.84 顆小種子。為區(qū)分小種子大小與倍性的相關(guān)性，進一步將小種子分為中粒和小粒兩類進行研究，其中小粒種子均重在正常種子的1/6 以下。由于三倍體種胚弱小，極易發(fā)育不良，試驗同時對癟籽進行組培成苗并倍性鑒定，且根據(jù)種胚大小分為中粒癟籽和小粒癟籽兩類。不同種子類型如圖1所示。

圖1. 自然授粉凱旋柑果實的不同類型種子

表1 不同類型種子的出現(xiàn)頻率、重量和比值

2.2 小種子/癟籽種胚組培成苗及其三倍體概率統(tǒng)計

對2017年份凱旋柑小種子//癟籽種胚成苗植株進行倍性鑒定并統(tǒng)計三倍體出現(xiàn)概率（如表2）。2017年份通過組培技術(shù)途徑共獲得467 棵小種子組培苗和89 棵癟籽組培苗，利用流式細胞術(shù)分別檢測篩選出276 株小種子三倍體組培苗和13 株癟籽三倍體組培苗，三倍體總概率達到52..3%。對不同類型的小種子//癟籽的倍性進行了分類統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)中粒小種子和小粒小種子里三倍體概率極為相似，均接近60%%；而癟籽三倍體出現(xiàn)概率較低，平均概率為23..4%，其中中粒癟籽的三倍體概率最低（不足10%%）。按小種子三倍體概率計算，自然授粉的凱旋柑三倍體小種子可達0.48顆/果。

3 小結(jié)與討論

本研究中，凱旋柑為單胚品種，其小種子的重量均在正常種子的1/3 以下，甚至小到1/6，這 與 陳 力 耕 和 胡 運 權(quán)[1]、Esen 和Soost[5]的研究結(jié)果一致。Aleza 等[4]發(fā)現(xiàn)三倍體小種子的產(chǎn)生頻率與母本的遺傳型密切相關(guān)，其中Fortune 為母本的雜交后代小種子三倍體概率極高，每果能培養(yǎng)出2.54株三倍體再生植株，而其它5 個為母本的概率在0.12～0.32 株/果。本試驗中，自然授粉的凱旋柑品種每個果實可培養(yǎng)出0.48 株三倍體再生植株，產(chǎn)生概率處于中高水平。本研究結(jié)果再次驗證了基于組培技術(shù)的三倍體小種子培育是選育無核柑橘材料的一個有效途徑。

表2 凱旋柑小種子/癟籽組培苗倍性概率統(tǒng)計