胡 鑫，丁晨雨， 葉 勤，吳榮華,2，張 倩，李 虹，李 云,2

(1.西南大學動物科技學院重慶三峽生態(tài)漁業(yè)產(chǎn)業(yè)技術研究院，重慶 400715；2.淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點實驗室，重慶 400715；3.西南大學化學化工學院，重慶 400715；4.重慶市水產(chǎn)技術推廣總站，重慶 400200)

在魚類運輸過程中，使用魚用麻醉劑能明顯減輕魚類的應激反應，減少經(jīng)濟損失。目前報道有MS-222(三卡因)、苯佐卡因、丁香酚等近30種藥物可以作為魚用麻醉劑[1]。但是這些藥物在生產(chǎn)中使用時由于有藥物殘留，需要休藥期等問題，存在較大的安全隱患。因此，開展安全、無殘留魚用麻醉劑的研究非常必要。已有文獻表明，CO2對魚類具有麻醉作用[2,3]，與其它鎮(zhèn)靜劑相比較，CO2具有無藥物殘留、無休藥期，對人和環(huán)境無害等優(yōu)點，是一種有著良好發(fā)展前景的魚用麻醉劑[4,5]。迄今，有關魚類CO2麻醉的報道主要集中在麻醉效果及生理指標影響方面[6,7]，針對大宗淡水養(yǎng)殖魚類CO2麻醉的報道較少[8]，尤其是CO2麻醉對魚類神經(jīng)調(diào)控機制的影響未見報道。

鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)作為大宗淡水養(yǎng)殖魚類之一，在保障水產(chǎn)品供給方面具有重要作用。鮮活鰱運輸常使用充氧有水運輸，但鰱抗應激能力差，在高密度養(yǎng)殖、氣溫氣壓驟變、長途運輸、裝卸的情況下，較其它魚類更容易產(chǎn)生應激反應，導致魚體損傷甚至死亡，造成經(jīng)濟損失。本研究以鰱為對象，研究CO2處理對鰱的麻醉效應、血清代謝和應激指標變化、腦神經(jīng)遞質(zhì)含量和神經(jīng)調(diào)控相關基因表達的影響，為魚類CO2麻醉機制的研究提供基礎資料，為鰱?；钸\輸技術提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗鰱體長(15.73 ± 0.81) cm、體重(53.70 ± 8.00) g，購于重慶市沙坪壩區(qū)雙連水庫。暫養(yǎng)15 d后挑選健康且規(guī)格一致的鰱用于實驗。CO2麻醉裝置和工藝參照文獻[8]。實驗前停食24 h，分別置于實驗水體為5 L的密封魚缸并放入溫度為25 ℃的恒溫箱中進行實驗。根據(jù)預實驗結果確定CO2濃度為(155 ± 15) mg/L開展后續(xù)實驗。

設兩個處理組，每組設6個平行，每個平行組5尾魚。第一組CO2麻醉處理，O2初始濃度為(8.46 ± 0.25) mg/L，CO2初始濃度為(155 ± 15) mg/L；第二組充O2處理，O2初始濃度為(9.74 ± 0.65) mg/L。兩組在處理15 h和恢復通空氣24 h兩個時間點隨機取9尾魚進行取樣。對照組為正常暫養(yǎng)鰱，用開放魚缸持續(xù)通空氣，溶解氧為(7.47 ± 0.55) mg/L，在暫養(yǎng)停食24 h后隨機取9尾魚進行取樣。

1.2 實驗方法

觀察各組鰱的呼吸頻率(次/min)，并記錄其行為狀況。使用PHS-25型精密pH計、便攜FlveGo溶解氧測定儀、FC-100型水中CO2測定儀對實驗前后水體中pH、溶解氧和CO2濃度進行檢測。在各時間點采血分離血清，取魚體腦、肝胰臟組織，-80 ℃保存，用于后續(xù)測定。血清鈣離子(Ca2+)、血清鉀離子(K+)、血清乳酸(LD)、血清尿素氮(BUN)、肝糖原(GLY)、腦乙酰膽堿(Ach)含量測定參照南京建成生物工程研究所試劑盒說明書。魚皮質(zhì)醇(COR)、魚多巴胺(DA)、魚5-羥色胺(5-HT)指標測定參照慧嘉生物ELISA試劑盒說明書。

采樣常規(guī)qPCR技術檢測鰱腦組織kcnk3、kcnk9、hif-1α和epo基因表達量的變化。NCBI中查找近源物種的基因序列，qPCR引物由Primer Premier 5.0設計，并由擎科生物技術有限公司合成(表1)。內(nèi)參基因ef-1α的引物參考丁晨雨等[9]，每個樣品做3個技術重復，在95 ℃預變性10 min，95 ℃變性15 s，退火溫度退火1 min，72 ℃延伸10 min，40個循環(huán)。記錄基因擴增曲線及Ct值，用2-ΔΔCT法分析kcnk3、kcnk9、hif-1α和epo基因的表達變化。

表1 qPCR擴增目標基因的引物序列Tab.1 Primers of target genes amplification for qPCR

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2010和SPSS 22軟件處理數(shù)據(jù)，單因素方差分析法分析數(shù)據(jù)差異顯著性(P<0.05)，Origin 8.5繪制數(shù)據(jù)柱狀圖。

2 結果

2.1 CO2麻醉對鰱的呼吸頻率和感覺影響

0.5 h后，正常對照組鰱呼吸頻率(62.87 ± 2.45)次/min，CO2麻醉組鰱呼吸頻率(39.60 ± 5.03) 次/min，顯著降低，且平衡性降低，對聽覺和視覺刺激反應也降低。O2處理組0.5 h后，呼吸頻率為(61.73 ± 2.99) 次/min，與正常對照組差異不顯著，對聽覺和視覺反應迅速。

2.2 鰱血清生理生化指標變化

充CO2、O2處理15 h后兩組鰱血清K+均顯著升高，恢復充氣后均發(fā)生顯著回降，但CO2組復蘇后鰱血清K+接近對照組。兩種處理組處理15 h后Ca2+均無顯著變化，恢復充氣后均發(fā)生顯著性下降(表2)。

表2 O2和CO2處理鰱血清生理生化指標和肝糖原變化Tab.2 The Changes of serum physiological and biochemical indexes and liver glycogen of O2 and CO2treatment groups in silver carp

注：同行數(shù)值間上標不同字母表示差異顯著顯著(P<0.05)，下同。

兩組鰱血清乳酸(LD)和尿素氮(BUN)水平在處理15 h后均顯著升高，尤其是BUN水平，幾乎達到對照組(8.97±2.22) mmol/L水平的2～3倍；恢復充氣后，LD水平和BUN水平仍顯著高于對照組。結果表明，CO2處理組鰱血清中LD、BUN水平在各個時期均顯著低于充O2處理組(表2)。

血清皮質(zhì)醇(COR)水平在CO2處理組與對照組無顯著差異，而O2處理組鰱血清COR則顯著升高到(94.06±11.46) mg/L，是對照組(39.85±7.30) mg/L的2倍多。恢復充氣后CO2復蘇組血清COR水平無顯著變化，O2復蘇組則顯著降低至正常水平。結果表明，CO2處理組血清COR水平顯著低于O2處理組(表2)。

2.3 鰱肝糖原的變化

CO2和O2處理后，兩組肝糖原(GLY)含量均顯著降低，恢復充氣后，CO2復蘇組仍顯著低于對照組，O2復蘇組則恢復至正常含量。結果表明，CO2處理組GLY含量在各個時期都顯著低于充O2處理組(表2)。

2.4 CO2麻醉鰱腦組織乙酰膽堿、多巴胺和5-羥色胺含量的變化

鰱經(jīng)CO2麻醉后，乙酰膽堿(Ach)含量輕微升高，多巴胺(DA)和5-羥色胺(5-HT)含量有所下降，下降幅度不大，但經(jīng)過充氣復蘇后，三種神經(jīng)遞質(zhì)含量均升高，尤其是DA含量顯著升高(表3)。

表3 CO2處理鰱腦組織乙酰膽堿、多巴胺和5-羥色胺的變化Tab.3 The changes of Ach，DA and 5-HT contents of brain tissue of CO2 treatment group in silver carp pg/mg prot

2.5 CO2麻醉后腦神經(jīng)調(diào)控相關基因kcnk3a、kcnk9、epo和hif-1α表達的變化

設鰱腦組織上述基因在正常情況下的表達量為1，鰱經(jīng)CO2處理后15 h，腦組織kcnk3a、kcnk9、epo和hif-1α各基因相對表達量分別上調(diào)了123%、158%、366%和22%。復蘇后kcnk3a、kcnk9和epo基因表達量發(fā)生顯著性降低，hif-1α基因表達量與對照組間顯著差異(圖1)。

圖1 二氧化碳處理鰱腦組織kcnk3a、kcnk9、epo和hif-1α基因表達的變化Fig.1 The changes of gene expressions of kcnk3a，kcnk9，epo and hif-1α of in brain tissue of CO2 treatment group in silver carp CO2處理組表示CO2麻醉處理后15 h，恢復充氣組表示恢復充氣后24 h，對照組表示正常充氣對照組。不同小寫字母表示各個基因不同處理方式mRNA差異顯著。

3 討論

3.1 CO2 麻醉對鰱應激生理指標的影響

神經(jīng)遞質(zhì)Ach、DA和5-HT可能是麻醉的作用靶位[10]，魚類發(fā)生應激反應時，DA和5-HT含量顯著上升[11,12]。本實驗中鰱在CO2麻醉處理后腦神經(jīng)遞質(zhì)DA和5-HT含量減少，復蘇后增多，表明CO2可能阻礙鰱腦神經(jīng)遞質(zhì)分泌，阻礙神經(jīng)細胞突觸間信號傳遞而起麻醉作用。已有的研究表明，魚類受到急性脅迫后在幾分鐘之內(nèi)血液皮質(zhì)醇水平迅速上升，受到慢性脅迫時血液皮質(zhì)醇也會緩慢持續(xù)升高，恢復到正常水平需要數(shù)小時[13]。因此，COR被廣泛用作魚體應激反應的量化指標[14]。血液COR升高幅度與應激因子強度和作用時間呈正相關[15]。本實驗中CO2處理組鰱血清COR含量輕微升高，而O2處理組顯著升高，表明鰱在CO2麻醉方式下產(chǎn)生的應激程度較一次性充O2方式更低。這與黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)和羅非魚(Oreochromisspp.)用其它麻醉劑處理后的結果相似[16,17]。

3.2 CO2麻醉對鰱血清生化指標的影響

本研究中，CO2和O2兩個處理組在15 h時均處于缺氧狀態(tài)，此時機體為了維持能量需要，肝糖原加速分解產(chǎn)生葡萄糖而導致肝糖原顯著下降。恢復充氣后，糖原分解速率低于糖原合成速率，糖異生途徑使肝糖原累積。血清中LD是衡量無氧代謝強度的重要指標[18]，兩組鰱血清LD含量均顯著升高，鰱的無氧代謝均加強以滿足能量需求，恢復充氣后供氧充足，但是血液中的LD代謝較慢，需要數(shù)天才能恢復正常，白斑狗魚(Esoxlucius)、黃顙魚、羅非魚和金鯧(Trachinotusovatus)的研究中均有相似發(fā)現(xiàn)[3,19-20]。相比充O2處理，CO2麻醉處理的代謝物指標顯著降低，說明CO2麻醉可以有效降低鰱的新陳代謝，有利于魚體?；睢?/p>

本研究中，血清K+在兩種處理組均顯著升高，此時水體中溶氧較低，魚體處于缺氧狀態(tài)，加上血清LD升高，均會導致pH下降，此時，K+易從細胞內(nèi)逸出到細胞外，從而導致血清K+上升[21]。麻醉處理后血清中含量相對穩(wěn)定，恢復充氣24 h后，血清Ca2+顯著性下降，推測是由于鰱恢復后機體活動增加，細胞能量代謝加強，神經(jīng)、肌肉細胞增加了對Ca2+吸收，導致血清Ca2+水平下降。

CO2和O2兩種處理中鰱血清BUN都發(fā)生了顯著升高，表明腎功能出現(xiàn)障礙或部分受損[22]，但CO2麻醉處理鰱血清BUN升高的幅度較充O2處理小，這可能是因為鰱處于麻醉狀態(tài)，氨基酸代謝降低所致，此外鰱的腎臟在缺氧狀態(tài)下可能出現(xiàn)排泄障礙，BUN沒有被有效排出體外使得BUN含量高于正常水平，這與羅非魚的研究結果一致[23]。

3.3 CO2麻醉對鰱腦組織神經(jīng)調(diào)控相關基因表達的影響

kcnk3a和kcnk9基因均為雙孔K+通道蛋白家族(K2P)成員，是麻醉劑的作用靶點，可被麻醉劑、酸化、低氧和滲透壓等因素調(diào)控[24,25]。本研究結果顯示CO2麻醉導致kcnk3a和kcnk9基因的表達量增加，可能激活K2P使K+通道產(chǎn)生了外向電流，造成細胞膜超級化現(xiàn)象，從而降低了神經(jīng)元的興奮性，減輕了低氧脅迫對鰱神經(jīng)細胞的損傷，這與氟烷和異氟烷的麻醉研究和缺氧損傷研究結果一致[26-28]。

本研究發(fā)現(xiàn)鰱經(jīng)CO2麻醉后，水體中溶氧降至(1.07±0.15) mg/L，誘導腦組織中低氧誘導因子hif-1α基因表達上調(diào)。epo作為促紅細胞生成素基因，其表達與釋放受hif調(diào)控[29]，在缺氧條件下，epo產(chǎn)物可以通過激活抗氧化酶活性促進神經(jīng)元再生等方式保護腦內(nèi)神經(jīng)細胞[30]。CO2麻醉后epo顯著上調(diào)了3.66倍，可能因為CO2麻醉造成了鰱缺氧激活了hif-epo調(diào)控通路，hif-1α進入細胞并到達細胞核內(nèi)與DNA的缺氧反應基因啟動子相結合，促進epo基因轉(zhuǎn)錄[31]，使腦神經(jīng)系統(tǒng)避免低氧損傷，以維持鰱的正常生命活動。

以上研究結果表明，一定濃度CO2處理對鰱具有麻醉作用。CO2麻醉可能通過降低腦組織神經(jīng)遞質(zhì)含量降低神經(jīng)細胞興奮性，并激活K+通道產(chǎn)生外向電流，使神經(jīng)細胞膜超級化，中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到影響，進而產(chǎn)生激素分泌紊亂、新陳代謝變慢和應激反應減緩等效應。CO2麻醉對神經(jīng)遞質(zhì)的作用機制以及低氧誘導信號通路在麻醉過程的作用需要進一步的研究。綜上所述，CO2麻醉處理鰱是一種安全有效的方法，較一次性充氧處理，可以顯著降低鰱新陳代謝，有效減緩其應激反應。