劉曉丹，肖自東，孫 威，李席席，周一凡，張曉君

(揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009)

維氏氣單胞菌的檢測(cè)以往主要采用形態(tài)分類、生理生化分析等方法，這些方法不僅較為繁瑣，而且對(duì)血清型復(fù)雜、生化特征不穩(wěn)定的病原菌容易誤判。而分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展為病微生物快速檢測(cè)提供了新的技術(shù)方案，PCR技術(shù)具有快捷、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，已大量應(yīng)用于病原菌檢測(cè)。其中最為常見的是16S rRNA基因序列的常規(guī)PCR檢測(cè)，雖然其最低可檢測(cè)pg/μL級(jí)別的基因組DNA，但16S rRNA 序列對(duì)原核生物具有高度保守性，較難區(qū)分親緣關(guān)系較近的細(xì)菌，存在漏檢和假陽(yáng)性的可能性，相比之下，雙重PCR檢測(cè)因其特異性更強(qiáng)，靈敏度更高，廣泛應(yīng)用于細(xì)菌檢測(cè)[17-18]。

青蝦，學(xué)名日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)。在中國(guó)、日本、朝鮮半島以及東南亞都有著廣泛分布，具有生長(zhǎng)速度快，繁殖能力強(qiáng)，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高等特點(diǎn)。近年來(lái)青蝦養(yǎng)殖面積及其產(chǎn)量穩(wěn)步提高，但在青蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展過(guò)程中一直遇到病原微生物感染的難題，影響其健康養(yǎng)殖以及水產(chǎn)品的安全。其中維氏氣單胞菌是引起青蝦病害的主要致病菌之一[14]，快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)青蝦源維氏氣單胞菌對(duì)該菌引起的青蝦病害對(duì)疾病的預(yù)防、治療以及水產(chǎn)品安全性顯得尤為重要。本試驗(yàn)利用分子生物學(xué)檢測(cè)方法，根據(jù)NCBI已發(fā)表的維氏氣單胞菌CB51菌株基因組序列、促旋酶B亞單位基因gyrB和編碼細(xì)菌RNA聚合酶σ70因子基因rpoD的保守序列設(shè)計(jì)引物，設(shè)定合適的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件，建立了一種青蝦源維氏氣單胞菌的雙重PCR快速檢測(cè)方法，為青蝦源維氏氣單胞菌感染的臨床診斷、疾病治療、調(diào)查研究等提供重要參考資料。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

試驗(yàn)用維氏氣單胞菌Y3-1菌株由本試驗(yàn)室從發(fā)病青蝦中分離鑒定。嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)G3菌株、弗氏檸檬酸桿菌(C.freundii)LJ-1菌株、哈維弧菌(V.havveyi)DY-1菌株、 副溶血性弧菌(V.parahemolyticus)LNX-2菌株、需鈉弧菌(V.natriegens)XA-1菌株、非O1霍亂弧菌(non-O1V.cholerae)GXFL1-4菌株、陰溝腸桿菌(E.cloacae)XL3-1菌株、產(chǎn)氣腸桿菌(E.aerogenes)WF1-1菌株均由本試驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑

細(xì)菌DNA提取試劑盒、GelStain(全式金產(chǎn)品)；瓊脂糖(Biowest Agarose)；營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(青島海博公司生產(chǎn))；Premix Taq(Takara Taq Version 2.0 plus dye)、DL2000 DNA Marker(Takara生物公司生產(chǎn))。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)NCBI已報(bào)道的維氏氣單胞菌CB51菌株(NZ_CP015448.1)的gyrB和rpoD基因，通過(guò)Primer primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物序列，利用細(xì)菌16S rRNA基因通用引物進(jìn)行普通PCR檢測(cè)，序列及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度見表1。引物由南京擎科生物公司合成，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 模板DNA制備

將分離菌株在瓊脂培養(yǎng)基上劃線隔夜培養(yǎng)，挑取單菌落，接種于液體培養(yǎng)基中，28 ℃，180 r/min震蕩培養(yǎng)16 h，細(xì)菌DNA的獲得參照試劑盒所述方法提取，以此為檢測(cè)模板，-20 ℃保存。

1.5 分離菌的鑒定

為了鑒定分離菌株Y3-1，以分離菌的DNA作為模板，16S rRNA的通用引物為擴(kuò)增引物(表1)。試驗(yàn)使用20 μL體系，其中2×Premix Taq 10 μL，DNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 7 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min的預(yù)變性；94 ℃ 變性30 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸90 s，循環(huán)35次；最后72 ℃延伸7 min。PCR反應(yīng)完成后用1% 瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析，將擴(kuò)增產(chǎn)物送南京擎科生物公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序后所得到的16S rRNA基因序列利用BLAST進(jìn)行同源性分析。

同時(shí)，將分離菌分別接種于細(xì)菌理化特性鑒定用生化管中，測(cè)定分離菌理化特性，并對(duì)照《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》[19]對(duì)分離菌進(jìn)行種屬判定。

1.6 雙重PCR檢測(cè)方法的建立

以雙重PCR的兩對(duì)引物對(duì)模板進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)比較不同引物濃度、退火溫度及反應(yīng)體系下PCR的擴(kuò)增結(jié)果，優(yōu)化維氏氣單胞菌雙重PCR最佳反應(yīng)體系。最佳反應(yīng)體系為20 μL，其中DNA模板1 μL、 Premix Taq 10 μL、ddH2O 7 μL、 gyrB-F、R(10 μmol/L)各0.5 μL，rpoD-F、R(10 μmol/L )各0.5 μL；同時(shí)用ddH2O設(shè)置陰性對(duì)照。最佳反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s、35循環(huán)；72 ℃ 7 min，4 ℃保存。配置1.0%TAE緩沖液和1.0 % 凝膠，PCR產(chǎn)物5 μL，DL2000 Marker 5 μL，電泳110 V，35 min。

1.7 雙重PCR擴(kuò)增的特異性

以菌株維氏氣單胞菌Y3-1、哈維弧菌DY-1、弗氏檸檬酸桿菌LJ-1、副溶血性弧菌LNX-2、需鈉弧菌XA-1、霍亂弧菌GXFL1-4、陰溝腸桿菌XL3-1、產(chǎn)氣腸桿菌WF1-1、嗜水氣單胞菌樣品G3菌株的DNA為檢測(cè)模板，同時(shí)設(shè)置ddH2O作為模板的陰性對(duì)照組，按照1.6中建立的反應(yīng)條件進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增，檢測(cè)其特異性。

1.8 雙重PCR擴(kuò)增的靈敏性

將上述試驗(yàn)制備的維氏氣單胞菌(A.veronii)Y3-1 DNA模板，分光光度計(jì)測(cè)定濃度后，用滅菌的去離子水進(jìn)行10倍倍比(10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7)稀釋，以該稀釋液作為PCR模板，按上述建立的反應(yīng)條件進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增完成后，取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，記錄結(jié)果。

1.9 送檢樣品的檢測(cè)

對(duì)10份疑似維氏氣單胞菌(A.veronii) Y3-1感染的青蝦幼蝦送檢樣本，用無(wú)菌的生理鹽水對(duì)蝦體表進(jìn)行多次沖洗，將幼蝦體表面細(xì)菌沖洗干凈，再用75%的酒精棉球?qū)η辔r幼體體表進(jìn)行消毒。在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)，將蝦體制備成勻漿液，劃線接種于LB固體培養(yǎng)基，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。挑取優(yōu)勢(shì)單菌落移接于普通LB培養(yǎng)基斜面上，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，獲得純培養(yǎng)的細(xì)菌。之后將其接種到LB液體培養(yǎng)基中28 ℃，180 r/min，16 h擴(kuò)大培養(yǎng)。取1 mL菌液，用試劑盒提取細(xì)菌DNA，以此為雙重PCR模板，用上述所建立的檢測(cè)方法，對(duì)送檢樣品分離的細(xì)菌DNA進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)按照常規(guī)鑒定方法如生理生化及PCR檢測(cè)，對(duì)所分離細(xì)菌鑒定，以檢驗(yàn)雙重PCR檢測(cè)方法的可靠性。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 分離菌鑒定結(jié)果

在NCBI將分離菌Y3-1所擴(kuò)增的16S rRNA序列進(jìn)行Blast，其序列與多株維氏氣單胞菌的相似性為100%，表明Y3-1與維氏氣單胞菌的親緣關(guān)系非常近。分離菌的主要理化特性(表2)與《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》[19]中標(biāo)準(zhǔn)菌株維氏氣單胞菌的理化特性相符。因此，綜合理化特性以及分子鑒定結(jié)果，菌株Y3-1為維氏氣單胞菌。

表2 分離菌理化特性Tab.2 Physiological and biochemical characteristics of the isolates

注：“+”示陽(yáng)性，“-”示陰性，上標(biāo)*表示數(shù)據(jù)來(lái)自文獻(xiàn)[19]

2.2 雙重 PCR 反應(yīng)結(jié)果

將維氏氣單胞菌(A.veronii)Y3-1分離培養(yǎng)后，提取DNA，以此為PCR模板，利用設(shè)計(jì)的gyrB，rpoD兩對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。成像結(jié)果表明，建立的雙重PCR檢測(cè)方法擴(kuò)增出了兩條特異性帶，大小分別為815 bp、554 bp，ddH2O對(duì)照組未擴(kuò)增條帶，呈陰性(圖1)。

圖1 維氏氣單胞菌雙重PCR檢測(cè)Fig.1 Duplex PCR detection for A.veronii

CK:對(duì)照組；M：DL2000 DNA Marker；1：rpoD；2：gyrB；3：rpoD和gyrB

2.3 雙重PCR擴(kuò)增的特異性結(jié)果

利用建立的維氏氣單胞菌雙重PCR檢測(cè)方法對(duì)維氏氣單胞菌Y3-1菌株DNA以及8份不同樣品菌株DNA進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，維氏氣單胞菌Y3-1擴(kuò)增出了兩條目的條帶，大小分別為815 bp、554 bp，呈陽(yáng)性；其它菌株DNA以及ddH2O未擴(kuò)增出特異性條帶(圖2)。

圖2 維氏氣單胞菌雙重PCR特異性檢測(cè)Fig.2 Duplex PCR specificity of detection for A.veroniiM：DL2000 DNA Marker；1：維氏氣單胞菌Y3-1；2：哈維弧菌DY-1；3：嗜水氣單胞菌G3；4：副溶血性弧菌LNX-2；5：需鈉弧菌XA-1；6：霍亂弧菌GXFL1-4；7：陰溝腸桿菌XL3-1；8：產(chǎn)氣腸桿菌WF1-1；9:弗氏檸檬酸桿菌LJ-1；10：ddH2O。

2.4 雙重 PCR 擴(kuò)增的靈敏性結(jié)果

靈敏性檢測(cè)結(jié)果顯示，在1.8×10-2ng/μL 時(shí)仍能檢測(cè)到gyrB和rpoD的目的條帶，在1.8×10-3ng/μL 時(shí)只能檢測(cè)gyrB的目的條帶，所以該方法的靈敏度可達(dá)1.8×10-2ng/μL，靈敏度良好(見圖3)。

圖3 維氏氣單胞菌雙重PCR靈敏度檢測(cè)Fig.3 The sensitivity detection of duplex PCR for A.veroniiM:DL 2000 DNA Maker；1-8：1.8 ng/μL-1.8×10-7 ng/μL

2.5 送檢樣品雙重PCR檢測(cè)結(jié)果

應(yīng)用建立的雙重PCR方法檢測(cè)送檢樣品，結(jié)果檢出陽(yáng)性9份，1份樣本和對(duì)照組呈陰性(圖4)，檢測(cè)結(jié)果與生理生化、分子生物學(xué)鑒定的結(jié)果相符合。表明本試驗(yàn)方法準(zhǔn)確性高，適用于臨床檢測(cè)。

圖4 送檢樣品及陰性對(duì)照雙重PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Results of detection by duplex PCR for A.veroniiM:DL 2000 DNA Maker；1-10：送檢樣品；11:ddH2O

3 討論

潘曉藝等[20]、邊宇等[21]選擇16S rRNA和氣溶素(Aer)基因運(yùn)用于維氏氣單胞菌的快速檢測(cè)，這兩種檢測(cè)方法的靈敏度分別為1.35×10-3ng/μL 和1.58×10-3ng/μL，本實(shí)驗(yàn)建立的雙重PCR檢測(cè)方法最低檢測(cè)的基因組DNA濃度為1.8×10-2ng/μL，從靈敏度的角度，選擇維氏氣單胞菌16S rRNA和氣溶素(Aer)基因建立的雙重PCR檢測(cè)方法能夠檢測(cè)出更低濃度的模板。但是該檢測(cè)方法的檢測(cè)范圍只局限于攜帶氣溶素(Aer)基因的維氏氣單胞菌菌株，對(duì)于非致病菌株以及未攜Aer基因的菌株檢測(cè)效果不佳。且有調(diào)查顯示，不同來(lái)源的維氏氣單胞菌菌株毒力基因氣溶素?cái)y帶率為93.8%[22]，毒力基因攜帶情況不同，致病性也會(huì)有較大差異[23]，因此選用氣溶素等毒力基因作為PCR檢測(cè)對(duì)象不利于維氏氣單胞菌的流行病學(xué)調(diào)查。gyrB基因是編碼促旋酶B亞單位基因，該基因具有較高的堿基替換率，在氣單胞菌種間堿基最大差異為15.2 %，分辨率高，更適合親緣關(guān)系近的細(xì)菌鑒定[19,24]。朱成科等[25]利用gyrB基因和黏附素基因(Aha)建立了黃顙魚源維氏氣單胞菌雙重PCR檢測(cè)方法，該檢測(cè)方法對(duì)于維氏氣單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC35624及黃顙魚源分離菌株具有很好的檢測(cè)效果，細(xì)菌黏附素是細(xì)菌表面的一些大分子物質(zhì)，和細(xì)菌粘附密切相關(guān)，但鑒于細(xì)菌黏附素有很多種，因此并不是細(xì)菌分類鑒定的優(yōu)選基因。rpoD 是編碼細(xì)菌RNA聚合酶σ70因子基因，能夠?qū)Υ蟛糠謿鈫伟M(jìn)行準(zhǔn)確而一致的區(qū)分[26]，廣泛應(yīng)用于氣單胞菌屬的單基因分型[27]。管家基因gyrB和rpoD因其較保守，且具有一定變異的可能，通過(guò)分析其序列可以更好地區(qū)別同屬不同種[28]。因此本研究將gyrB和rpoD基因結(jié)合起來(lái)分析，分別設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，采用雙重PCR方法，以提高檢測(cè)準(zhǔn)確率。對(duì)青蝦源維氏氣單胞菌Y3-1擴(kuò)增出兩條大小分別為851 bp (gyrB)和554 bp(rpoD)的特異性條帶(圖1)，而對(duì)嗜水氣單胞菌等常見水產(chǎn)動(dòng)物病原菌檢測(cè)無(wú)交叉反應(yīng)，表明本試驗(yàn)建立的雙重PCR方法特異性良好(圖2)，且該檢測(cè)方法對(duì)DNA模板的最低檢測(cè)濃度為1.8×10-2ng/μL，也顯示出較好的靈敏性(圖3)，其臨床樣品檢測(cè)結(jié)果與生理生化鑒定結(jié)果保持一致(圖4)，表明本研究建立的雙重PCR檢測(cè)方法適用于青蝦源維氏氣單胞菌的檢測(cè)。

試驗(yàn)建立的青蝦致病株維氏氣單胞菌雙重PCR檢測(cè)方法，具有靈敏性較高、特異性較強(qiáng)等特點(diǎn)，能夠快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出青蝦源維氏氣單胞菌。