倪鐘濤 李財(cái)運(yùn) 胡旭雅 李 陽(yáng) 曾 皓 舒李露 王正加

(浙江農(nóng)林大學(xué)亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江杭州 311300)

硒(Se)是一種人體必需的微量元素,具有抗癌、保心保肝、防治近視和白內(nèi)障、提高免疫力、延緩衰老和增強(qiáng)生殖功能等多種藥理作用,享有“心臟的守護(hù)神”和“抗癌之王”的美譽(yù)[1]。硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(sulfate transporter,SULTR)是一類主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)硫酸鹽的載體蛋白,研究表明,SULTR在硫素的吸收、長(zhǎng)距離運(yùn)輸、硫同化、光合作用和細(xì)胞器運(yùn)輸中發(fā)揮重要作用[2]。硒和硫(S)是同一主族元素,硒酸鹽(selenate)和硫酸鹽(sulfate)具有相似的物理化學(xué)性質(zhì)[3]。硫酸鹽和硒酸鹽均能夠通過植物根系的吸收,經(jīng)硫轉(zhuǎn)運(yùn)途徑進(jìn)入植物體內(nèi),且二者相互競(jìng)爭(zhēng)影響植物對(duì)它們的吸收[4-5]。植物根系對(duì)不同形式的硒鹽吸收能力不同,其中對(duì)亞硒酸鹽是被動(dòng)吸收,其在植物體內(nèi)的積累濃度低于土壤環(huán)境；而對(duì)硒酸鹽的吸收是依賴轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的主動(dòng)吸收,其在體內(nèi)的積累濃度高于土壤環(huán)境[5-7]。

Smith等[8]最早從柱花草(Stylosantheshamata)的cDNA文庫(kù)中克隆到3個(gè)SULTR基因,之后相繼報(bào)道了擬南芥[9](Arabidopsis thaliana)、玉米[10](Zea maysL.)、大豆[11][Glycine max(Linn.)Merr.]和水稻[12](Oryza sativa)等植物中SULTR基因克隆及功能分析等方面的研究。擬南芥SULTR2.1通過低親和力將硫酸鹽或硒酸鹽從根皮層轉(zhuǎn)運(yùn)到木質(zhì)部薄壁細(xì)胞,是負(fù)責(zé)長(zhǎng)距離運(yùn)輸?shù)闹饕D(zhuǎn)運(yùn)蛋白[13]。White等[14]研究表明,硫酸鹽會(huì)抑制擬南芥根系對(duì)硒酸鹽的吸收,硫酸鹽和硒酸鹽二者相互競(jìng)爭(zhēng)硫轉(zhuǎn)運(yùn)途徑,因而高濃度硒酸鹽會(huì)使植物積累大量的硒元素從而引發(fā)毒性效應(yīng)。Shibagaki等[15]在硒鹽脅迫下,分離并鑒定了2個(gè)缺乏硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的擬南芥突變體,此類突變體對(duì)硒酸鹽具有耐受性且根長(zhǎng)較野生型明顯增加,表明硒酸鹽通過硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)入植物體,突變體植物不受硒毒害威脅且生長(zhǎng)較好。

目前,薄殼山核桃[Carya illinoinensis(Wangenh.)K.Koch]中有關(guān)硫轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和硒元素的報(bào)道尚鮮見。本研究從薄殼山核桃的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出與硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因高度相似的同源序列,通過RT-PCR和PCR技術(shù)克隆得到薄殼山核桃硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因CiSULTR2.1的cDNA序列,利用生物信息學(xué)方法分析基因的系統(tǒng)發(fā)育和蛋白結(jié)構(gòu),利用RT-qPCR技術(shù)研究基因在硒處理后不同時(shí)間以及薄殼山核桃不同組織中的表達(dá)變化,以期為薄殼山核桃硒吸收機(jī)制的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及前處理試驗(yàn)

選取生長(zhǎng)一致的一年生薄殼山核桃實(shí)生苗,洗凈根部泥土,通氣水培15 d后移至營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)(表1),用氣泵保持24 h通氣,營(yíng)養(yǎng)液每7 d更換一次。對(duì)照(Se1):原營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)；處理:營(yíng)養(yǎng)液中加入0.5(Se2)、5(Se3)、10(Se4)、20(Se5)、40(Se6)、80 μmol·L-1(Se7)不同濃度Na2SeO4溶液,每個(gè)處理3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)3株幼苗,40 d后觀察表型變化。根據(jù)薛瑞玲等[16]的方法研究不同濃度硒酸鹽對(duì)小白菜生長(zhǎng)生理特性影響,選取 0.5(促進(jìn))、40(抑制)、80 μmol·L-1(毒害)3 個(gè)硒酸鹽濃度分別處理 0、6、12、24、48 h后取幼苗完整幼根及頂端無(wú)病蟲害的幼嫩葉片用于RT-qPCR分析,經(jīng)液氮速凍后,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液配比Table 1 Hoagland nutrient solution ratio

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 薄殼山核桃幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定 按照地上、地下兩部分分離幼苗,采用BSA423S-CW電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司]依次稱量,精確度為0.001 g,并統(tǒng)計(jì)幼苗的葉片數(shù)。使用直尺測(cè)定地上、地下部分長(zhǎng)度,精確度為1 mm[17]。

1.2.2 薄殼山核桃幼苗根葉硒含量的測(cè)定 薄殼山核桃幼苗根葉的硒含量采用GB 5009.268-2016[18]中電感耦合等離子質(zhì)譜法(inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS)測(cè)定。

1.2.3 薄殼山核桃幼根和葉片RNA的提取及cDNA合成 利用CTAB法[19]結(jié)合minibest universal RNA Extraction Kit 9767試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司]提取薄殼山核桃幼根和葉片的 RNA,并通過NanoDrop分光光度計(jì)(Thermo Fisher,美國(guó))檢測(cè)RNA的純度和濃度,采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性,總RNA于-80℃保存?zhèn)溆?。利用PrimeScriptⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒[TaKaRa公司(日本)]反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA用于基因克隆；利用PrimeScriptTMRT Reagent Kit試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司]以處理不同時(shí)間和部位的樣品總RNA為材料合成cDNA,用于基因表達(dá)分析。

1.2.4 目的基因的克隆與測(cè)序 根據(jù)薄殼山核桃CiSULTR2.1的cDNA序列,利用ORF finder查找最大開放閱讀框(open reading frame,ORF),設(shè)計(jì)上、下游引物(表2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證。PCR擴(kuò)增以根部cDNA為模板,反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸2 min,30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳,用凝膠回收試劑盒[TaKaRa公司(日本)]回收目的片段,連接至pMD18-T載體[TaKaRa公司(日本)],轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株(浙江農(nóng)林大學(xué)經(jīng)濟(jì)樹種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存),經(jīng)菌落篩選及菌檢后將陽(yáng)性克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.2.5CiSULTR2.1的生物信息學(xué)分析 采用BLAST對(duì)基因核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行相似性分析；ORF finder對(duì)基因序列的ORF和編碼的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行分析；DNAMAN對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接與比對(duì),并且進(jìn)行多序列比對(duì)分析；SMART分析蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域；Protparam分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)；SOPMA預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)；MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；ProtScale分析蛋白質(zhì)的疏水性/親水性；SignalP預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的信號(hào)肽；WoLFPSORT和TargetP預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位；TMHMM預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)；SWISSMODEL軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.6CiSULTR2.1的表達(dá)分析 根據(jù)CiSULTR2.1基因序列設(shè)計(jì)RF-qPCR特異引物(表2),模板cDNA根據(jù)濃度稀釋至500 ng·μL-1。RT-qPCR反應(yīng)體系:SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ 5 μL,cDNA 0.5 μL,正反向引物各0.4 μL,加無(wú)菌水補(bǔ)足至10 μL,重復(fù)3次。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在CF×96 TM Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad,美國(guó))儀器上進(jìn)行,反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性3 min；95℃變性10 s,60℃退火30 s,40個(gè)循環(huán)；最后從65℃以每隔5 s上升0.5℃的速度升至95℃。以U6為內(nèi)參基因,默認(rèn)條件下讀取Ct值,采用2-△△Ct法[20]計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用GraphPad Prism 5軟件作圖,采用Microsoft Office Excel 2016統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù),采用SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。

表2 引物序列Table 2 Sequence of primers

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度硒酸鹽處理對(duì)薄殼山核桃幼苗生長(zhǎng)的影響

由圖1可知,不同硒酸鹽處理對(duì)薄殼山核桃的生長(zhǎng)存在較大的差異,與 Se1相比,Se2、Se3、Se4、Se5處理下幼苗根系發(fā)達(dá),葉片較多。Se6、Se7處理下幼苗根系較短,葉片較少。由表3可知,隨著硒酸鹽濃度的增加,薄殼山核桃幼苗地上重量、地下重量、地下長(zhǎng)度和葉片數(shù)差異明顯,整體呈先增加后減少的趨勢(shì),各處理間地上長(zhǎng)度差異不顯著。Se7處理下幼苗地上重量、地下長(zhǎng)度和葉片數(shù)均顯著低于Se1。

圖1 硒酸鹽處理下薄殼山核桃幼苗的生長(zhǎng)情況Fig.1 Growth of pecan seedlings treated with selenate

表3 硒酸鹽對(duì)薄殼山核桃幼苗地上和地下部分生長(zhǎng)的影響Table 3 Effect of selenate on the growth of above ground and underground parts of pecan selenate

2.2 不同濃度硒酸鹽處理下薄殼山核桃幼苗根葉中硒含量分析

由圖2可知,隨著硒酸鹽濃度的增加,薄殼山核桃幼苗根、葉的硒含量均呈先升高后降低的趨勢(shì),且根的硒含量總體上大于葉。根、葉中硒含量均在硒酸鹽液濃度為 40 μmol·L-1達(dá)到最大值。

圖2 不同濃度硒酸鹽處理對(duì)薄殼山核桃幼苗硒含量的影響Fig.2 Effects of different selehate concentrations on selenium content in pecan seedlings

2.3 CiSULTR2.1的cDNA克隆

以薄殼山核桃幼苗根的cDNA為模板,擴(kuò)增得到長(zhǎng)為1 902 bp的序列,經(jīng)比對(duì)分析,獲得硫轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白同源基因CiSULTR2.1(圖3)。分析全長(zhǎng)開放閱讀框,結(jié)果表明其編碼633個(gè)氨基酸(圖4)。利用NCBI網(wǎng)站BLAST將CiSULTR2.1的核苷酸序列和氨基酸序列進(jìn)行比對(duì),結(jié)果發(fā)現(xiàn)CiSULTR2.1核苷酸序列與胡桃(Juglans regia,ID:XM_018973400.1)、栓皮櫟(Quercus suber,ID:XM_024048776.1)和梅花(Prunus mume,ID:XM_008235771.2)的SULTR2(第二亞族)基因核苷酸序列的相似性較高,分別為 97.06%、84.28%和76.91%(圖 5)。CiSULTR2.1氨基酸序列與胡桃(Juglans regia,ID:XP_018828945.1)、栓皮櫟(Quercussuber,ID:POE45311.1)和甜橙(Citrus sinensis,ID:XP_006472651.1)的SULTR2蛋白氨基酸序列的相似性分別為96.68%、79.15%和74.61%(圖6)。

圖3 CiSULTR2.1的cDNA全長(zhǎng)擴(kuò)增Fig.3 The cDNA full-length amplification of CiSULTR2.1

圖4 CiSULTR2.1基因核苷酸及推測(cè)的氨基酸序列Fig.4 The nucleotide and deduced amino acid sequence of CiSULTR2.1

圖5 CiSULTR2.1與其他植物SULTR2核苷酸序列的相似度Fig.5 Similarity of nucleotide sequences between CiSULTR2.1 and SULTR2 of other plants

圖6 CiSULTR2.1與其他植物SULTR2氨基酸序列的相似度Fig.6 Similarity of amino acid sequences between CiSULTR2.1 and SULTR2 of other plants

2.4 CiSULTR2.1蛋白基本理化性質(zhì)分析

2.4.1 CiSULTR2.1蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析ProtParam分析表明,CiSULTR2.1蛋白的分子式為C3152H5058N802O866S28,分子質(zhì)量為68 943.37 Da,理論等電點(diǎn)為9.03,負(fù)電荷氨基酸殘基總數(shù)(Asp+Glu)為44,正電荷氨基酸殘基總數(shù)(Arg+Lys)為53,總體親水性為0.531,脂溶性指數(shù)為117.68,不穩(wěn)定系數(shù)為36.79,屬于穩(wěn)定蛋白。

SMART分析表明,CiSULTR2.1蛋白具有硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白典型的結(jié)構(gòu)域,其中,在N-的Sulfate-transp結(jié)構(gòu)域(PF00916,95～477)同源性較高,包含了8個(gè)TMDs；C-的 STAS結(jié)構(gòu)域(PF01740,528～614)是硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的抗σ因子(anti-sigma factor)(圖7)。

圖7 CiSULTR2.1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域Fig.7 Conservative domains of CiSULTR2.1 protein

2.4.2 CiSULTR2.1蛋白疏水性/親水性預(yù)測(cè)ProtScale分析表明,CiSULTR2.1蛋白疏水區(qū)和親水區(qū)差別明顯,其中第444位疏水性最強(qiáng),分?jǐn)?shù)為3.156,第568位親水性最強(qiáng),分?jǐn)?shù)為-2.678(圖8)。綜上表明CiSULTR2.1蛋白為疏水性蛋白。

2.4.3 CiSULTR2.1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) SOPMA分析表明,依次有324、198、80、31個(gè)氨基酸參與形成α-螺旋(α-helix)、無(wú)規(guī)則卷曲(random coil)、延伸鏈(extended strand)和 β-轉(zhuǎn)角(β-turn),占比分別為51.18%、31.28%、12.64%和 4.90%(圖 9)。 表明CiSULTR2.1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中含有豐富的α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲,其中α-螺旋可參與形成多個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。

圖8 CiSULTR2.1蛋白疏水性/親水性預(yù)測(cè)Fig.8 Prediction of the hydrophobic/hydrophilic of CiSULTR2.1 protein

2.4.4 CiSULTR2.1蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)和亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè) SignalP預(yù)測(cè)顯示,CiSULTR2.1蛋白無(wú)信號(hào)肽輸出位點(diǎn),屬于非分泌蛋白。TargetP預(yù)測(cè)顯示,該蛋白定位在葉綠體和線粒體上的可能性較小,且不屬于分泌蛋白；WoLFPSORT預(yù)測(cè)顯示,CiSULTR2.1蛋白主要定位在膜內(nèi),是一種膜內(nèi)在蛋白。上述結(jié)果表明CiSULTR2.1蛋白具有跨膜結(jié)構(gòu)域,可能參與硫酸鹽在細(xì)胞內(nèi)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。

2.4.5 CiSULTR2.1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域及三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè) 對(duì)CiSULTR2.1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)表明,CiSULTR2.1蛋白具有8個(gè)TMDs,分布于第180～第493位(圖10),表明CiSULTR2.1蛋白屬于跨膜蛋白。SWISS-MODEL預(yù)測(cè)顯示,CiSULTR2.1蛋白含有14個(gè)α-螺旋,這些α-螺旋相互圍繞形成一個(gè)通道結(jié)構(gòu),實(shí)現(xiàn)對(duì)硫酸鹽的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)(圖11)。

圖9 CiSULTR2.1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.9 Prediction of the secondary structure of CiSULTR2.1 protein

圖10 CiSULTR2.1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.10 Prediction of the transmembranedomain of CiSULTR2.1 protein

2.5 CiSULTR2.1蛋白序列的同源性與系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用DNAMAN軟件對(duì)薄殼山核桃與其他物種SULTR(第二亞族)基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行多重比較分析(圖12),發(fā)現(xiàn)序列比對(duì)的一致性達(dá)到72.39%,薄殼山核桃與其他物種具有較高的同源性,均含有Sulfate-transp結(jié)構(gòu)域和STAS結(jié)構(gòu)域,表明不同物種的SULTR氨基酸序列的保守性較高,但在長(zhǎng)度和氨基酸組成上存在差異性。

圖11 CiSULTR2.1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.11 Prediction of the tertiary structure ofCiSULTR2.1 protein

根據(jù) 10個(gè) SULTR基因的氨基酸序列,利用MEGA7.0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹。由圖13可知,薄殼山核桃與胡桃、栓皮櫟聚為一大類,并與胡桃的親緣關(guān)系最近。木薯與橡膠聚為一類,榴蓮與可可聚為一類,其他物種各為一類。

2.6 CiSULTR2.1的表達(dá)分析

由圖14可知,CiSULTR2.1在根、葉中均有表達(dá)。不同濃度硒酸鹽處理6 h,根、葉中CiSULTR2.1的相對(duì)表達(dá)量均與對(duì)照相近,而處理12 h時(shí)Se6、Se7根和葉中表達(dá)量均極顯著高于對(duì)照,之后出現(xiàn)不同程度的下降。Se2根和葉中CiSULTR2.1的表達(dá)高峰延遲至處理48 h,處理12、24 h時(shí),根和葉中CiSULTR2.1相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照相近。在根中,處理 24 h時(shí) Se6CiSULTR2.1的相對(duì)表達(dá)量仍高于對(duì)照；在葉中,處理24 h和48 h時(shí)Se6、Se7CiSULTR2.1的相對(duì)表達(dá)量均極顯著低于對(duì)照。CiSULTR2.1在根、葉中的相對(duì)表達(dá)量(除Se2)均隨著硒酸鹽處理時(shí)間的延長(zhǎng),總體呈先上升后下降的趨勢(shì)。

圖13 CiSULTR2.1與其他植物SULTR2蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.13 Phylogenetic analysis of protein between CiSULTR2.1 and SULTR2 of other plants

圖14 根、葉中不同濃度硒酸鹽處理后CiSULTR2.1的表達(dá)分析Fig.14 Expression analysis of CiSULTR2.1 in root or leaf after treatment with different concentrations of selenate

3 討論

本研究從薄殼山核桃中克隆得到CiSULTR2.1基因,開放閱讀框序列長(zhǎng)度為1 902 bp,編碼633個(gè)氨基酸,與前人報(bào)道SULTR基因長(zhǎng)度范圍一致[21-23]。通過生物信息學(xué)分析,CiSULTR2.1蛋白包含Sulfatetransp結(jié)構(gòu)域(PF00916)和STAS結(jié)構(gòu)域(PF01740),STAS結(jié)構(gòu)域是RNA聚合酶指導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄的一種抑制子,其過量表達(dá)甚至本體表達(dá)都會(huì)導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)閉,進(jìn)而控制基因的表達(dá)[24]。研究表明,酵母中硫轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能依賴于STAS結(jié)構(gòu)域,該區(qū)域與硫轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性和穩(wěn)定性密切相關(guān)[25]。CiSULTR2.1蛋白具有8個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域,是定位于膜內(nèi)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,其三級(jí)結(jié)構(gòu)含有14個(gè)α-螺旋,且α-螺旋相互圍繞形成通道對(duì)硫酸鹽進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。這與前人在馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)[21]、短柄草(Brachypodium distachyon)[22]、高粱(Sorghum bicolorL.)[23]上的研究結(jié)果一致。

根據(jù)序列的同源性,硫轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因可分為4個(gè)亞族,其中CiSULTR2.1屬于第2亞族,主要負(fù)責(zé)硫酸鹽從根系向地上部分的長(zhǎng)距離轉(zhuǎn)運(yùn)[25],同時(shí)其表達(dá)也受到硒酸鹽的調(diào)控。目前,在擬南芥[9]和馬鈴薯[21]中均克隆出12種SULTR基因,短柄草中得到10種SULTR基因[22],高粱中得到11種SULTR基因[23],不同亞族成員的表達(dá)具有組織和時(shí)空的特異性[26]。

本研究結(jié)果表明,不同濃度硒酸鹽處理對(duì)薄殼山核桃幼苗生長(zhǎng)有不同的影響。隨著硒酸鹽濃度的增加,薄殼山核桃幼苗地上重量、地下重量、地下長(zhǎng)度和葉片數(shù)個(gè)別組間差異顯著且均呈先增加后減少的趨勢(shì),表明低濃度硒酸鹽可以促進(jìn)薄殼山核桃幼苗生長(zhǎng),高濃度硒酸鹽會(huì)抑制幼苗生長(zhǎng)。RT-qPCR技術(shù)分析CiSULTR2.1基因的表達(dá)發(fā)現(xiàn),其在薄殼山核桃幼苗根、葉中均有表達(dá),且呈現(xiàn)一定的規(guī)律性。40、80 μmol·L-1硒酸鹽處理 12 h時(shí),CiSULTR2.1出現(xiàn)表達(dá)高峰,此后相對(duì)表達(dá)量明顯下降；而0.5 μmol·L-1硒酸鹽處理下,CiSULTR2.1表達(dá)高峰出現(xiàn)時(shí)間延后至處理48 h,這與茶樹[3,27]上的研究結(jié)果一致。表明CiSULTR2.1對(duì)硒元素在薄殼山核桃中的轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)揮作用,且CiSULTR2.1在短時(shí)間內(nèi)能夠快速響應(yīng)高濃度硒酸鹽的誘導(dǎo),而低濃度硒酸鹽需要較長(zhǎng)時(shí)間才能誘導(dǎo)CiSULTR2.1表達(dá)。本研究結(jié)果表明,高濃度硒酸鹽處理時(shí)間過長(zhǎng),CiSULTR2.1相對(duì)表達(dá)量顯著下降且低于對(duì)照,表明高濃度硒酸鹽對(duì)幼苗產(chǎn)生毒性效應(yīng)[5],這與趙文龍等[28]對(duì)小白菜施加高濃度硒酸鹽后產(chǎn)生毒害作用的研究結(jié)果一致,即高濃度硒酸鹽處理下植物體通過降低基因的表達(dá),減少對(duì)硒酸鹽的吸收。此外,當(dāng)硒濃度≤40 μmol·L-1時(shí),根、葉中硒含量與硒酸鹽處理濃度呈正相關(guān),這與劉華山[29]對(duì)生菜的研究結(jié)果一致。本研究中,80 μmol·L-1硒酸鹽處理下幼苗根和葉中硒含量明顯減少,表明 40～80 μmol·L-1之間存在某個(gè)濃度使得幼苗的硒含量達(dá)到峰值。

4 結(jié)論

本研究克隆了薄殼山核桃CiSULTR2.1基因的全長(zhǎng)cDNA序列,其ORF序列長(zhǎng)1 902 bp,編碼633個(gè)氨基酸,具有典型的sulfate-transp結(jié)構(gòu)域(PF00916)和STAS結(jié)構(gòu)域(PF01740)。利用不同濃度的硒酸鹽處理薄殼山核桃水培幼苗,發(fā)現(xiàn)低濃度硒酸鹽處理下幼苗生長(zhǎng)較好。幼苗的硒含量隨著硒酸鹽濃度的增加而增加,40、80 μmol·L-1間存在某一個(gè)濃度使得幼苗的硒含量達(dá)到峰值。通過對(duì)CiSULTR2.1基因的高表達(dá)分析發(fā)現(xiàn),40、80 μmol·L-1高濃度硒酸鹽能夠快速誘導(dǎo)CiSULTR2.1 基因的高表達(dá)；而 0.5 μmol·L-1低濃度硒酸鹽需要較長(zhǎng)的時(shí)間才能誘導(dǎo)CiSULTR2.1基因的高表達(dá)。本研究?jī)H克隆了1個(gè)CiSULTR基因,對(duì)其他CiSULTR基因的克隆及表達(dá)分析有待進(jìn)一步深入研究。