任立松 葛建兵 蔡興忱 劉孝良 吳 艷

(1.遼寧省蠶業(yè)科學(xué)研究所，遼寧鳳城 118100； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，北京 100083)

DNJ首先是由M.Yagi等從桑樹(MorusalbaL.) 根皮中分離得到的一種天然生物堿，并定名為“moranoline”[1]，中文名稱1-脫氧野尻霉素。這種生物堿是哺乳動(dòng)物α-糖苷酶的強(qiáng)效的糖代謝酶抑制劑。DNJ可顯著延緩多糖的降解過(guò)程，通過(guò)降低碳水化合物消化和葡萄糖的吸收可降低餐后血糖的峰值。此外，DNJ還有胰島素增敏的作用，可改善胰島素抵抗的癥狀，還具有抗病毒、抗腫瘤轉(zhuǎn)移等藥理作用。桑樹中的DNJ主要分布在桑樹的葉、枝和根，桑葉占整個(gè)桑樹干物質(zhì)的比例最大，約占其65%，因而桑葉已經(jīng)成為目前獲取天然DNJ的主要來(lái)源，但其含量大小易受到桑樹產(chǎn)地、品種、葉位、采摘時(shí)期、生長(zhǎng)環(huán)境等因素的影響。本文對(duì)東北三省主要栽培的10 個(gè)桑樹品種的葉片進(jìn)行DNJ測(cè)定，以探明東北地區(qū)各桑種品種間DNJ含量的差異，為北方地區(qū)桑樹藥食用途品種選育和桑樹資源多元化利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為遼寧省蠶業(yè)科學(xué)研究所桑樹種質(zhì)資源圃中栽植的東北三省主要桑種品種，包括遼寧省的遼魯11號(hào)，遼育8號(hào)，遼育16號(hào)，遼育166號(hào)，遼劍44號(hào)，白果桑，魯桑11號(hào)和順山秋雨8個(gè)品種，吉林省的吉湖四號(hào)，黑龍江省的龍桑1號(hào)，共10個(gè)品種。于 2017 年 8月上旬采摘植株上部枝條第4—6位葉，50 ℃烘干至恒重。以上樣品粉碎后過(guò) 60目篩備用。

1.2 方法

1.2.1 試劑

濃鹽酸、乙酸銨、氯化鉀、硼酸、氫氧化鈉(分析純，北京化工廠)；

乙腈(色譜純，北京百靈威科技有限公司)；

冰乙酸(色譜純，天津津科精細(xì)化工研究所)；

9-氯甲酸芴甲酯(FMOC-Cl，純度>98%，北京百靈威科技有限公司)；

1-脫氧野尻霉素標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99%，北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司)；

去離子水采用Milli-Q(Millipore，bedfford，MA)系統(tǒng)制備的超純水(電阻率≥18.2 Ω，美國(guó)Millipore公司)。

1.2.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器(HPLC-DAD，型號(hào)：Agilent 1260，美國(guó)安捷倫公司)；

色譜柱Agilent Zorbax Eclipse plus C18 (4.6 mm×150 mm，5.0 μm，美國(guó)安捷倫公司)；

電子天平(BSA224S-CW)(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)；

DHG-9123A型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；

渦旋振蕩器，高功率數(shù)控超聲波清洗器(KQ-600DA型，昆山市超聲儀器有限公司)；

離心機(jī)(TGL-20bR，上海安亭科學(xué)儀器廠)；

高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(FW100， 天津市泰斯特儀器有限公司)；

2 mL一次性注射器(上海治宇醫(yī)療器械有限公司)；

10 mL離心管，100 mL 容量瓶，0.22 μm有機(jī)相濾膜(北京藍(lán)弋公司)；

pH計(jì)(PHS-2F，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)。

1.2.3 待測(cè)樣品的制備

精確稱取桑葉粉0.5 g于50 mL離心管中，加入25 mL 0.05 mol/L鹽酸溶液，超聲水浴20 min，離心[7012(×g), 5 min],取上層清液于50 mL容量瓶中，殘?jiān)貜?fù)提取1次，合并兩次上層清液，最后用提取溶劑定容至50 mL，待測(cè)。

吸取100 μL 待測(cè)液，準(zhǔn)確加入100 μL 硼酸鹽緩沖液，再準(zhǔn)確加入700 μL FMOC-Cl，渦旋振蕩30 s，然后30 ℃水浴反應(yīng)10 min。完成后過(guò)0.22 μm 水相濾膜進(jìn)行HPLC測(cè)定。

1.2.4 上機(jī)條件

參考魏兆軍等人[2]的方法，并有所改動(dòng)。采用高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器(HPLC-DAD)對(duì)桑葉中的生物堿類成分進(jìn)行分析，并主要對(duì)DNJ進(jìn)行定性分析。

色譜柱Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18(4.6 mm×150 mm，5.0 μm)；流動(dòng)相A為10 mmol/L乙酸銨、pH4.0的緩沖溶液，流動(dòng)相B為乙腈與甲醇之比為1∶1的洗脫液。梯度洗脫，洗脫程序見表1。柱溫25 ℃；流速0.800 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，采集時(shí)間40 min。

表1 HPLC-DAD的洗脫程序

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)使用Microsoft Excel 2010(美國(guó)微軟公司)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。所有的數(shù)據(jù)都是每個(gè)樣品3個(gè)平行，以平均值表示。

2 結(jié)果

2.1 不同桑樹品種間桑葉中DNJ含量及相關(guān)性狀的遺傳差異

桑葉樣品中的 DNJ 含量見表2。

表2 東北地區(qū)主要桑樹品種桑葉中DNJ含量

由表2可以看出，10個(gè)桑樹中DNJ 含量最高的是遼劍44號(hào)(3.306 mg/g)，依次是遼育8號(hào)、遼育166、遼魯11號(hào)、遼育16、白果桑、魯桑11號(hào)、順山秋雨、龍桑1號(hào)和吉湖4號(hào)。

10個(gè)桑樹品種中鮮葉重最重的品種是遼育166(6.446 g)，其次是遼育8號(hào)(5.641 g)和遼劍44(5.607 g)，鮮葉重最輕的是順山秋雨(3.391 g)；干葉重最重的是遼育166(1.740 g)，其次是遼育16(1.579 g)和遼育8號(hào)(1.575 g)，干葉重最輕的是順山秋雨(0.933 g)。脫水率最高的是遼劍44(74.62%)，其次是遼魯11(73.32%)和遼育166(73.01%)，脫水率最低的是魯桑11號(hào)(63.11%)。

2.2 桑葉中DNJ含量與相關(guān)性狀間的相關(guān)關(guān)系

對(duì)桑葉中DNJ含量及鮮葉重、干葉重和脫水率之間進(jìn)行相關(guān)分析，以探索各性狀間的相互關(guān)系，分析結(jié)果見表3、圖1-3。

表3 DNJ含量與鮮葉重、干葉重、脫水率的相關(guān)關(guān)系

項(xiàng)目參數(shù)DNJ含量/(mg/g)鮮葉重/g干葉重/g脫水率/%DNJ質(zhì)量比/(mg/g)r10.7350.4800.594p0.0150.1600.070鮮葉重/gr0.8670.460p0.0010.181干葉重/gr-0.040p0.912

圖1 DNJ含量與鮮葉重的相關(guān)關(guān)系

圖2 DNJ含量與干葉重的相關(guān)關(guān)系

圖3 DNJ含量與脫水率的相關(guān)關(guān)系

1)從表3可以看出，鮮葉重與DNJ含量呈顯著的正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.735。從圖1可知，鮮葉重較輕時(shí)，其DNJ含量較低，但也不是DNJ含量越高，鮮葉重就越大，從圖中可以看出當(dāng)鮮葉重達(dá)到5.5 g以上時(shí)，DNJ的含量相對(duì)較高。鮮葉重最大時(shí)，DNJ的含量并不是最高的。因此，要想獲取DNJ含量較高的桑葉，應(yīng)選擇單葉重在5.5 g以上的桑樹品種。

2)從表3可以看出，DNJ含量與干葉重呈正相關(guān)關(guān)系，但不顯著，相關(guān)系數(shù)為0.48。從圖2可知，DNJ含量最高的桑樹品種其干葉重并非最大，干葉重最大的其DNJ含量介于群體均值左右。因此也無(wú)法根據(jù)桑樹品種的干葉重來(lái)判斷其DNJ含量的高低。

3)從表3可以看出，桑葉中DNJ含量與桑葉脫水率呈正相關(guān)關(guān)系，達(dá)到了準(zhǔn)顯著水平，其相關(guān)系數(shù)為0.594。從圖3可知，雖然DNJ含量沒(méi)有完全隨著脫水率的增加而增加，但還是有一定的相關(guān)趨勢(shì)。

3 結(jié) 論

10個(gè)桑樹品種中桑葉DNJ含量最高的是遼劍44號(hào)，其它品種按DNJ含量高低依次是遼育8號(hào)、遼育166、遼魯11號(hào)、遼育16、白果桑、魯桑11號(hào)、順山秋雨、龍桑1號(hào)和吉湖4號(hào)。排名第2、第3、第4的是遼育8號(hào)、遼育166和遼魯11號(hào)，這3個(gè)品種是遼寧省蠶業(yè)科學(xué)研究所自上世紀(jì)80年代以來(lái)選育的主要桑樹品種，具有優(yōu)質(zhì)、豐產(chǎn)和抗寒的特性，并在遼、吉、黑等地大面積推廣應(yīng)用。隨著現(xiàn)代科技的發(fā)展和市場(chǎng)的變化，蠶桑產(chǎn)業(yè)已向蠶桑資源的多元化綜合利用方向發(fā)展，DNJ含量的測(cè)定可為北方地區(qū)桑樹藥食用途品種選育提供科學(xué)依據(jù)。

DNJ含量與鮮葉重呈顯著的正相關(guān)關(guān)系，雖然與干葉重和脫水率也有一定的正相關(guān)關(guān)系，但相關(guān)程度均不顯著，因此可通過(guò)判斷不同桑樹品種的鮮葉重來(lái)推斷DNJ含量的高低。