高鴻鵬 杜 賡 李文強 董小龍 蘇 超 張敏娟*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)蠶桑絲綢研究所/ 2.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

由于過去工業(yè)和礦業(yè)的長期粗放式發(fā)展，土壤重金屬污染對農(nóng)業(yè)的嚴重危害漸漸顯現(xiàn)。我國農(nóng)業(yè)土壤受重金屬影響已達2 000萬公頃，其中鎘的危害性位列第一，其次是鉛、鋅、銅和汞。重金屬脅迫下，作物生長發(fā)育異常，糧食減產(chǎn)，年經(jīng)濟損失達200億元[1]。 鎘和砷是礦區(qū)土地重金屬污染的前兩位首要污染物，都具有強烈的毒性，其污染范圍廣、穩(wěn)定不可降解，在環(huán)境中可長期積累[2-3]。鎘和砷被植物吸收之后直接影響了植物的生長和產(chǎn)量，并且，土壤中的鎘和砷可以通過食物鏈進入人體，危害人類健康，所以，植物在重金屬脅迫下的損傷與抗性機制研究已成為研究熱點。因此，對植物鎘、砷脅迫下的生長和發(fā)育進行研究，探討鎘、砷毒害對植物生長的影響，能夠為預(yù)防作物減產(chǎn)和鎘、砷中毒提供理論依據(jù)。

種子萌發(fā)和幼苗生長是植物生命周期的重要階段，也是對外界環(huán)境因子最敏感的時期之一，因而種子萌發(fā)和苗期生長指標常用來評價植物的重金屬耐性[4-8]。種子萌發(fā)是植物生長發(fā)育的基礎(chǔ)，也是植物最早感受重金屬脅迫的階段，了解種子萌發(fā)對逆境脅迫的反應(yīng)，是系統(tǒng)認識逆境傷害機理的較好途徑。桑樹作為具有重要修復(fù)潛力的木本植物，其在重金屬污染土壤修復(fù)方面的可行性已被研究證實[9-13]。研究發(fā)現(xiàn)，在重金屬污染地區(qū)，種子受重金屬脅迫傷害，會造成發(fā)芽率降低，生長緩慢，根部發(fā)育不良等現(xiàn)象。而有關(guān)外源物質(zhì)緩解重金屬鎘或砷脅迫對桑樹種子萌發(fā)的傷害研究尚未見報道。

硫化氫是重要的氣體信號分子，能夠緩解非生物脅迫對植物的傷害作用，對于植物抵抗逆境脅迫非常重要[14-15]。本研究擬利用硫化氫的供體硫氫化鈉溶液浸種處理，探討外源施加硫化氫是否能夠緩解重金屬鎘或砷對于桑樹種子萌發(fā)及生長的脅迫作用，為闡明鎘、砷脅迫下的植物損傷與抗性機制提供理論依據(jù)，同時為緩解鎘、砷對植物的毒害作用進而提高植物的產(chǎn)量和品質(zhì)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以桑樹品種豐馳桑的種子為材料，桑種采集于上一年四月到五月，4 ℃保存。重金屬鎘和砷的供體為無水氯化鎘(CdCl2)和無水亞砷酸鈉(NaASO2)，以上試劑購自Aladdin公司。H2S供體為硫氫化鈉(NaHS)購自Sigma公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子消毒

將種子清洗干凈，加入適量水，種子吸水12 h進行活化。將吸脹的種子置于超凈工作臺上，以70%酒精消毒5 min，次氯酸鈉溶液(有效氯含量不低于1%)消毒30 min，無菌水漂洗，無菌種子置于無菌濾紙上靜置吹干，至表面無明顯水漬時，用于下一步試驗。

1.2.2 萌發(fā)試驗

采用瓊脂平板作為發(fā)芽床進行萌發(fā)試驗，重金屬處理包括鎘處理和砷處理，分別以種子發(fā)芽抑制率大于50%的重金屬濃度作為處理濃度，其中，鎘濃度設(shè)置為0.15 mmol/L，砷濃度設(shè)置為38 mmol/L，向各組重金屬處理液中加入7 g/L瓊脂，高溫高壓滅菌后制備瓊脂平板，空白對照組(CK)用蒸餾水制備瓊脂平板。

1.2.3 硫氫化鈉浸種處理

設(shè)置硫氫化鈉濃度為0 mmol/L，0.3 mmol/L，0.9 mmol/L, 1.5 mmol/L，室溫浸種12 h。將消毒后的種子整齊排列在上述平板上，每皿30粒種子，每個處理設(shè)置3組重復(fù)，培養(yǎng)皿于23 ℃恒溫培養(yǎng)室暗培養(yǎng)。

1. 3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

以芽長與種子長度相等即認為發(fā)芽，每天定時對每個培養(yǎng)皿發(fā)芽種子數(shù)進行統(tǒng)計。用游標卡尺測量發(fā)芽種子的芽長和根長。計算種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、(平均)種苗生長量和種子活力指數(shù)。發(fā)芽率為最終發(fā)芽數(shù)與供試種子數(shù)比值。發(fā)芽勢為發(fā)芽高峰期發(fā)芽種子數(shù)與供試數(shù)比值，取開始發(fā)芽的4 d為標準。計算公式如下：

發(fā)芽指數(shù)：

式中Gt為發(fā)芽種子粒數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽日數(shù)，即(當天發(fā)芽數(shù)/發(fā)芽日數(shù))的累加。

種子活力指數(shù)：

式中S即種苗生長量，為種苗的全長。

用Excel和SPSS軟件處理數(shù)據(jù)，計算3次重復(fù)的“平均值±標準差”，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan’s方法比較不同數(shù)據(jù)組間的差異，顯著性水平設(shè)置為0.05。

圖1 硫化氫對鎘脅迫下桑樹種子萌發(fā)指標的影響注：鎘處理濃度為0.15 mmol/L，硫氫化鈉濃度為0 mmol/L，0.3 mmol/L，0.9 mmol/L，1.5 mmol/L，不同小寫字母表示處理之間具有顯著性差異(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源硫化氫對鎘脅迫下桑樹種子萌發(fā)及幼苗生長的影響

如圖1所示，0.15 mmol/L鎘脅迫下桑樹種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)急劇下降，其中發(fā)芽率降低了41.1%，發(fā)芽勢降低了63.3%。硫氫化鈉浸種處理緩解了鎘脅迫對種子萌發(fā)的抑制，種子平均發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)升高。0.3 mmol/L硫氫化鈉浸種處理發(fā)芽率升高不顯著，0.9 mmol/L和1.5 mmol/L硫氫化鈉處理組發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)顯著升高，其中，1.5 mmol/L硫氫化鈉處理組發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)分別升高了28.9%，46.7%和10.3。與空白對照相比，1.5 mmol/L硫氫化鈉浸種后鎘脅迫處理，種子發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)分別降低了12.2%和16.7%，沒有顯著性差異，說明1.5 mmol/L硫氫化鈉浸種緩解了0.15 mmol/L鎘脅迫對種子萌發(fā)的抑制作用。

從種苗生長量和種子活力指數(shù)看(圖2)，0.3 mmol/L和0.9 mmol/L硫氫化鈉浸種處理后種子活力指數(shù)和種苗生長量與0.15 mmol/L鎘脅迫處理沒有顯著差異，1.5 mmol/L硫氫化鈉浸種后種子活力指數(shù)和種苗生長量顯著高于鎘脅迫處理種子，而顯著低于空白對照種子，說明1.5 mmol/L硫氫化鈉浸種處理能夠緩解鎘脅迫對種子萌發(fā)后幼苗生長的抑制作用，但不能使幼苗完全恢復(fù)非脅迫下的生長水平。

圖2 硫化氫對鎘脅迫下種苗生長量以及種子活力指數(shù)的影響注：鎘處理濃度為0.15 mmol/L，硫氫化鈉濃度為0 mmol/L，0.3 mmol/L，0.9 mmol/L，1.5 mmol/L，不同小寫字母表示處理之間具有顯著性差異(P<0.05)。

2.2 外源硫化氫對砷脅迫下桑樹種子萌發(fā)和幼苗生長的影響

如圖3所示，38 mmol/L砷脅迫下桑樹種子萌發(fā)受到顯著抑制，發(fā)芽率降低了41.1%，發(fā)芽勢降低了53.3%，發(fā)芽指數(shù)降低了8.9。1.5 mmol/L硫氫化鈉浸種處理能夠緩解砷脅迫對種子萌發(fā)抑制作用，0.3 mmol/L硫氫化鈉浸種處理后種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢分別升高了27.8%和35.6%，顯著高于砷處理組。0.9 mmol/L和1.5 mmol/L硫氫化鈉浸種后，二者之間發(fā)芽勢、發(fā)芽勢及發(fā)芽指數(shù)沒有顯著差異，但二者的發(fā)芽勢、發(fā)芽勢及發(fā)芽指數(shù)均顯著低于空白對照組，發(fā)芽率和發(fā)芽勢比對照分別降低了13.3%和17.8%，表明NaHS處理能夠緩解砷對種子萌發(fā)的脅迫，且此種效應(yīng)具有劑量依賴性。

圖3 硫化氫對砷脅迫下桑樹種子萌發(fā)指標的影響注：砷處理濃度為38 mmol/L，硫氫化鈉濃度為0 mmol/L，0.3 mmol/L, 0.9 mmol/L,1.5 mmol/L，不同小寫字母表示處理之間具有顯著性差異(P<0.05)。

活力指數(shù)是表示種子活力比較全面的一項指標，它是種子發(fā)芽能力和幼苗長勢的綜合表示，數(shù)值高，種子活力大。如圖4所示，當NaHS濃度高于0.3 mmol/L時，種苗生長量顯著高于砷處理組，當NaHS濃度高于0.9 mmol/L時，種子活力指數(shù)顯著高于砷處理組。而1.5 mmol/L硫氫化鈉浸種后種苗生長量與種子活力指數(shù)呈下降趨勢，說明硫氫化鈉緩解砷脅迫抑制種子萌發(fā)和幼苗生長具有劑量依賴性，但此種緩解作用可能存在一個濃度限值。

圖4 硫化氫對砷脅迫下種苗生長量以及種子活力指數(shù)的影響注：砷處理濃度為38 mmol/L，硫氫化鈉濃度為0 mmol/L，0.3 mmol/L，0.9 mmol/L，1.5 mmol/L，不同小寫字母表示處理之間具有顯著性差異(P<0.05)。

3 討 論

種子作為植物的繁殖體，承載著植物所有的遺傳信息，種子的萌發(fā)與否決定著植株的生命及群落的形成和演替。因此，深入研究桑樹種子萌發(fā)的抗逆性遺傳調(diào)控機理并進行高抗種質(zhì)資源的鑒定，能夠為桑樹種質(zhì)的遺傳改良和抗逆品種選育奠定理論基礎(chǔ)。

硫化氫(H2S)是繼一氧化氮和一氧化碳后發(fā)現(xiàn)的第3個氣體信號分子。外源硫化氫可促進植物種子萌發(fā)、根的形態(tài)建成、延遲衰老以及增強植物抗逆性[14-15]。外源硫化氫的作用濃度因物種、器官以及生長時期而異，其作用方式表現(xiàn)為低濃度促進，高濃度毒害[16-17]。以不同濃度的硫氫化鈉處理大豆種子，與對照相比，當硫氫化鈉濃度在0～250 mmol/L時，對種子萌發(fā)沒有顯著影響；300 mmol/L硫氫化鈉處理能夠使大豆種子發(fā)芽率從40% 提高到65%；當硫氫化鈉濃度在400～700 mmol/L時，種子發(fā)芽率開始降低[18]。本研究結(jié)果表明，以種子發(fā)芽抑制率為50%的鎘濃度來脅迫桑樹種子，隨著硫氫化鈉的濃度升高，其對脅迫的緩解作用增強，1.5 mmol/L硫氫化鈉浸種后對發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、種苗生長量以及種子活力指數(shù)的提高與0.3 mmol/L硫氫化鈉浸種具有顯著性差異；而以種子發(fā)芽抑制率為50%的砷濃度來脅迫桑樹種子發(fā)現(xiàn)，隨著硫氫化鈉濃度升高，發(fā)芽率與發(fā)芽指數(shù)無顯著提高，發(fā)芽勢顯著提高；而種苗生長量和種子活力指數(shù)在1.5mmol/L 硫氫化鈉處理組表現(xiàn)出下降趨勢，體現(xiàn)出低濃度促進，高濃度抑制現(xiàn)象。硫化氫能夠緩解多種非生物脅迫處理對植物種子萌發(fā)的抑制作用，植物所適應(yīng)的外源硫化氫的量隨物種不同而有差異。培養(yǎng)液中加入0.75 mmol/L H2S可顯著促進干旱脅迫下水稻種子萌發(fā)，一定程度上緩解PEG對水稻種子萌發(fā)的抑制作用[19]。0.3 mmol/L外源硫化氫處理顯著提高了水分脅迫條件下玉米種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、根長、株高、根系和地上部分鮮重，顯著降低了相對傷害率[20]。硫氫化鈉浸種處理緩解了重金屬鎘對小麥種子萌發(fā)的脅迫作用，顯著增長小麥胚芽，但對小麥種子根的生長無顯著影響[21]。本研究結(jié)果證實硫化氫能夠顯著緩解鎘、砷脅迫對桑樹種子萌發(fā)的抑制，但對于解除鎘、砷脅迫對萌發(fā)后幼苗生長的抑制作用并不顯著，而已有研究表明，硫氫化鈉噴施葉片或者浸泡根部處理均能緩解重金屬脅迫對幼苗生長的抑制作用，因此，硫化氫在何種濃度、何種作用方式下能夠緩解鎘、砷脅迫對桑樹種子萌發(fā)后幼苗生長的抑制作用，硫氫化鈉浸種對桑樹重金屬脅迫傷害的緩解能否用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實踐還需新的研究來證實。