楊雷 葉洲杰 李兆龍 沈陽(yáng)坤 傅雅娟

（1. 福建師范大學(xué)南方生物醫(yī)學(xué)研究中心，福州 350117；2. 福建省兒童醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，福州 350005；3. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)

研究所，福州 350013）

DNA 甲基化修飾是基因表達(dá)調(diào)控的主要表觀遺傳 機(jī) 制之 一［1］，TET2是TET 家 族（TET1、TET2、TET3）的一員，TET 蛋白利用α-KG、Fe2+及O2將DNA 中5mC 氧化為5hmC，并繼續(xù)通過(guò)TET 蛋白酶催化5hmC 氧化化為5fc 和5caC，5mC 氧化衍生物，5caC 可由脫羧基或者堿基切除完成去甲基化［2-5］。越來(lái)越多的研究表明，TET2是血細(xì)胞形成的主要調(diào)控因子，與血液瘤密切相關(guān)。TET2突變和缺失發(fā)生在急性髓細(xì)胞白血?。ˋML）、慢性粒單核細(xì)胞白血病（CMML）、骨髓增生障礙綜合征（MDS）和骨髓增生性腫瘤（MPN）中［6-7］，TET2的突變導(dǎo)致Tet2蛋白功能缺失，至使5hmC 含量降低，無(wú)法抑制甲基化DNA 與相關(guān)蛋白結(jié)合產(chǎn)生沉默作用，導(dǎo)致骨髓造血干細(xì)胞加快增殖［8］。近期研究發(fā)現(xiàn)，TET2的缺失可改變細(xì)胞的表觀遺傳環(huán)境，改變了細(xì)胞的分化狀態(tài)和增殖能力，導(dǎo)致早期干細(xì)胞獲得克隆性生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，促進(jìn)了人類記憶CAR-T 細(xì)胞的發(fā)育，提高CAR-T 細(xì)胞的療效和持久性，使其能夠引發(fā)有效的抗腫瘤反應(yīng)［9-11］。

CRISPR/Cas 系統(tǒng)是細(xì)菌和古細(xì)菌體內(nèi)的獲得性免疫系統(tǒng)，被用來(lái)對(duì)抗侵略細(xì)菌的外源DNA，質(zhì)粒和噬菌體。Cas9 蛋白是一種DNA 內(nèi)切酶，擁有兩個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu)域，因此可以同時(shí)對(duì)雙鏈DNA 進(jìn)行切割。其具體過(guò)程是Cas9 先和crRNA、tracrRNA 結(jié)合形成復(fù)合體，然后在PAM 序列的引導(dǎo)下侵入外源DNA，進(jìn)而形成RNA-DNA 中間結(jié)構(gòu)，再對(duì)靶DNA進(jìn)行切割，使其雙鏈斷裂。此時(shí)機(jī)體通過(guò)同源末端修復(fù)或非同源末端修復(fù)來(lái)填補(bǔ)斷裂的缺口［12-14］。

目前，由于T 細(xì)胞用化學(xué)試劑轉(zhuǎn)染效率低，CAR-T 技術(shù)采用重組慢病毒載體對(duì)T 細(xì)胞進(jìn)行基因編輯，然而重組病毒隨機(jī)整合基因組有著不可預(yù)估的風(fēng)險(xiǎn)［15-17］。細(xì)胞電轉(zhuǎn)染（Electroporation），是把外源大分子物質(zhì)DNA、RNA、siRNA、蛋白質(zhì)等以及一些小分子導(dǎo)入細(xì)胞膜內(nèi)部的重要方法，電轉(zhuǎn)過(guò)程對(duì)細(xì)胞毒性很小。使用體外表達(dá)的Cas9 蛋白與轉(zhuǎn)錄的TET2gRNA 孵育形Cas9/gRNA 核糖核蛋白復(fù)合物通過(guò)電轉(zhuǎn)染的方式導(dǎo)入T 細(xì)胞內(nèi)，能快速高效的對(duì)目的基因進(jìn)行編輯，避免了隨機(jī)整合的問(wèn)題，且敲除效率高，Cas9 蛋白半衰期短，因此也能大限度的減少脫靶和鑲嵌現(xiàn)象［18-20］。

本工作以人T 細(xì)胞為對(duì)象，優(yōu)化T 細(xì)胞電轉(zhuǎn)條件，利用電轉(zhuǎn)Cas9 RNP 對(duì)TET2基因高效敲除，并探究了該基因?qū) 細(xì)胞增殖的影響，旨在為CAR-T細(xì)胞治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

人新鮮外周血來(lái)自實(shí)驗(yàn)室同學(xué)捐獻(xiàn)。X-VIVO15（LONZA）、Ficoll（GE Healthcare）、IL-2、CD3、CD28 均來(lái)自北京同立海源生物科技有限公司。

大 腸 桿 菌E.coliBL21 和DH5α 感 受 態(tài) 購(gòu) 自于北京全式金生物科技有限公司，pSpCas9-2Apuro（pX459）V2.0 和pET28a+ 來(lái) 源 于Addgenes，pET28a-Cas9-NLS-6xHis 質(zhì)粒由上述兩質(zhì)粒構(gòu)建而成（圖1-A）。TET2基因敲除sgRNA 序列相對(duì)應(yīng)的寡核苷酸由擎科生物科技有限公司合成，Agarose 瓊脂糖、異丙基硫代半乳糖苷Isopropyl β-D-Thiogalactoside（IPTG）、蛋白酶抑制劑Phenylmethanesulfonyl fluoride（PMSF）、咪唑均購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；質(zhì)粒小提試劑盒、基因組提取試劑盒、片段純化試劑盒均購(gòu)自TaKaRa 公司；T7 體外轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自唯尚立德生物科技有限公司；T7EⅠ酶切試劑盒購(gòu)自NEB 公司；Ni-NTA 親和樹(shù)脂購(gòu)自德國(guó) QIAGEN 公司；BamH Ⅰ限制性內(nèi)切酶購(gòu)自Thermo Fisher 公司

1.2 方法

1.2.1 Cas9 蛋白表達(dá)與純化 以pSpCas9-2A-puro（pX459）V2.0 為模板通過(guò)體外PCR 擴(kuò)增方式獲得Cas9 蛋白CDS 區(qū)，所設(shè)計(jì)的上游引物為5′-CAGCA AATGGGTCGCGGATCCGACAAGAAGTACAGCATCG GC-3′；所設(shè)計(jì)的下游引物為5′-ACGGAGCTCGAATT CGGATCCCTTTTTCTTTTTTGCCTGGC-3′。產(chǎn)物使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)條帶大小是否正確以及單一，純化回收PCR 產(chǎn)物-20℃保存?zhèn)溆?。Fast DigestBamHI Enzyme（Thermo Fisher）對(duì)大腸桿菌蛋白表達(dá)載體pET28a+進(jìn)行酶切純化。不依賴于連接反應(yīng)的高效克隆方法（Ligation-independent cloning，LIC）將Cas9 蛋白CDS 區(qū)與酶切后的pET28a+載體通過(guò)同源重組的方式進(jìn)行構(gòu)建連接。將重組載體轉(zhuǎn)化進(jìn)行一代測(cè)序，BioEdit 軟件分析重組載體是否成功構(gòu)建以及是否基因突變，成功構(gòu)建pET28a-Cas9-NLS-6xHis 后-20℃保存待用。

在大腸桿菌蛋白表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行Cas9 蛋白表達(dá)純化，選擇Rosetta（DE3）大腸桿菌作為表達(dá)菌株。首先將pET28a-Cas9-NLS-6xHis 載體轉(zhuǎn)化至Rosetta（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化后涂板挑取單克隆加入無(wú)抗性LB 培養(yǎng)基37℃震蕩培養(yǎng)。取部分菌液測(cè)序驗(yàn)證轉(zhuǎn)化是否成功，繼續(xù)活化擴(kuò)培菌液，將種子液按照1∶100 的比例加入至含卡那霉素抗性的LB 培養(yǎng)基中37℃震蕩培養(yǎng)，當(dāng)大腸桿菌長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期既OD600為0.6-1.0 時(shí)將培養(yǎng)溫度調(diào)為18℃，加入1 mmol/L IPTG 進(jìn)行Cas9 蛋白誘導(dǎo)表達(dá)12 h。誘導(dǎo)完畢后離心收集菌泥，以裂解液重懸菌泥進(jìn)行超聲破碎菌體，離心收取菌液上清。Ni 填料能與HIS 標(biāo)記蛋白螯和在一起，使用Ni 填料能夠?qū)as9 蛋白從蛋白上清液中分離出來(lái)。Ni 填料與蛋白上清液4℃搖床孵育2 h 后，用分別含20、50 mmol/L 咪唑的清洗液洗去鎳填料中攜帶的雜蛋白，含300 mmol/L 咪唑的洗脫液洗脫鎳填料結(jié)合的Cas9 目的蛋白，收集洗脫樣品進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳考馬斯亮藍(lán)染色和His 抗體蛋白印記檢測(cè)Cas9 蛋白純度。以不含咪唑的洗脫液為置換液使用蛋白超濾濃縮管置換出洗脫液中的咪唑，測(cè)定蛋白濃度保存至-80℃待用。

1.2.2 sgRNA 體外轉(zhuǎn)錄 設(shè)計(jì)人類TET2基因CRISPR/Cas9 基 因 敲 除sgRNA 序 列（ 表1）， 以pSpCas9-2A-puro（pX459）V2.0 為 敲 除 載 體 構(gòu) 建pX459-h-TET2 重組載體，測(cè)序驗(yàn)證載體是否構(gòu)建成功。設(shè)計(jì)T7-gRNA 引物以pX459-h-TET2 模板進(jìn)行體外擴(kuò)增，得到1 個(gè)由crRNAs 和tracrRNAs 共同組成gRNA 長(zhǎng)約110 bp 的片段。將獲得的PCR 產(chǎn)物純化回收，取1 μg 產(chǎn)物用T7 體外轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄，完成后加入DNase I 37℃反應(yīng)40 min，純化回收后測(cè)RNA 濃度，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，-80℃保存待用。

表1 用于TET2 gRNA 體外轉(zhuǎn)錄引物

1.2.3 sgRNA 及Cas9 蛋白活性驗(yàn)證 將表達(dá)純化的Cas9 蛋白取5 μg，sgRNA 0.5 μg，TET2片段模板1 μg（HEK-293 細(xì)胞基因組PCR 獲得，所設(shè)計(jì)的上游引物為5′- AGTAGATCAGGAGGAGGCACA-3′；下游引物 為5′- ATTCTGGCTTCCCTTCATACA-3′），在Fast digest buffer 中37℃反應(yīng)1 h，酚氯仿異戊醇純化回收，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)Cas9 蛋白切割效率開(kāi)。

1.2.4 PBMC 細(xì)胞中分離T 細(xì)胞培養(yǎng) 使用Ficoll-Paque 在人新鮮全血中分離獲得外周血單核細(xì)胞（PBMC），X-VIVO15（LONZA）培養(yǎng)基對(duì)分離后的PBMC 進(jìn)行培養(yǎng)。Human T cell Isolation Kit 試劑盒（Miltenyi）分離純化PBMC 細(xì)胞中的T 細(xì)胞，分離得到的T 細(xì)胞在體外使用X-VIVO 15 培養(yǎng)基培養(yǎng)。人類T 細(xì)胞進(jìn)行電轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)基中需加入抗人CD3單克隆抗體與抗人CD28 當(dāng)克隆抗體200 ng/mL、白細(xì)胞介素2（IL2）40 ng/mL 刺激T 細(xì)胞活化生長(zhǎng)，電轉(zhuǎn)染48 h 后培養(yǎng)基中只需加入IL2 刺激生長(zhǎng)即可。

1.2.5 T 細(xì)胞電轉(zhuǎn)Cas9-TET2gRNA 核糖核蛋白 按照3∶1 的比例將Cas9 蛋白與TET2gRNA 進(jìn)行體外孵育形成Cas9-gRNA 核糖核蛋白復(fù)合物（RNP），將3×106T 細(xì)胞使用20 μL 電轉(zhuǎn)緩沖液重懸，加入Cas9-TET2 gRNA 復(fù)合物（Cas9 3 μg，TET2gRNA 1 μg）進(jìn)行電轉(zhuǎn)染，電轉(zhuǎn)條件為850 V、20 ms，以電轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白GFP 作為陽(yáng)性對(duì)照，電轉(zhuǎn)后加入X-VIVO15（LOZA）培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.6TET2基因敲除驗(yàn)證 T 細(xì)胞電轉(zhuǎn)染48 h 后，提取細(xì)胞基因組，在sgRNA 對(duì)應(yīng)基因組位置設(shè)計(jì)驗(yàn)證引物進(jìn)行體外片段擴(kuò)增，將目的片段進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證是否造成基因突變，并且使用T7EⅠ核酸內(nèi)切酶進(jìn)行敲除效率驗(yàn)證。

1.2.7TET2基因缺失對(duì)T 細(xì)胞增殖的影響 在T 細(xì)胞中對(duì)TET2基因敲除之后，驗(yàn)證TET2的缺失是否會(huì)對(duì)T 細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖產(chǎn)生影響。使用臺(tái)盼藍(lán)細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)T 細(xì)胞存活率以及細(xì)胞數(shù)量。通過(guò)流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)CD4、CD8 陽(yáng)性T 細(xì)胞的比例。

2 結(jié)果

2.1 Cas9蛋白表達(dá)

通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)在Rosetta（DE3）大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)Cas9 蛋白，成功的獲得帶有核定位信號(hào)的重組Cas9 蛋白，其分子量大小為160 kD。Ni 填料與His 標(biāo)簽特異性親和層析純化，50 mmol/L 咪唑的洗液能夠去除Ni 填料上雜蛋白，含300 mmol/L咪唑洗脫液將Cas9 蛋白從Ni 填料上洗脫下來(lái)。純化后的蛋白通過(guò)考馬斯亮藍(lán)染色與蛋白印記孵育His標(biāo)簽抗體檢測(cè)表達(dá)純化后的蛋白條帶單一無(wú)雜帶，得到純度較高的Cas9 蛋白（圖1）。

2.2 Cas9蛋白活性及TET2 gRNA靶點(diǎn)切割效率鑒定

表達(dá)純化的Cas9 蛋白以陽(yáng)性gRNA 與基因片段為模版進(jìn)行體外酶切實(shí)驗(yàn)，表達(dá)純化的Cas9 蛋白能夠?qū)⒒蚱卧趕gRNA 位置處對(duì)目的基因片段進(jìn)行切割，瓊脂糖凝膠電泳觀察目的基因片段被切割成兩條小片段，大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)Cas9 蛋白具有酶切活性。表達(dá)的Cas9 蛋白與TET2gRNA 形成核糖核蛋白復(fù)合物后能夠可以高效的切割TET2基因片段（746 bp），Cas9 蛋白酶切后產(chǎn)生大小為490 bp 和256 bp 的片段（圖2），設(shè)計(jì)的TET2gRNA 在體外能夠識(shí)別靶標(biāo)基因并引導(dǎo)Cas9 蛋白對(duì)靶標(biāo)序列進(jìn)行切割。

2.3 T細(xì)胞電轉(zhuǎn)染效率及TET2基因敲除效率檢測(cè)

將Cas9TET2gRNA 核糖核蛋白復(fù)合物通過(guò)電轉(zhuǎn)染的方式導(dǎo)入T 細(xì)胞中，綠色熒光蛋白GFP 作為陽(yáng)性對(duì)照。通過(guò)流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示44.1%的T 細(xì)胞通過(guò)電轉(zhuǎn)染導(dǎo)入綠色熒光蛋白細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，使用Lipofectamine2000 轉(zhuǎn)染效率較低，只有1%的T 細(xì)胞通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染發(fā)光，常規(guī)化學(xué)轉(zhuǎn)染方式不能有效的將外源蛋白和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入T 細(xì)胞內(nèi)，電轉(zhuǎn)染的方式能夠高效率的將外源蛋白或質(zhì)粒帶入T 細(xì)胞內(nèi)（圖3）。T7 核酸內(nèi)切酶（T7EⅠ）能夠識(shí)別不完全配對(duì)的雙鏈DNA，T7EⅠ能夠在非配對(duì)處對(duì)DNA 鏈進(jìn)行切割。通過(guò)T7EⅠ酶切能夠檢測(cè)基因敲除效果，T7EⅠ能夠在TET2基因靶位點(diǎn)處將基因片段切割成兩條片段，表明在sgRNA 對(duì)應(yīng)的基因組位置堿基序列發(fā)生了基因突變。將TET2基因組上sgRNA 序列特異性體外擴(kuò)增測(cè)序發(fā)現(xiàn)，在sgRNA位置后TET2基因發(fā)生移碼突變，表明T 細(xì)胞中的TET2基因被成功敲除（圖4）。

2.4 TET2敲除對(duì)T細(xì)胞增殖的影響

PBMC 中分離純化的T 細(xì)胞在電轉(zhuǎn)染2 d 內(nèi)，細(xì)胞由于電穿孔損傷會(huì)使部分細(xì)胞死亡，活細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)顯示死亡率為42.1%，在培養(yǎng)基中加入IL-2、CD28 等細(xì)胞因子的刺激下T 細(xì)胞培養(yǎng)2 d 后開(kāi)始增殖。之前研究表明T 細(xì)胞在體外生長(zhǎng)一段時(shí)間，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)T 細(xì)胞會(huì)逐漸死亡。在T 細(xì)胞中敲除去甲基化酶TET2后，T 細(xì)胞的生存時(shí)間及增殖速率發(fā)生變化。野生型T 細(xì)胞在體外培養(yǎng)至20 d 左右時(shí)細(xì)胞活率逐漸下降細(xì)胞數(shù)減少且狀態(tài)變差。T 細(xì)胞缺失TET2基因后細(xì)胞在體外培養(yǎng)20 d 依然表現(xiàn)出良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，細(xì)胞活率與數(shù)量明顯高于野生型細(xì)胞。臺(tái)盼藍(lán)作為一種細(xì)胞染料能夠特異性的將死細(xì)胞染成藍(lán)色，通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)的方式能夠檢測(cè)細(xì)胞增殖數(shù)量。在T 細(xì)胞中敲除TET2基因后，敲除型T 細(xì)胞比野生型T 細(xì)胞細(xì)胞數(shù)量增殖顯著加快（圖5）。CCK 能夠與活細(xì)胞線粒體內(nèi)的脫氫酶形成還原性可溶物甲臜，甲臜的檢測(cè)數(shù)與活細(xì)胞細(xì)胞數(shù)成正比，從而間接檢測(cè)出隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)胞增殖情況（圖6）。CCK 結(jié)果顯示當(dāng)T 細(xì)胞缺失TET2后細(xì)胞的增殖速率以及體外培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)于野生型T 細(xì)胞，野生型T 細(xì)胞體外培養(yǎng)活力逐漸降低的同時(shí)缺失TET2的T 細(xì)胞還保持著良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在T 細(xì)胞中缺失TET2基因后能夠延長(zhǎng)T 細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)間，同時(shí)在電轉(zhuǎn)16 d 后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T 細(xì)胞表面CD4 和CD8 分子，結(jié)果（圖7）顯示野生型與敲除型無(wú)明顯差異，表明TET2的敲除使T 細(xì)胞的功能并未受到影響。但是TET2基因是如何調(diào)節(jié)T 細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)間的還并未詳知，也許TET2作為去甲基化酶調(diào)節(jié)細(xì)胞周期活動(dòng)具有相關(guān)性。

圖1 Cas9 蛋白表達(dá)與純化

3 討論

T 淋巴細(xì)胞作為人體細(xì)胞免疫的重要成分，T細(xì)胞在淋巴細(xì)胞中數(shù)量最多，其由胸腺內(nèi)的淋巴干細(xì)胞分化而成，為功能最復(fù)雜的一類細(xì)胞。T 細(xì)胞行使正常功能對(duì)人類抵御疾病非常重要，2012 年美國(guó)科學(xué)家以HIV 病毒為載體將T 細(xì)胞進(jìn)行改造使其可以殺傷人體內(nèi)白血病細(xì)胞。CAR-T 免疫細(xì)胞治療主要以慢病毒載體對(duì)T 細(xì)胞進(jìn)行基因改造，由于常規(guī)的化學(xué)轉(zhuǎn)染試劑對(duì)于T 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率較低，在T 細(xì)胞中基因編輯的研究相對(duì)較少且具有一定難度，且還未有在T 細(xì)胞基因組原位插入嵌合抗原受體（CAR）的CAR-T 細(xì)胞出現(xiàn)。CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)發(fā)現(xiàn)與古細(xì)菌天然免疫防疫機(jī)制，是繼鋅指核酸酶（Zinc finger nuclease，ZFN）與類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases，TALEN）之后的流行性較廣使用方便的基因編輯技術(shù)。CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)以sgRNA 作為向?qū)?duì)靶基因進(jìn)行特異性的指向，然后在Cas9 蛋白作用下將DNA 雙鏈切割導(dǎo)致斷裂，然后在非同源末端修復(fù)時(shí)產(chǎn)生堿基的插入或者缺失形成錯(cuò)配而將目的基因敲除，造成基因功能的缺失。

通過(guò)向宿主細(xì)胞輸運(yùn)CRISPR Cas9/gRNA 核糖核蛋白復(fù)合物（Cas9 ribonucleoprotein complexes，Cas9 RNP）是進(jìn)行各種基因編輯、基因表達(dá)調(diào)控、是進(jìn)行基因編輯的重要方法。由于快速高效、脫靶率低、不需要優(yōu)化密碼子和啟動(dòng)子等，該方法易應(yīng)用于進(jìn)一步的基因治療和臨床研究中。電轉(zhuǎn)染（Electroporation）是一種簡(jiǎn)單高效的蛋白轉(zhuǎn)染方式。應(yīng)用該技術(shù)，不僅能將Cas9 RNP 直接導(dǎo)入細(xì)胞質(zhì)，而且能夠使其穿過(guò)核膜進(jìn)入細(xì)胞核，從而快速高效地目標(biāo)基因進(jìn)行編輯。因此，在基于電轉(zhuǎn)技術(shù)的Cas9 RNP 基因編輯研究中，通過(guò)電轉(zhuǎn)染對(duì)該復(fù)合物基因編輯效率的影響具有十分重要的意義。

圖2 Cas9 和gRNA 體外酶切活性鑒定

圖3 電轉(zhuǎn)染GFP 蛋白效率檢測(cè)

本研究構(gòu)建了攜帶有核定位信號(hào)的Cas9 蛋白表達(dá)載體，在大腸桿菌蛋白表達(dá)系統(tǒng)中誘導(dǎo)Cas9蛋白表達(dá)。由于大腸桿菌蛋白表達(dá)系統(tǒng)均有操作方便快捷、時(shí)間周期短、獲得蛋白量大等特點(diǎn)，能夠在短時(shí)間內(nèi)獲得大量的Cas9 蛋白。人為在Cas9 蛋白C 端融合表達(dá)了6 個(gè)組氨酸，His 標(biāo)簽?zāi)軌蛱禺愋缘呐cNi 填料結(jié)合，含不同濃度梯度咪唑的洗脫液將雜蛋白和目的蛋白洗脫下來(lái)，從而特異性的分離純化Cas9 蛋白?？捡R斯亮藍(lán)染色與anti-His 蛋白印記結(jié)果顯示得到純度較高且條帶單一的目的Cas9蛋白。在pX459 敲除載體上構(gòu)建pX459-H-TET2 重組敲除載體，體外擴(kuò)增的方式獲得靶標(biāo)目的基因的tracrRNA/crRNA DNA 片段，在T7 轉(zhuǎn)錄酶的作用下將片段轉(zhuǎn)錄為RNA。通過(guò)體外酶切實(shí)驗(yàn)，誘導(dǎo)表達(dá)的Cas9 蛋白能夠在以TET2sgRNA 序列指引下對(duì)靶標(biāo)基因片段特異性的切割，驗(yàn)證了Cas9 蛋白以及TET2gRNA 的有效性，這也有助于體外基因診斷試劑的開(kāi)發(fā)。

圖4 T 細(xì)胞TET2 基因敲除驗(yàn)證

圖5 臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖

圖6 CCK-8 細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)細(xì)胞活力

之前的研究表明TET2缺失對(duì)造血系統(tǒng)發(fā)育有影響，TET2缺失的小鼠表型出現(xiàn)骨髓增生，包括脾腫大、單核細(xì)胞增多和髓外造血，造血干細(xì)胞增多，干細(xì)胞自我更新加快和髓外造血功能增強(qiáng)，這提示TET2功能不全可能有助于體內(nèi)造血轉(zhuǎn)化［21］。在TET2缺失小鼠模型上對(duì)T 細(xì)胞的研究表明TET2促能進(jìn)CD4+Th 細(xì)胞分化［21］。TET2與TET3能協(xié)同穩(wěn)定調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞中Foxp3 的表達(dá)，且在急性病毒感染期間，體內(nèi)缺乏TET2的CD8+T 細(xì)胞中細(xì)胞因子的產(chǎn)生和效應(yīng)分子的表達(dá)增加。缺乏TET2的記憶細(xì)胞具有完整的擴(kuò)張和效應(yīng)反應(yīng)，并具有更強(qiáng)的病原體清除能力［22-23］。2018 年5 月，Carl H.June 團(tuán)隊(duì)［24］報(bào)道了一名慢性淋巴細(xì)胞白血?。–LL）患者在2013 年接受CAR-T 治療，第一次接受CAR-T 治療發(fā)生了細(xì)胞因子風(fēng)暴（CRS），給予IL-6 阻斷劑后得到緩解。隨后又接受第二次CART 治療，第二年骨髓內(nèi)慢性淋巴細(xì)胞白血?。–LL）為陰性。第三年骨髓中仍可檢出CAR-T 細(xì)胞，到第五年CLL 并未復(fù)發(fā)。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)患者的TET2基因有一個(gè)拷貝發(fā)生突變并將Anti-CD19 CAR 序列插入到TET2基因上。正常情形下，TET2基因調(diào)節(jié)血細(xì)胞的形成，并限制這些細(xì)胞的生長(zhǎng)。一旦TET2基因被破壞，單個(gè)CAR-T 細(xì)胞大量增殖并消滅這名患者所患的白血病細(xì)胞。因此，CAR-T 細(xì)胞中TET2缺失足以在晚期白血病中介導(dǎo)強(qiáng)大的抗腫瘤作用。目前對(duì)于T 淋巴細(xì)胞基因編輯主要還是以慢病毒載體與“睡美人”轉(zhuǎn)座子載體為主，上述載體的作用原理均是通過(guò)不同作用方式隨機(jī)整合在細(xì)胞基因組內(nèi)，可能會(huì)造成宿主基因突變導(dǎo)致腫瘤的形成，或者是整合致死等風(fēng)險(xiǎn)。CRISPR/Cas9 技術(shù)在靶標(biāo)基因位點(diǎn)進(jìn)行基因編輯能夠有效避免慢病毒載體造成的不利影響。然而常規(guī)的化學(xué)轉(zhuǎn)染試劑對(duì)于T 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率很低，采用電轉(zhuǎn)染的方式將外源DNA 或者蛋白質(zhì)導(dǎo)入到T 淋巴細(xì)胞內(nèi)是主要的研究方法。由于RNP 具有較高的基因編輯效率，在體外將Cas9 蛋白與TET2gRNA 形成Cas9 RNP 復(fù)合物電轉(zhuǎn)染進(jìn)入T 淋巴細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)T7EⅠ體外酶切與靶基因組測(cè)序結(jié)果顯示，將Cas9 蛋白與TET2gRNA 電轉(zhuǎn)進(jìn)入T 細(xì)胞內(nèi)能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)宿主細(xì)胞TET2基因高效率的敲除，T 淋巴細(xì)胞在缺失TET2基因后，T 細(xì)胞能夠表現(xiàn)出無(wú)限增殖的能力，細(xì)胞數(shù)量隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增多。這些結(jié)果與上述TET2基因的功能相一致，有可能加強(qiáng)CAR-T 的免疫治療效果。

圖7 電轉(zhuǎn)第16 dCD4+、CD8+T 細(xì)胞比例分布情況

4 結(jié)論

本研究中使用核糖核蛋白復(fù)合物通過(guò)電轉(zhuǎn)染方式在T 細(xì)胞中成功敲除TET2基因，T 細(xì)胞缺失正常TET2蛋白表達(dá)后，細(xì)胞增殖速率加快且在體外培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)。