王亞楠 文海若 王雪

（中國(guó)食品藥品檢定研究院 國(guó)家藥物安全評(píng)價(jià)監(jiān)測(cè)中心 藥物非臨床安全性評(píng)價(jià)研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100176）

基因突變通常指基因在堿基對(duì)上發(fā)生的組成或排列順序的改變，主要的突變類型分為堿基置換突變（點(diǎn)突變），移碼突變，缺失突變，插入突變等。外顯子編碼基因發(fā)生突變后通過轉(zhuǎn)錄、翻譯使多肽（鏈）中氨基酸組成或順序發(fā)生改變，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)或酶的生物功能，使機(jī)體的表型出現(xiàn)異常。堿基突變是癌癥發(fā)生與發(fā)展的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，也是遺傳毒性評(píng)價(jià)的重要的檢測(cè)終點(diǎn)之一。Pig-a基因編碼形成糖磷脂酰肌醇（GPI）錨定生物合成所需的N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶的催化亞基，在不同種屬之間具有結(jié)構(gòu)、功能的高度保守性［1］。Pig-a基因位于X染色體，其片段中單一突變即可影響GPI 錨的合成并導(dǎo)致細(xì)胞表面GPI 錨鏈蛋白的缺失，從而可通過檢測(cè)細(xì)胞膜表面錨鏈蛋白表達(dá)水平評(píng)價(jià)受試物的潛在遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)。Araten 等［2］最初于1999 年建立以Pig-a基因?yàn)閳?bào)告基因的體內(nèi)基因突變?cè)囼?yàn)方法?；诹魇郊?xì)胞術(shù)測(cè)定GPI 錨鏈蛋白缺失的體內(nèi)Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)近年來得到迅速的發(fā)展，可使用小鼠、大鼠、非人靈長(zhǎng)類、人類的造血細(xì)胞檢測(cè)受試物的體內(nèi)致突變性，且基于大鼠的檢測(cè)方法已通過聯(lián)合驗(yàn)證證明其重復(fù)性及可轉(zhuǎn)移性［3-6］。

基于Pig-a基因在不同種屬之間高度的結(jié)構(gòu)、功能保守性，以人類B 淋巴細(xì)胞樣細(xì)胞系TK6、MCL-5 以及L5178Y 等哺乳動(dòng)物細(xì)胞系開展的體外Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)也獲得一些進(jìn)展。McKinzie 等［7］對(duì)L5178Y 進(jìn)行全基因組測(cè)序研究，參與GPI 錨鏈蛋白合成的基因測(cè)序研究結(jié)果顯示發(fā)現(xiàn)所有編碼基因均存在于L5178Y 中，且沒有任何一個(gè)基因表現(xiàn)出明顯的有害突變，在所有編碼GPI 錨鏈蛋白基因中只有Pig-a基因存在純和突變，其他基因均為雜合突變，預(yù)測(cè)L5178Y 細(xì)胞適用于體外Pig-a基因突變研究。Wang 等［8］首次報(bào)道采用L5178Y 細(xì)胞進(jìn)行體外Pig-a突變研究，隨后David 等［9］對(duì)該方法進(jìn)行了驗(yàn)證研究，采用不同作用機(jī)制的8 種化合物研究結(jié)果表明，體外Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)不但可以進(jìn)行基因突變突變誘導(dǎo)檢測(cè)，更重要的是可以區(qū)分不同作用機(jī)制遺傳毒性物質(zhì)，此外還證明了GPI 錨鏈蛋白CD90 的缺失不是通過環(huán)乙亞胺處理抑制蛋白合成。以TK6 細(xì)胞為試驗(yàn)體系的研究中，2015 年Kruger 等［10］建立了基于TK6 細(xì)胞的體外Pig-a基因突變檢測(cè)方法。在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，Kruger［11］又進(jìn)行了相關(guān)基因型與TK6 細(xì)胞表型的關(guān)系。國(guó)內(nèi)李若婉等［12］建立基于TK6 細(xì)胞的體外Pig-a基因突變方法。就上述各種報(bào)道研究采用不同的細(xì)胞系而言，全基因組測(cè)序證實(shí)L5178Y 細(xì)胞中不攜帶Pig-l基因突變［7，10-11］，故試驗(yàn)前期無需進(jìn)行自發(fā)突變清除，但TK6 細(xì)胞中Pig-l基因的缺失造成自發(fā)突變清除前TK6 細(xì)胞中觀察到的高水平Pig-a背景突變，在進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)之前需要預(yù)清除自發(fā)突變細(xì)胞。此外L5178Y 細(xì)胞還開展tk/hprt基因突變研究，對(duì)同一物質(zhì)可進(jìn)行不同基因水平致突變聯(lián)合研究。

本研究在國(guó)內(nèi)首次使用小鼠淋巴瘤（L5178Y）細(xì)胞建立和驗(yàn)證體外Pig-a基因突變實(shí)驗(yàn)，以期在體內(nèi)Pig-a試驗(yàn)之前進(jìn)行體外Pig-a基因突變遺傳毒性評(píng)價(jià)，提供可能的體外結(jié)果指示。本方法的建立對(duì)Ames 試驗(yàn)弱陽(yáng)性結(jié)果以及在藥物代謝產(chǎn)物、雜質(zhì)的遺傳毒性研究上具有很大的實(shí)用價(jià)值，為化合物體外遺傳毒性評(píng)價(jià)，藥物研發(fā)早期遺傳毒性篩選提供新選擇［13-14］。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與試劑 二甲基亞砜（DMSO）（批號(hào)：#BCBW5664），G-6-P（ 批 號(hào)：#WXBC7942V），NADP（批號(hào)：18E2156560），青鏈霉素混合液（批號(hào)：2019313），N-乙基-N-亞硝基脲（N-nitroso-Nethylure，ENU）（批號(hào)：MKCD2123），甲基磺酸乙酯（Ethylmethylsulfone，EMS）（批 號(hào)：126K0758），4- 硝 基 喹 啉-N- 氧 化 物（4-nitroquinoline N-oxide，4-NQO）（批號(hào)：89C-0710），苯并芘（BenzoaPyrene，B（a）P）（批號(hào)：SLBF45532）購(gòu)自Sigma。葡萄糖（glucose，Glc）（批號(hào)：20181019），氯化鈉（Sodium chloride，NaCl）（批號(hào)：20190121），多聚甲醛（批號(hào)：20141218），丙酮酸鈉（批號(hào)：20160612）購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。RPMI1640 培養(yǎng)基（批號(hào)：2025394）購(gòu)自Gibco。馬血清（批號(hào)：AC10235369），PBS（ 批 號(hào)：AD19942268） 購(gòu) 自Hyclone。APC-Anti-CD45（ 批 號(hào)：7166674），PEAnti-CD90.2（批號(hào)：7110569）購(gòu)自BD biosciences。Anti-PE MicroBeads（ 批 號(hào)：51810917330），LS Columns（批號(hào)：5180614049）購(gòu)自Miltenyi。肝勻漿S9（批號(hào)：20181105）購(gòu)自北京安保迪科技有限公司。山羊血清（批號(hào)：428E051）購(gòu)自索萊寶科技有限公司。Rat mAb to CD90（批號(hào)：GR3226793-2），RbPAb to CD4（GR3240865-1），山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor? 568）（ 批 號(hào)：GR3230171-3），山 羊 抗 大 鼠IgG H&L（Alexa Fluor? 488）（批 號(hào)：GR3240085-1），DAPI Staining Solution（ 批 號(hào)：GR3253253-2） 購(gòu) 自Abcam。TRNzol 總RNA 提 取試劑（批號(hào)：DP405-02）購(gòu)自天根生化科技（北京） 有 限 公 司。PrimeScriPtTMRT reagent Kit with gDNAEraser（ 批 號(hào)：RR047B），2xEs TaqMasterMix（批號(hào)：CW0718）購(gòu)自TaKaRa（寶生物）。引物由Invitrogen 合成。

1.1.2 細(xì)胞 小鼠淋巴瘤細(xì)胞L5178Ytk+/--3.7.2C，引自日本國(guó)立醫(yī)藥品食品衛(wèi)生研究所，支原體檢查后于液氮長(zhǎng)期保存，研究所用細(xì)胞為復(fù)蘇傳代后10代以內(nèi)。

1.1.3 儀器 流式細(xì)胞儀（FACSCalibur，BD bioscience），高速冷凍離心機(jī)（Centrifuge 5810R，Eppendorf），倒置熒光顯微鏡（IX71，Olympus），二氧化碳 培 養(yǎng) 箱（HERA cell VIOS 160i，Thermo Fisher），生物安全柜（NU-543-400S，Nuair），倒置顯微鏡（CKX31，Nikon），免疫磁性分離架（QuadroMACSTMSeparator，Miltenyi），分光光度計(jì)（NANODROP 2000，Thermo scientific），凝膠成像系統(tǒng)（Tanon 1600，上海天能科技有限公司），PCR 儀（ABI，Applied Biosystems）。

1.2 方法

將L5178Y 細(xì)胞解凍復(fù)蘇后置于完全培養(yǎng)基R10（含有10%馬血清，1%青鏈霉素混合液，0.2 mg/mL 丙酮酸鈉的 RPMI 1640）在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)基隔天更換，待細(xì)胞增殖至適宜密度后進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.1 細(xì)胞毒性 通過細(xì)胞相對(duì)倍增速率（Relative population doubling，RPD）進(jìn)行評(píng)價(jià)：

細(xì)胞倍增速率（Population doubling，PD）=［log（受試物處理后細(xì)胞量/初始細(xì)胞量）］/log 2；RPD=（受試物組PD/對(duì)照組PD）×100%。

1.2.2 連續(xù)（24 h）處理組 細(xì)胞達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，更換R0 培養(yǎng)基（含有1%青鏈霉素混合液，0.2 mg/mL 丙酮酸鈉RPMI 1640），并添加不同濃度的Glc（0、5.625、11.25、22.5、45 μg/mL），NaCl（0、1.8、3.75、7.5、15、30、60 μg/mL），EMS（0、10、100、200、300、400、500 μg/mL），ENU（0、25、50、75、100、125、250 μg/mL），調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個(gè)細(xì)胞/mL 于10 mL 培養(yǎng)基中，細(xì)胞于37℃，5%CO2條件下與受試物作用24 h。處理結(jié)束后收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)，細(xì)胞經(jīng)離心（1000 r/min，5 min，室溫），PBS 洗滌兩次，細(xì)胞重懸于10 mL 完全培養(yǎng)基R10，表達(dá)期細(xì)胞密度維持在1.0×106-2.0×106個(gè)細(xì)胞/mL。

1.2.3 短時(shí)（4 h）處理組 細(xì)胞達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，更換R0 培養(yǎng)基（含有1%青鏈霉素混合液，0.2 mg/mL 丙酮酸鈉的 RPMI 1640），并添加不同濃度的4-NQO（0、0.01、0.05、0.075、0.10、0.15、0.20 μg/mL），B（a）P（0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 μg/mL）和2% S9mix，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個(gè)細(xì)胞/mL 于50 mL 離心管中。37℃，20 r/min 振搖4 h。細(xì)胞經(jīng)離心（1000 r/min，5 min，室溫）后，PBS 洗滌兩次，重懸于10 mL 完全培養(yǎng)基R10。給藥后24 h 后作細(xì)胞計(jì)數(shù)，表達(dá)期細(xì)胞密度維持在1.0×106-2.0×106個(gè)細(xì)胞/mL。

1.2.4 流式門控模板調(diào)試 取2×106個(gè)細(xì)胞離心（1000 r/min，4℃，5 min），每孔加入200 μL APCanti-CD45 和PE-anti-CD90.2 混合工作液，終濃度為1 μg/mL，2-8℃避光孵育30 min，后置于室溫繼續(xù)孵育10 min，離心（340×g，4℃，3 min），收集細(xì)胞進(jìn)行流式檢測(cè)，初步確定適宜電壓及補(bǔ)償策略。

在EMS 給藥表達(dá)后第21 天收集5×108個(gè)細(xì)胞離心（1000 r/min，4℃，5 min），加入2.5 mLAPCAnti-CD45 和PE-Anti-CD90 抗體工作液，2-8℃避光孵育30 min，后置于室溫繼續(xù)孵育10 min，離心（300×g，4℃，5min），加入120 μL anti-PE 磁珠于500 μL 工作液（2% FBS+PBS）混勻，置于2-8℃，避光孵育15 min，離心（340×g，5 min，4℃），加入5 mL 工作液（2% FBS+PBS）混懸均勻。提前準(zhǔn)備工作液（2% FBS+PBS）潤(rùn)洗LS 柱子，過柱分離，收集流出組分，離心（340×g，5 min，4℃），收集細(xì)胞進(jìn)行流式檢測(cè)，用于確定流式檢測(cè)模板。

1.2.5Pig-a基因突變檢測(cè)周期的確定 L5178Y 細(xì)胞分別經(jīng)不同濃度EMS 處理后，于給藥后第4、8、12、16、20 天檢測(cè)Pig-a基因突變頻率，以確定最大突變頻率發(fā)生時(shí)間點(diǎn)。

1.2.6 免疫熒光成像分析 取野生型細(xì)胞和突變型細(xì)胞混合，置于4%多聚甲醛室溫固定20 min，5%山羊血清37℃封閉30 min，一抗RbpAbCD45（1μg/mL）和Rat mAb to CD90（1 μg/mL）4℃孵育過夜， 二 抗Goat-anti-Rat（AlexaFluor 488） 和Goatanti-Rb（AlexaFluor 568）及DAPI 4℃避光孵育1 h，熒光顯微鏡成像分析。

1.2.7 突變位點(diǎn)檢測(cè) 富集ENU 致突變型細(xì)胞，進(jìn)行PCR方法檢測(cè)組織樣本中目的基因序列突變位點(diǎn)。從NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)確認(rèn)小鼠Pig-a基因序列，引物設(shè)計(jì)見表1。

表1 小鼠淋巴瘤L5178Y 細(xì)胞Pig-a 基因引物設(shè)計(jì)

采用TRIzol 總RNA 提取試劑進(jìn)行樣本RNA 提取，PrimeScriPtTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 進(jìn)行cDNA 反轉(zhuǎn)錄。

PCR 樣本檢測(cè)：將所有cDNA 樣品分別配置RealtimePCR 反應(yīng)體系。按以下程序進(jìn)行：95℃，3 min；30 個(gè)PCR 循 環(huán)（95℃，30 s，58℃，30 s，72℃，40 s）；72℃，5min。擴(kuò)增結(jié)束后取5 μL 產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，切膠回收目的片段，經(jīng)DNA 凝膠回收試劑盒純化后，用ABI PRISM TM377XL 測(cè)序儀以末端標(biāo)記雙脫氧法測(cè)序，Chromas軟件（TechnelysiumPly Ltd. Version 2.6.2）分析測(cè)序結(jié)果。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphpadPrism7（USA，Graphpad Software 公司）進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，采用One Way ANOVA 檢驗(yàn)將各受試物處理組的突變率與溶媒對(duì)照組作比較，組間比較P＜ 0.05 視為差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞毒性測(cè)定結(jié)果

不同受試物給藥24 h 或4 h 后的RPD 結(jié)果如圖1 所示。給藥24 h：非S9代謝活化條件下：Glc，NaCl，EMS，ENU，給藥4 h 組：S9代謝活化條件下B（a）P，4-NQO 所設(shè)濃度組RPD 均大于50%。提示本研究受試物在給藥濃度范圍內(nèi)均未見無明顯細(xì)胞毒性作用，排除試驗(yàn)中假陽(yáng)性結(jié)果。

2.2 流式門控調(diào)試

初步流式門控調(diào)試如圖2 所示。分別對(duì)細(xì)胞進(jìn)行空白對(duì)照、單染APC-anti-CD45、PE-anti-CD90.2和雙染進(jìn)行流式電壓、補(bǔ)償?shù)日{(diào)試至合適的圖譜，初步確定合適的流式門控策略，收集突變體細(xì)胞對(duì)突變域進(jìn)一步完善確認(rèn)。

收集突變表達(dá)21 d 后的EMS 細(xì)胞通過免疫磁性分離技術(shù)對(duì)突變型細(xì)胞進(jìn)行富集后進(jìn)行流式檢測(cè)（圖3-A），通過上述流式門控策略調(diào)試進(jìn)一步確定R2 區(qū)域?yàn)镚PI（-）區(qū)域，即CD45（+）/CD90.2（-）。

2.3 Pig-a基因突變檢測(cè)周期的確定

Pig-a基因突變頻率變化見圖4，呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，整體在第8 天左右呈現(xiàn)最大突變頻率，最終確定細(xì)胞在受試物作用時(shí)間結(jié)束后表達(dá)8 d 作為Pig-a基因突變頻率檢測(cè)時(shí)間終點(diǎn)。

圖1 不同受試物給藥24 h 或4 h 后的RPD（±s，n=3）

圖2 流式模板初步調(diào)試過程圖

2.4 不同受試物突變頻率

EMS、ENU、NaCl、Glc 作用24h，B（a）P、4-NQO 給藥4 h 表達(dá)8 dPig-a基因突變頻率檢測(cè)結(jié)果（圖5-6）顯示，非S9代謝活化條件下，EMS 濃度大于100 μg/mL 時(shí)，Pig-a基因突變率與溶媒對(duì)照組相比，存在顯著性差異（*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001），且呈濃度遞增趨勢(shì)；ENU 濃度大于125 μg/mL 時(shí)，Pig-a基因突變率與溶媒對(duì)照組相比，存在顯著性差異（**P＜0.01，***P＜0.001），且呈濃度遞增趨勢(shì)。

S9代謝活化條件下，當(dāng)B（a）P 濃度大于2.0 μg/mL 時(shí)，Pig-a基因突變率與溶媒對(duì)照組相比，存在顯著性差異（*P＜0.05，***P＜0.001），且成濃度遞增趨勢(shì)。當(dāng)4-NQO 濃度大于0.075 μg/mL 時(shí)Pig-a基因突變率與溶媒對(duì)照組相比，存在顯著性差異（*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001），且成濃度遞增趨勢(shì)。

非S9代 謝 活 化 條 件 下， 陰 性 對(duì) 照Glc、NaClPig-a基因突變率與溶媒對(duì)照組相比，不存在顯著性差異（P＞0.05），且無濃度梯度關(guān)系。

圖3 流式突變區(qū)域確認(rèn)與質(zhì)控圖

圖5 EMS、ENU 給藥24 h，B（a）P、4-NQO 給藥4 h 表達(dá)8d Pig-a 基因突變頻率

2.5 免疫熒光結(jié)果

采用免疫熒光方法染色識(shí)別細(xì)胞核（DAPI，藍(lán)色）、細(xì)胞表面CD45（AlexaFluor 568，橙色）和細(xì)胞表面CD90.2（AlexaFluor 488，綠色）后，可見細(xì)胞表面僅表達(dá)綠色熒光信號(hào)的突變細(xì)胞和同時(shí)表達(dá)紅色及綠色熒光信號(hào)的野生型細(xì)胞（圖7）。

圖6 NaCl、Glc 給藥24 h 表達(dá)8 d Pig-a 基因突變頻率

圖7 免疫熒光結(jié)果圖

2.6 突變位點(diǎn)序列分析

PCR 結(jié)果（表2）測(cè)序顯示存在4 種突變類型。

3 討論

表2 Pig-a 基因突變類型

已知非致突變化合物NaCl 和Glc 在本研究體系中均顯示為陰性結(jié)果，細(xì)胞與兩者共同作用24 h 后表達(dá)8 d 均未見CD90 突變率增加。EMS 屬于烷化劑，在非代謝活化狀態(tài)下可導(dǎo)致基因突變，以點(diǎn)突變?yōu)橹?。ENU 則是體內(nèi)Pig-a基因突變首選陽(yáng)性劑，可導(dǎo)致DNA 堿基烷化、互補(bǔ)堿基對(duì)橫向交聯(lián)等損傷，最終引發(fā)基因突變［15］。本研究結(jié)果顯示，上述兩種陽(yáng)性劑均可在非代謝活化條件下引起L5178Y 細(xì)胞Pig-a基因突變率顯著性升高，大于陰性對(duì)照的10倍。陽(yáng)性劑B（a）P 則需經(jīng)細(xì)胞微粒體中的混合功能氧化酶激活轉(zhuǎn)化為環(huán)氧化物，與DNA 共價(jià)結(jié)合形成加合物，從而誘發(fā)突變［16］。4-NQO 在還原酶的作用下可轉(zhuǎn)化為4-羥氨基喹啉-1-氧化物及4-乙酰基喹啉-1-氧化物，后者能以共價(jià)結(jié)合的方式結(jié)合核酸形成DNA 加合物，引起堿基的改變（G →A）［17-18］。本研究結(jié)果顯示在S9代謝活化條件下，B（a）P 濃度大于2 μg/mL 時(shí)與L5178Y 細(xì)胞作用4 h 后可引起Pig-a基因突變率顯著性升高，大于陰性對(duì)照的10倍。4 種陽(yáng)性化合物與2 種陰性化合物的試驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期相符。

EMS 作用于L5178Y 細(xì)胞24 h 后進(jìn)行20 d 表達(dá)培養(yǎng)，分別于第4、8、12、16、20 天檢測(cè)Pig-a基因突變頻率，整體趨勢(shì)呈現(xiàn)出先上升趨勢(shì)，于8 d左右出現(xiàn)峰值，后隨時(shí)間推移呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，提示最佳檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)為8 d。陽(yáng)性劑體內(nèi)Pig-a基因突變頻率變化為上升而無下降趨勢(shì)，體內(nèi)/外Pig-a基因突變頻率變化趨勢(shì)存在一定差異，主要原因是受試物進(jìn)入機(jī)體后產(chǎn)生骨髓毒性，通過不斷造血將突變細(xì)胞釋放至外周血，產(chǎn)生累積效應(yīng)。但L5178Y 細(xì)胞需通過稀釋傳代維持在合適的細(xì)胞密度，當(dāng)表達(dá)峰值過后再進(jìn)行稀釋傳代，突變細(xì)胞比例降低，故突變頻率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。L5178Y 細(xì)胞在給藥濃度設(shè)置上應(yīng)明確最高劑量，細(xì)胞毒性RPD 應(yīng)大于或略低于50%，以排除因細(xì)胞毒性過大而造成的假陽(yáng)性結(jié)果。免疫熒光結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)突變細(xì)胞表面無CD90表達(dá)。

ENU 致突變細(xì)胞測(cè)序結(jié)果顯示存在G →C，A →C，C →T 三種不同類型的點(diǎn)突變。相關(guān)研究顯示采用不同陽(yáng)性劑有不同的突變類型。David R等［9］研究結(jié)果顯示EMS 作用L5178Y 細(xì)胞后主要的突變類型有G →A，C →T 兩種突變類型；Javier Revollo 等［19］發(fā)現(xiàn)B（a）P 誘導(dǎo)的Pig-a基因突變主要是G：C 或富含G：C 序列的堿基對(duì)的取代，小插入或缺失等，主要的突變類型有G →T，G →C，G →A，A →T，T →C。

基因突變檢測(cè)是遺傳毒性評(píng)價(jià)的重要手段，本研究所用L5178Y 細(xì)胞建立Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)，與體內(nèi)Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)相比可大幅度節(jié)省試驗(yàn)成本，檢測(cè)耗時(shí)周期短，不涉及動(dòng)物倫理，符合“3R”原則?？蛇m用于Ames 試驗(yàn)中不適宜檢測(cè)的化合物，作為后續(xù)追蹤檢測(cè)。相較于傳統(tǒng)的hprt或tk基因突變存在一定的優(yōu)勢(shì)，試驗(yàn)耗時(shí)短，耗材少，可進(jìn)行高通量檢測(cè)。另外，L5178Y 細(xì)胞Pig-a基因自發(fā)突變率較低，試驗(yàn)前期無需進(jìn)行雜合性突變?nèi)笔z測(cè)，但tk基因突變則在試驗(yàn)前期進(jìn)行預(yù)清除［20］。對(duì)上述4 種試驗(yàn)方法進(jìn)行對(duì)比討論見表3。

綜上，本研究在國(guó)內(nèi)首次建立并驗(yàn)證報(bào)道流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)L5178Y 小鼠淋巴瘤細(xì)胞中Pig-a基因突變的方法，并使用四種誘變劑檢驗(yàn)該方法的有效性和可靠性。后期可經(jīng)不同實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行進(jìn)一步大規(guī)模聯(lián)合驗(yàn)證，建立和規(guī)范相關(guān)試驗(yàn)規(guī)程操作，作為藥物遺傳毒性致突變?cè)u(píng)價(jià)中介于Ames 試驗(yàn)和體內(nèi)Pig-a的橋梁，進(jìn)一步完善體外遺傳毒性致突變組合。

表3 Ames、Tk/Hprt、體外Pig-a、體內(nèi)Pig-a 基因突變對(duì)比

4 結(jié)論

本研究通過使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)EMS、ENU、B（a）P、4-NQO、NaCl、Glc 致小鼠淋巴瘤細(xì)胞L5178Y 表面GPI 連接的CD90 蛋白缺失情況，建立并驗(yàn)證基于L5178Y 細(xì)胞的體外Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)方法。