吳亞 徐智輝 張彪 趙冬芳 曹文欣 張興平

（長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，荊州 434025）

卡那霉素是一種氨基糖苷類(lèi)抗生素，由于其水溶性強(qiáng)、抗菌譜廣、對(duì)革蘭氏陰性菌的作用強(qiáng)而持久、價(jià)格便宜和用藥方便等優(yōu)點(diǎn)，作為獸藥和飼料添加劑被廣泛應(yīng)用［1-2］。但如果劑量過(guò)大就會(huì)大量殘留在動(dòng)物體內(nèi)，進(jìn)而通過(guò)食物鏈富集進(jìn)入人體，引發(fā)耳毒性、腎毒性等毒副作用，對(duì)神經(jīng)肌肉接頭產(chǎn)生阻滯作用，引起過(guò)敏反應(yīng)等，嚴(yán)重時(shí)會(huì)致人死亡［3-4］。歐盟、中國(guó)、日本等國(guó)家明確規(guī)定了動(dòng)物源食品中抗生素的最大殘留量（MRLs）≤200 μg/ kg［5-6］。因此，為預(yù)防過(guò)量卡那霉素殘留進(jìn)入人體，保障食品安全和人體健康，迫切需要高效、簡(jiǎn)單、靈敏的卡那霉素殘留檢測(cè)方法，進(jìn)一步提高動(dòng)物源性食品的安全性。

傳統(tǒng)的卡那霉素檢測(cè)方法包括高效液相色譜法（High performance liquid chromatography，HPLC）［7］、高效液相色譜-質(zhì)譜法［8］、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定［9］、電化學(xué)法［10］及毛細(xì)管電泳法［11］等。其中，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）使用最為廣泛，這種方法基于抗原抗體的吸附效果。但卡那霉素是半抗原物質(zhì)，因而效果依賴(lài)于抗體的品質(zhì)變化，且抗體不易操作、容易失活［12］。高效液相色譜-質(zhì)譜法可以對(duì)卡那霉素進(jìn)行精密檢測(cè)，但檢測(cè)前復(fù)雜的操作步驟，極大的限制了該類(lèi)方法的使用。電化學(xué)法檢測(cè)成本低、易微型化和容易實(shí)現(xiàn)在線監(jiān)測(cè)，但由于容易受到基質(zhì)的干擾且電極的修飾比較復(fù)雜，因而存在一定的局限性。毛細(xì)管電泳法分離效率高、分離速度快、樣品及試劑消耗少，但由于毛細(xì)管進(jìn)樣量少，使光路太短，導(dǎo)致制備能力差，靈敏度較低（表1）?；谏鲜鰝鹘y(tǒng)方法的不足，因而大量開(kāi)發(fā)基于核酸適配體的生物傳感器（Biosensor），以滿足人們對(duì)卡那霉素的檢測(cè)。生物傳感器是一種對(duì)生物物質(zhì)敏感并將其濃度轉(zhuǎn)換為光信號(hào)、電信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)的儀器。目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了基于電子［13］、電化學(xué)［14］、核磁共振［15］和光學(xué)傳感［16］等方法檢測(cè)抗生素和有毒有害物質(zhì)。本文將著重介紹核酸適配體光學(xué)生物傳感器在卡那霉素檢測(cè)中的研究進(jìn)展。

1990 年，Szostak 和Gold 等首次提出了核酸適配體（Aptamer）這一概念［17-18］。核酸適配體是一段能夠折疊成獨(dú)特二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)的同時(shí)能特異性地識(shí)別目標(biāo)物的單鏈DNA 或RNA，通常利用體外篩選技術(shù)指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX），從核酸分子文庫(kù)中得到的寡核苷酸片段。由于核酸適配體具有特異性高、穩(wěn)定性好、容易修飾等特點(diǎn)，目前被廣泛應(yīng)用于食品和環(huán)境監(jiān)測(cè)、蛋白質(zhì)監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域，基于核酸適配體的生物傳感器成為當(dāng)前檢測(cè)技術(shù)的前沿研究熱點(diǎn)之一［19-20］。2011 年，Song 等［21］成功篩選到了特異性結(jié)合卡那霉素的核酸適配體。

光學(xué)生物傳感器利用被測(cè)物質(zhì)與探測(cè)試劑反應(yīng)后引發(fā)的光信號(hào)作為探測(cè)基礎(chǔ)，由于其簡(jiǎn)便、靈敏度高、響應(yīng)快的特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥以及食品檢測(cè)行業(yè)。本文根據(jù)其反應(yīng)機(jī)制不同，將光學(xué)核酸適配體傳感器分為以下幾類(lèi)：基于比色法檢測(cè)卡那霉素的核酸適配體傳感器、基于熒光法檢測(cè)卡那霉素的核酸適配體傳感器和基于化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)卡那霉素的適配體傳感等3 大類(lèi)。本文主要針對(duì)這3 類(lèi)核酸適配體傳感器進(jìn)行總結(jié)與分析，旨在便于人們更多的了解光學(xué)核酸適配體傳感器在卡那霉素檢測(cè)中的應(yīng)用特點(diǎn)和發(fā)展現(xiàn)狀。

1 基于比色法檢測(cè)卡那霉素的核酸適配體傳感器

比色法（Colorimetry）是通過(guò)比較或測(cè)量有色物質(zhì)溶液顏色深度來(lái)確定待測(cè)組分含量的方法，由于成本低廉、方便快捷以及肉眼可觀察等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛使用［22］。納米金離子（AuNPs）由于其距離依賴(lài)的光學(xué)性質(zhì)，因而在比色法傳感器中受到了極大的關(guān)注［23］。另一類(lèi)適配體比色傳感是基于各種酶或模擬酶的催化顯色反應(yīng)，此類(lèi)適配體傳感器不僅具備肉眼可見(jiàn)的檢測(cè)結(jié)果，其中酶促催化的信號(hào)放大效應(yīng)可以獲得更高的靈敏度［24］。

1.1 基于納米金離子聚集顯色反應(yīng)

表1 傳統(tǒng)檢測(cè)方法優(yōu)缺點(diǎn)比較

2011 年，Song 等［21］設(shè)計(jì)了一款基于納米金離子的比色法檢測(cè)卡那霉素的傳感器，該傳感器原理如圖1-A 所示。核酸鏈可與納米金離子特異性結(jié)合，使其不受NaCl 誘導(dǎo)的聚集而變色。加入卡那霉素之后，核酸適配體與卡那霉素結(jié)合，納米金離子由于聚集從紅色變?yōu)樽仙?，再?duì)其顏色變化進(jìn)行分析，可得到關(guān)于卡那霉素的濃度曲線。該傳感器檢測(cè)限為25 nmol/L，該方法操作簡(jiǎn)便，無(wú)需標(biāo)記，但檢測(cè)限偏高。2015 年，Xu 等［25］設(shè)計(jì)了一種基于納米銀離子（AgNPs）比色法檢測(cè)卡那霉素。檢測(cè)原理與其類(lèi)似，其檢測(cè)范圍為0.1 μmol/L-1.24 μmol/L，檢測(cè)限為5.36 nmol/L。該方法相對(duì)于納米金離子，成本更低，且有更高的消光系數(shù)，因而最近被廣泛用作比色傳感系統(tǒng)。

2017 年，Lai 等［26］設(shè)計(jì)了一種基于卡那霉素與殼聚糖之間的氫鍵識(shí)別檢測(cè)卡那霉素的方法，該傳感器原理如圖1-B 所示。殼聚糖表面具有氨基，可以通過(guò)靜電作用與帶負(fù)電荷的AuNPs 結(jié)合。此時(shí)加入卡那霉素，它可通過(guò)氫鍵相互作用與殼聚糖結(jié)合，從而導(dǎo)致AuNPs 相互交聯(lián)，顏色由酒紅變?yōu)樗{(lán)色。其檢測(cè)范圍是0.01 μmol/L-40 μmol/L，檢測(cè)限是8 nmol/L。該方法操作簡(jiǎn)單，在實(shí)際樣品中檢測(cè)偏差較小，且檢測(cè)效果肉眼可直接觀察，具有很好的可行性，但由于其缺少信號(hào)循環(huán)放大過(guò)程，導(dǎo)致檢測(cè)限偏高。Xu 等［27］設(shè)計(jì)了一種利用雜交鏈反應(yīng)輔助信號(hào)放大的方法來(lái)檢測(cè)卡那霉素的新方法。該方法中存在3 個(gè)可特異性吸附于AuNPs 上并具有黏性末端的DNA 片段，體系中不存在卡那霉素時(shí)，納米金離子由于與DNA 鏈結(jié)合而避免其聚合，不會(huì)發(fā)生變色反應(yīng)。當(dāng)體系存在卡那霉素時(shí)，適配體DNA 片段與其結(jié)合，新暴露的DNA 片段引發(fā)一系列的雜交鏈反應(yīng)，產(chǎn)生大量雙鏈DNA，此時(shí)加入NaCl，導(dǎo)致雙鏈DNA 與納米金離子相互排斥，納米金離子聚集而變?yōu)樗{(lán)色。該方法檢測(cè)范圍為1 μmol/L-40 μmol/L。

1.2 基于各種酶或模擬酶的催化顯色反應(yīng)

在復(fù)雜的生物流體中，納米金離子存在非特異性聚集變色，這對(duì)于其比色法檢測(cè)仍然是一個(gè)不小的挑戰(zhàn)。2012 年，Sharma 等［28］利用了金納米粒子自身具有過(guò)氧化氫酶活性開(kāi)發(fā)了一種超快速和高靈敏度的“關(guān)閉/開(kāi)啟”生物傳感方法檢測(cè)卡那霉素，該傳感器原理如圖2-A 所示。納米金離子能催化無(wú)色底物3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（Tetramethylbenzidine，TMB）氧化成紫紅色-藍(lán)色產(chǎn)物。該實(shí)驗(yàn)先將卡那霉素適配體與納米金離子結(jié)合，當(dāng)體系不存在卡那霉素時(shí)，納米金離子因被核酸鏈包裹無(wú)法發(fā)揮其氧化作用；當(dāng)體系存在卡那霉素時(shí)，核酸適配體與其結(jié)合，納米金離子將TMB 氧化為T(mén)MBox，再通過(guò)將納米金離子的過(guò)氧化物酶樣活性變化轉(zhuǎn)化為卡那霉素濃度的變化，最后，得出該傳感器檢測(cè)范圍1 nmol/L-100 nmol/L。該方法相較于傳統(tǒng)方法，避免了納米金離子的非特異性聚集變色而導(dǎo)致的誤差，具有簡(jiǎn)單、高效的特點(diǎn)。

圖1 基于納米金離子聚集顯色反應(yīng)原理圖

2019 年，Chen 等［29］結(jié)合核酸外切酶Ⅲ對(duì)其檢測(cè)信號(hào)進(jìn)行循環(huán)擴(kuò)增，從而達(dá)到高效檢測(cè)卡那霉素的目的。該方法的原理如圖2-B 所示，S1為G-四鏈體，具有DNAzyme 序列（具有催化功能的DNA 分子），S2為卡那霉素核酸適配體，S2與S1可以配對(duì)結(jié)合從而抑制其催化活性，使其進(jìn)入“信號(hào)關(guān)閉”狀態(tài)。當(dāng)加入卡那霉素時(shí)，卡那霉素與核酸適配體S2結(jié)合，釋放的S1恢復(fù)DNAzyme 活性，呈現(xiàn)“信號(hào)開(kāi)啟”狀態(tài)，結(jié)合血紅素將TMB 氧化變色，通過(guò)顏色變化得到卡那霉素濃度曲線。如果沒(méi)有核酸外切酶Ⅲ的介導(dǎo)，僅僅只有一定量的卡那霉素與一定量的適配體結(jié)合，釋放的S1是一定的，產(chǎn)生的信號(hào)也是一定的。但是如果加入了外切酶Ⅲ的介導(dǎo)，S1的量便會(huì)增加。此時(shí)卡那霉素適配體可與其互補(bǔ)序列S3結(jié)合，核酸外切酶Ⅲ可從雙鏈DNA 3′末端進(jìn)行剪切，適配體被破壞導(dǎo)致卡那霉素釋放，卡那霉素又重新與核酸適配體S2結(jié)合，使得S1鏈不斷被積累，從而達(dá)到信號(hào)循環(huán)放大效果，實(shí)現(xiàn)了對(duì)卡那霉素的超靈敏檢測(cè)。該方法檢測(cè)范圍0.21 pmol/L-20.62 nmol/L，檢測(cè)限為0.093 pmol/L，該方法優(yōu)點(diǎn)是無(wú)需特異性標(biāo)記，且對(duì)其信號(hào)有循環(huán)擴(kuò)增，與常規(guī)方法相比靈敏度得到了極大的提高。Cui 等［30］也采用類(lèi)似的雙缺口酶信號(hào)放大方法設(shè)計(jì)了一種傳感器，利用G-四鏈體與血紅素結(jié)合將2，2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS2-）氧化為ABTS1-的顏色變化來(lái)對(duì)卡那霉素進(jìn)行檢測(cè)，該方法有效的減少了G-四鏈體自身組裝的背景信號(hào)，檢測(cè)限低至14.7 pmol/L。

圖2 基于各種酶或模擬酶的催化顯色反應(yīng)原理圖

基于比色法檢測(cè)卡那霉素的核酸適配體傳感器成本低，操作簡(jiǎn)便，并且檢測(cè)效果肉眼直接可見(jiàn)，且大部分都是基于納米金離子的聚集顯色效應(yīng)實(shí)現(xiàn)對(duì)卡那霉素的檢測(cè)分析，另一部分是基于各種酶的催化顯色反應(yīng)，利用酶切進(jìn)行信號(hào)循環(huán)擴(kuò)增，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)卡那霉素的精準(zhǔn)檢測(cè)。由于金納米粒子對(duì)鹽離子的耐受性較差，且模擬酶對(duì)檢測(cè)條件也要求較高，因而這類(lèi)方法也存在一定的局限性。

2 基于熒光法檢測(cè)卡那霉素的核酸適配體傳感器

帶有熒光探針的生物傳感器由于其雜交動(dòng)力快速、易于自動(dòng)化，越來(lái)越受到科研人員的重視［31］?；跓晒獾呐湮惑w主要基于兩種模式：標(biāo)記型的和非標(biāo)記型的配位體傳感器［32］。

2.1 基于熒光標(biāo)記型傳感器

2017 年，Liao 等［33］利用熒光素標(biāo)記的核酸鏈作為報(bào)告基團(tuán)對(duì)卡那霉素進(jìn)行檢測(cè)，該方法的原理如圖3-A 所示。該方法首先對(duì)一條核酸鏈末端進(jìn)行熒光素標(biāo)記；另一條為卡那霉素適配體。當(dāng)體系中不存在卡那霉素時(shí)，兩條核酸鏈互補(bǔ)結(jié)合，熒光素可正常發(fā)出熒光；當(dāng)體系存在卡那霉素時(shí)，卡那霉素與適配體結(jié)合，雙鏈去雜交，另外一條鏈與碳納米管（CNT）發(fā)生非共價(jià)結(jié)合，因而熒光信號(hào)淬滅，熒光強(qiáng)度與卡那霉素濃度成反比。此傳感器檢測(cè)范圍為1.0 nmol/L-50 nmol/L，檢測(cè)限為0.4 nmol/L。該方法缺點(diǎn)是需要熒光素標(biāo)記，操作流程較為復(fù)雜，且沒(méi)有信號(hào)循環(huán)放大處理，因而檢測(cè)限偏高。

2018 年，Ahmed 等［34］利用1，4-二取代-1，2，3-三氮唑作為報(bào)告基團(tuán)開(kāi)發(fā)了一種檢測(cè)卡那霉素生物傳感器，該方法原理如圖3-B 所示。兩段卡那霉素核酸適配體分別被生物素和Cus 納米顆粒標(biāo)記。只有當(dāng)體系中存在卡那霉素時(shí)，其適配體才能結(jié)合形成頸環(huán)結(jié)構(gòu)，Cu2+可在磁鐵吸附作用下從適配體被解離，再用抗壞血酸鈉將Cu2+還原為Cu1+，此還原過(guò)程催化3-疊氮基-7-羥基香豆素生成1，4-二取代-1，2，3-三氮唑。1，4-二取代-1，2，3-三氮唑產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光信號(hào)與卡那霉素量成正比，其檢測(cè)范圍為0.04 nmol/L-20 nmol/L。該方法不足之處是需要對(duì)兩條鏈末端分別進(jìn)行標(biāo)記，操作流程相對(duì)復(fù)雜，且不同批次的標(biāo)記探針存在差異，對(duì)操作技能要求較高。

2.2 基于熒光法非標(biāo)記型傳感器

2014 年，Wu 等［35］設(shè)計(jì)了一種基于熒光共振能 量 轉(zhuǎn) 移（Fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）檢測(cè)卡那霉素的傳感器，該傳感器原理圖如4-A 所示。光納米粒子（UCUPs）與石墨烯分別為能量供受體，將卡那霉素適配體固定在光納米粒子上，適配體與石墨烯之間的π π 堆積作用使光納米粒子與石墨烯接近，此時(shí)由于二者距離相近，導(dǎo)致光納米粒子熒光淬滅，處于信號(hào)關(guān)閉狀態(tài)。體系存在卡那霉素時(shí)，適配體結(jié)合卡那霉素變?yōu)榘l(fā)卡結(jié)構(gòu)，而發(fā)卡結(jié)構(gòu)對(duì)石墨烯的親和力較低，導(dǎo)致石墨烯從適配體上解離下來(lái)，二者距離變遠(yuǎn)，光納米粒子熒光恢復(fù)。該傳感器檢測(cè)范圍為0.01 nmol/L-3 nmol/L，檢測(cè)限為9 pmol/L。該方法無(wú)需特異性標(biāo)記，對(duì)卡那霉素有良好的特異性，且不受其它抗生素的干擾，在實(shí)際生活中有廣闊的應(yīng)用前景。

圖3 基于熒光法標(biāo)記型傳感器原理圖

2015 年，Xing 等［36］首次報(bào)道了結(jié)合卡那霉素的核酸適配體可自發(fā)形成平行G-四鏈體DNA 結(jié)構(gòu)，該方法的原理如圖4-B 所示。當(dāng)該G-四鏈體結(jié)構(gòu)結(jié)合噻唑橙（TO）時(shí)，可發(fā)出強(qiáng)烈的熒光。當(dāng)體系存在卡那霉素時(shí)，G-四鏈體結(jié)合卡那霉素，噻唑橙被替換，此時(shí)熒光信號(hào)顯著下降，熒光信號(hào)與卡那霉素濃度成反比，從而達(dá)到檢測(cè)的目的。該方法檢測(cè)范圍為0.1 mmol/L-20 mmol/L，檢測(cè)限為59 nmol/L。該方法無(wú)需標(biāo)記，操作簡(jiǎn)單易行，缺點(diǎn)是缺少信號(hào)循環(huán)放大過(guò)程，檢測(cè)限較高。2018 年，Zhu 等［37］也利用G-四鏈體與硫黃素T（Thioflavin T，ThT）結(jié)合發(fā)光的性質(zhì)設(shè)計(jì)了一種傳感器，該傳感器由兩個(gè)發(fā)卡結(jié)構(gòu)結(jié)合形成，中部為富含鳥(niǎo)嘌呤（G）的寡核酸鏈。當(dāng)加入硫黃素T 且不存在卡那霉素時(shí)，富G 寡核酸鏈形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)，并發(fā)出強(qiáng)烈的熒光；當(dāng)體系存在卡那霉素時(shí)，卡那霉素與核酸適配體結(jié)合，G-四鏈體結(jié)構(gòu)無(wú)法形成導(dǎo)致熒光信號(hào)下降。該傳感器在卡那霉素濃度0.7 nmol/L-10 nmol/L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢測(cè)限為0.37 nmol/L。該方法不需要復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，選擇性強(qiáng)，能有效的檢測(cè)實(shí)際樣品中的卡那霉素。

2018 年，Zhang 等［38］利 用 雜 交 鏈 式 反 應(yīng)（Hybridization chain reaction，HCR）與SYBR Green I熒光染料發(fā)光現(xiàn)象，研制了一種新的傳感器，該生物傳感器的原理如圖4-C 所示。該方法利用SYBR Green I 為報(bào)告基團(tuán)，利用其熒光信號(hào)的升降來(lái)檢測(cè)其含量。該方法首先用S1與S2核酸鏈與卡那霉素適配體結(jié)合，形成Y 形DNA 探針被固定在金條上，S3將H1和H2核酸鏈固定于磁條上。當(dāng)體系存在卡那霉素時(shí)，核酸適配體與其結(jié)合導(dǎo)致S2釋放，觸發(fā)了H1和H2從磁條上的釋放，溶液中出現(xiàn)了很多雙鏈，H1和H2用于信號(hào)放大器。利用SYBR Green I 染料特異性侵入DNA 雙鏈發(fā)射熒光信號(hào)的原理，對(duì)卡那霉素進(jìn)行定量分析，因此卡那霉素含量越高，釋放的雙鏈越多，染色熒光信號(hào)就越高。該方法檢測(cè)限為0.93 pmol/L，其克服了HCR 的非特異性擴(kuò)增，利用金棒和磁棒特異性吸附，使其信號(hào)得到了放大，提高了檢測(cè)靈敏度，且無(wú)需標(biāo)記。

2018 年，Dehghani 等［39］設(shè)計(jì)了一種基于二氧化硅納米顆粒（MSN）和羅丹明B 作為熒光探針的新型生物傳感器檢測(cè)卡那霉素，該生物傳感器的原理如圖4-D 所示。二氧化硅納米顆粒先與羅丹明B結(jié)合，再用雙鏈DNA 分子進(jìn)行門(mén)控固定。當(dāng)加入卡那霉素時(shí)，雙鏈DNA 分子中的卡那霉素適配體與其結(jié)合，從而揭開(kāi)毛孔導(dǎo)致羅丹明B 泄露，熒光強(qiáng)度增加，通過(guò)測(cè)量熒光強(qiáng)度來(lái)檢測(cè)卡那霉素的存在。該傳感器檢測(cè)范圍為24.75 nmol/L-137.15 nmol/L，檢測(cè)限為7.5 nmol/L。該方法還可檢測(cè)血清中卡那霉素含量，并可將與其他抗生素分離開(kāi)來(lái)。

基于熒光類(lèi)檢測(cè)卡那霉素是目前最流行的方法之一，由于其具有極高的靈敏度、易于檢測(cè)［40-41］，且大多采用分光光度計(jì)對(duì)其進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)，通過(guò)熒光強(qiáng)度的變化實(shí)現(xiàn)對(duì)卡那霉素的定量檢測(cè)，對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器要求低。對(duì)于標(biāo)記型與非標(biāo)記型兩類(lèi)傳感器，區(qū)別在于標(biāo)記型傳感器需要對(duì)探針進(jìn)行熒光標(biāo)記，且不同批次的探針可能存在檢測(cè)差異；非標(biāo)記型傳感器無(wú)需探針的耗時(shí)標(biāo)記以及分離純化，有效的降低了不同批次探針的差異。因而表現(xiàn)出了極大的優(yōu)勢(shì)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)卡那霉素的精準(zhǔn)檢測(cè)。

圖4 基于熒光法非標(biāo)記型傳感器原理圖

3 基于化學(xué)發(fā)光檢測(cè)卡那霉素的適配體傳感器

基于化學(xué)發(fā)光的卡那霉素適配體傳感器因其裝置成本低廉、不需要外部光源或光學(xué)元件以及較寬的線性檢測(cè)范圍等優(yōu)點(diǎn)而被公認(rèn)為是一種優(yōu)良的分析方法。

2013 年，Leung 等［42］利用發(fā)光鉑（II）絡(luò)合物與卡那霉素適配體結(jié)合形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)發(fā)光的現(xiàn)象而制備的傳感器，該生物傳感器的原理如圖5-A 所示。當(dāng)體系不存在卡那霉素時(shí)，該結(jié)構(gòu)發(fā)光信號(hào)低；當(dāng)卡那霉素存在時(shí)，卡那霉素適配體從無(wú)規(guī)卷曲變?yōu)榘l(fā)卡結(jié)構(gòu)，這有利于鉑復(fù)合物插入其中，從而發(fā)出強(qiáng)烈的化學(xué)信號(hào)。該方法檢測(cè)范圍為0.2 μmol/L-150 μmol/L，檢測(cè)限為143 nmol/L，操作簡(jiǎn)單快捷，缺點(diǎn)是沒(méi)有信號(hào)循環(huán)擴(kuò)增，檢測(cè)限較高。

2018 年，Yao 等［43］基于金納米團(tuán)簇催化并結(jié)合磁珠（MBs）的分離，開(kāi)發(fā)了一種低背景化學(xué)發(fā)光傳感器，該生物傳感器的原理如圖5-D 所示。該傳感器包括兩條DNA 鏈，分別為DNA1和DNA2，DNA1為卡那霉素適配體，它可通過(guò)酰胺化方式被固定于被許多氨基修飾的磁珠上。DNA25′端可通過(guò)紫外線輔助方法與納米金粒子結(jié)合，其3′端與DNA1互補(bǔ)結(jié)合。當(dāng)體系存在卡那霉素時(shí)，DNA1與其結(jié)合，DNA2則被迫釋放。此時(shí)富集的納米金離子則催化H2O2分解，其中單氧可氧化魯米洛（Luminol）發(fā)出藍(lán)光。該傳感器檢測(cè)限為0.035 nmol/L，并且，該傳感器僅通過(guò)改變固定在磁珠上的適配體就可以用于分析不同的靶標(biāo)，能夠靈活的用于各種不同的抗生素的檢測(cè)。Hao 等［44］基于碘苯酚（Iodophenol）構(gòu)建了ABEI（N-（4-氨基丁基）-N-乙基異魯米諾）AuNPs-H2O2-PIP 穩(wěn)態(tài)化學(xué)發(fā)光體系檢測(cè)卡那霉素、土霉素及四環(huán)素。該傳感器首先將這3 類(lèi)抗生素的適配體通過(guò)親和素固定于孔板上，以ABEI-AuNP 為信號(hào)探針，此時(shí)抗生素與探針競(jìng)爭(zhēng)性的與適配體結(jié)合，探針結(jié)合適配體后可催化H2O2分解，氧化PIP發(fā)光，此時(shí)發(fā)光程度與抗生素濃度成反比。該方法對(duì)于卡那霉素檢測(cè)范圍為0.01 nmol/L-1.03 nmol/L，檢測(cè)限為0.004 nmol/L。該方法能同時(shí)檢測(cè)3 類(lèi)抗生素，且選擇性較好，因而呈現(xiàn)了巨大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

圖5 基于化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)卡那霉素的核酸適配體傳感器原理圖

該類(lèi)方法所需的化學(xué)發(fā)光物質(zhì)種類(lèi)較少，常見(jiàn)的有魯米諾和氨丁基乙基異魯米諾等，且有些物質(zhì)發(fā)光性能不穩(wěn)定，如魯米洛，化學(xué)發(fā)光反應(yīng)2 min后，光發(fā)射強(qiáng)度達(dá)到最高峰，20 min 后，光強(qiáng)度減少20%，并且檢測(cè)效果也因不同的設(shè)計(jì)方案呈現(xiàn)很大的區(qū)別，存在一定的檢測(cè)局限性。但該類(lèi)方法由于不需要納米顆粒、免疫試劑或衍生寡核苷酸，因此具有一定的經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)。

4 總結(jié)與展望

核酸適配體傳感器的飛速發(fā)展，為檢測(cè)食品中抗生素的含量提供了新方法。同時(shí)引入具有特殊光學(xué)性質(zhì)的納米材料構(gòu)筑新型適配體傳感器，能夠進(jìn)一步提高檢測(cè)方法的靈敏度和選擇性。以上3 類(lèi)傳感器各有優(yōu)劣，基于比色法的傳感器因其操作方便，檢測(cè)結(jié)果肉眼可見(jiàn)而受到人們的青睞，但其檢測(cè)限偏高；基于熒光法的傳感器是目前應(yīng)用最廣泛的適配體傳感器之一，其檢測(cè)方式多種多樣，且其檢測(cè)限最低；基于化學(xué)發(fā)光的傳感器檢測(cè)限也偏高，且對(duì)其研究相對(duì)較少，但由于其不需要外部光源或光學(xué)元件，因而存在一定的應(yīng)用前景。這幾類(lèi)方法的檢測(cè)范圍層次不齊，大部分檢測(cè)限都偏高，距離實(shí)際應(yīng)用還有很長(zhǎng)的距離。因此，有效的信號(hào)擴(kuò)增技術(shù)是解決該問(wèn)題的重要途徑，可將酶切循環(huán)技術(shù)與卡那霉素核酸適配體及最近比較流行的G-四鏈體發(fā)光技術(shù)相結(jié)合，以達(dá)到高效、靈敏地檢測(cè)卡那霉素的目的。對(duì)這些方法的探索將進(jìn)一步為食品安全檢測(cè)提供新的技術(shù)支撐。