趙國龍 林春晶 金東淳 張春寶

（1. 延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，延吉 133000；2. 吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大豆研究所，長春 130033）

雜種優(yōu)勢（Heterosis）指具有不同遺傳性狀的兩個(gè)純系父母本雜交產(chǎn)生子一代，即雜交種，其后代在抗逆性、抗病性、適應(yīng)性、生長以及品質(zhì)和產(chǎn)量等方面均優(yōu)于父母本的生物現(xiàn)象［1］。由于全球人口不斷增加，可耕地面積有限，通過作物雜種優(yōu)勢利用，可大幅提升農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，提高土地利用效率和產(chǎn)出［2-3］。雜種優(yōu)勢利用一般都基于雄性不育系統(tǒng)，在作物中應(yīng)用最多的是細(xì)胞質(zhì)雄性不育（Cytoplasmic male sterility，CMS）系統(tǒng)，其由不育系、保持系和恢復(fù)系構(gòu)成，不育系和恢復(fù)系雜交F1代，即為雜交種。細(xì)胞質(zhì)雄性不育是因?yàn)榫€粒體基因和核基因互作，導(dǎo)致不育系不能產(chǎn)生有活力的花粉或花粉絨氈層異構(gòu)化發(fā)生敗育，而恢復(fù)系中細(xì)胞核恢復(fù)基因（Fertility restorer gene，Rf）編碼的線粒體靶向蛋白可以影響不育基因轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而使得育性恢復(fù)［4］。

在恢復(fù)系選育過程中，Rf基因的有無主要通過引進(jìn)資源與母本逐個(gè)測交來檢測，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。精細(xì)定位并克隆Rf 基因，利用分子標(biāo)記技術(shù)輔助選育（Marker assisted selection，MAS）或轉(zhuǎn)基因、基因編輯等手段人工創(chuàng)制恢復(fù)系，可以提升恢復(fù)系的選育進(jìn)程，縮短雜交種選育周期。因此，本文針對主要農(nóng)作物Rf 基因的遺傳模式、分子標(biāo)記定位、克隆的研究進(jìn)展及利用CMS/Rf系統(tǒng)在作物雜交種創(chuàng)制中的應(yīng)用進(jìn)行了論述。

1 主要作物Rf 基因的遺傳模式

成功選育雜交“三系”中的恢復(fù)系是創(chuàng)制雜交種的重要一環(huán)，而研究恢復(fù)基因的遺傳模式是選育強(qiáng)恢復(fù)系的理論基礎(chǔ)。CMS 的育性恢復(fù)基因的遺傳模式有兩種，即以孢子體不育胞質(zhì)為基礎(chǔ)的遺傳模式和以配子體不育胞質(zhì)為基礎(chǔ)的遺傳模式。以孢子體不育胞質(zhì)為母本，若恢復(fù)其育性的基因由1 對基因控制，則其后代的分離比為3∶1，依次類推。以配子體不育胞質(zhì)為母本，若恢復(fù)其育性的基因由1對基因控制，則其后代的分離比為1∶1，依次類推。由于其受體母本和決定基因的差異，導(dǎo)致對應(yīng)的Rf基因的遺傳方式也有所差異［5-7］。對此，針對國內(nèi)外主要農(nóng)作物不育細(xì)胞質(zhì)類型及對應(yīng)的Rf基因進(jìn)行歸納，如表1 所示。

2 主要作物Rf 基因的定位及克隆

CMS/Rf 系統(tǒng)可以經(jīng)濟(jì)且有效地生產(chǎn)雜交種，其育性可以被Rf基因恢復(fù)。研究者通過構(gòu)建臨時(shí)分離群體或永久性分離群體對相關(guān)Rf基因進(jìn)行定位。隨著分子技術(shù)、基因組學(xué)和測序技術(shù)的深入，現(xiàn)已獲得了大量與水稻、玉米等主要作物Rf基因連鎖的標(biāo)記，其中有12 個(gè)Rf基因被克隆鑒定。這些Rf基因大多屬于PPR 基因家族，其編碼的PPR 蛋白通過影響不育基因的轉(zhuǎn)錄本和翻譯產(chǎn)物致使育性恢復(fù)。因此，精細(xì)定位和克隆Rf基因可以為創(chuàng)制有效的強(qiáng)恢復(fù)系創(chuàng)造基礎(chǔ)條件。下面具體闡述主要作物Rf基因的定位和克隆。

2.1 水稻（Oryza sativa）主要類型Rf基因的定位與克隆

表1 主要作物中常見不育細(xì)胞質(zhì)類型及其恢復(fù)基因

水稻目前已經(jīng)有超過60 種不育胞質(zhì)被報(bào)道，研究和應(yīng)用最多的是野敗型（CMS-WA）、紅蓮型（CMS-HL）和包臺型（CMS-BT）［35］。對應(yīng)的恢復(fù)系也種類繁多，但其攜帶的Rf基因不盡相同。大量研究證明，水稻的主效Rf基因集中定位于1、8 和10號染色體上，部分基因已被克隆。這為水稻恢復(fù)系MAS 和定向創(chuàng)制提供理論基礎(chǔ)。

2.1.1 CMS-WA 型 CMS-WA 型水稻的Rf基因研究是最多且最深入的?，F(xiàn)今一般認(rèn)為CMS-WA 育性恢復(fù)以2 對主效基因控制。Bharaj 等［36］最先鑒定出了兩個(gè)恢復(fù)基因Rf-WA-1（主效）和Rf-WA-2（微效），其分別定位于7 號和10 號染色體上。隨后，景潤春等［9］在恢復(fù)系IR24 中也檢測到2 對主效基因，即Rf3和Rf4，通過ISSR 和SSLP 標(biāo)記定位到1 號和10 號染色體上。此外，Balaji 等［37］，Cai 等［10］也利用不同的材料，分別通過InDel 和SSSL 標(biāo)記將Rf3，Rf4基因定位在1 號和10 號染色體上，其中Rf3的效應(yīng)大于Rf4且存在一定的加性效應(yīng)。但有學(xué)者在7號染色體上僅定位獲得1 對野敗型育性Rf基因，且于RM182 緊密連鎖［38］。Kazama 等［39］基于圖位克隆法鑒定了CMS-WA 型水稻的Rf4基因，其含有多個(gè)PPR 基序，通過減少orf352基因的轉(zhuǎn)錄本，從而恢復(fù)花粉生育力。Tang 等［40］也通過圖位克隆法獲得3 個(gè)Rf4候選基因，最終通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化驗(yàn)證了PPR9-782-M基因?yàn)镽f4基因，其編碼782 個(gè)氨基酸，具有育性恢復(fù)的能力。

2.1.2 CMS-HL 型 CMS-HL 型不育細(xì)胞質(zhì)從紅芒野生稻中選育而來，是配子體不育類型。目前認(rèn)為CMS-HL 育性恢復(fù)受1 對主效基因控制。已定位發(fā)現(xiàn)的Rf基因 有Rf5和Rf6。Liu 等［11］利用RFLP、RAP 和SSR 標(biāo)記將密陽23 中的Rf5定位于10 號染色體的RM5456 和RM171 標(biāo)記之間，兩標(biāo)記的遺傳距離為5.57 cM。Huang 等［41］將Rf6基因定位于8 號染色體的RM407 和SNP32，其物理距離為16.8 kb。目前Rf5和Rf6基因已被克隆和鑒定，Rf5與CMS-BT 的Rf1a基因很相似，但Rf5編碼的蛋白在剪切atp6-orfH79轉(zhuǎn)錄本時(shí)具有不同的方式；Rf6可以編碼894 個(gè)氨基酸，并含有20 個(gè)PPR 基序［41-42］。

2.1.3 CMS-BT 型 CMS-BT 型水稻與HL 型類似，屬于配子體不育類型。目前已定位克隆了1 對Rf基因，即Rf1，其位于10 號染色體上。1975 年由Shinjyo 最先檢測到Rf1基因。之后不同學(xué)者的相關(guān)研究，得出了一致的結(jié)論。例如，Komori 等［43］利用穩(wěn)定的RFLP 標(biāo)記將Rf1基因精細(xì)定位到10 號染色體的S12564Tsp509I 和C1361MwoI 之間，其遺傳距離僅有0.3 cM。Wang 等［44］通過圖位克隆法獲得了Rf1基因，研究表明Rf1基因中含有多個(gè)重復(fù)的PPR 基序，其基因座中有2 個(gè)完整的開放閱讀框，即Rf-1a，Rf-1b。其編碼的線粒體靶向蛋白作用于atp6-orf79基因上，使mRNA 降解，從而減少毒性蛋白，最終恢復(fù)不育系育性。

2.2 玉米（Zea mays）主要類型Rf基因的定位與克隆

玉米CMS 距今已經(jīng)有超過40 種不育胞質(zhì)，大致有CMS-T、S、C 型3 個(gè)組群［45］，其CMS/Rf 系統(tǒng)也是應(yīng)用最成功的作物之一。結(jié)合全基因組關(guān)聯(lián)分析得出，玉米的主效Rf基因有5 個(gè)，即Rf1～Rf5，其主要分布在2、3、5、8 和9 號染色體上，這為玉米Rf基因的克隆指明了方向。

2.2.1 CMS-T 型 CMS-T 型玉米是孢子體不育類型。目前研究證明的T 型Rf基因有Rf1和Rf2，且存在互補(bǔ)效應(yīng)。Wise 等［13］最先利用RFLP 分子標(biāo)記將Rf1基因定位于3 號染色體的umc97 和umc92 之間；Rf2基因定位于9 號染色體的umc153 和sus1 之間。Cui 等［46］通過轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法克隆到CMS-T 型玉米的第一個(gè)Rf基因Rf2，序列表明Rf2編碼的蛋白不含PPR，而是一種存在兩個(gè)基因座的乙醛脫氫酶，推測其通過影響線粒體的功能致使育性恢復(fù)。

2.2.2 CMS-S 型 CMS-S 型玉米是配子體不育類型，其育性易受環(huán)境因素的影響，僅靠1 對Rf3基因控制育性恢復(fù)。Kamps 等［47］最先利用RFLP 標(biāo)記檢測定位到位于2 號染色體上的Rf3基因，與其緊密連鎖的標(biāo)記為whp 和bnl17.14，兩標(biāo)記相距10.7 cM。Zhang 等［15］利 用SSR、AFLP、SCAR、CAPS 等 標(biāo)記進(jìn)行篩選，結(jié)果表明，Rf3基因位于2 號染色體長臂上的E7P6 和Scare12M7 之間，遺傳距離分別為0.9 cM 和1.8 cM［15］。李鵬等［48］根據(jù)SSR 標(biāo)記獲得了與Rf3基因緊密連鎖的標(biāo)記A165 和CG2，此區(qū)間僅有兩個(gè)完整的基因，推測其中一個(gè)可能為Rf3基因。李文明［49］采用SSR 標(biāo)記結(jié)合SNP 標(biāo)記篩選，將Rf3基因定位于2 號染色體的SNP-234011 至SNP-227652 之間，其間包含641 kb，并存在6 個(gè)線粒體靶向基因。李鵬等［48］進(jìn)一步通過定位結(jié)果推測GRMZM2G450166基因可能是Rf3基因，其序列編碼一個(gè)由814 個(gè)氨基酸組成的PPR 家族蛋白，預(yù)測此蛋白可以降解不育基因orf355/orf77轉(zhuǎn)錄的mRNA，從而恢復(fù)花粉的育性，并進(jìn)一步構(gòu)建載體通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)驗(yàn)證其功能。但是，目前Rf3基因仍未明確被克隆。

2.2.3 CMS-C 型 目前在CMS-C 型玉米中已發(fā)現(xiàn)了位于8 號和5 號染色體上的Rf4和Rf5，且二者存在加性效應(yīng)。Rf4恢復(fù)能力明顯強(qiáng)于Rf5。劉偉華等［50］通過SSR 標(biāo)記和InDel 標(biāo)記，將Rf4基因定位在umc1483 和8 號染色體短臂末端之間。邵可可等［16］同樣利用SSR、InDel 標(biāo)記進(jìn)行篩選，將Rf4基因精細(xì)定位在8 號染色體的X-21-1 與X-33 之間，其間僅有60 kb。牟碧濤等［51］證明Z16 中存在1對恢復(fù)基因，并獲得與Rf5基因緊密連鎖的標(biāo)記為B-1。Liu 等［52］在A619 中發(fā)現(xiàn)了與Rf5不同的基因Rf*-A619。孫玲凌［53］，邵可可［16］分別利用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法和圖位克隆法克隆了Rf4基因，Rf4基因不含PPR 基序也沒有發(fā)現(xiàn)線粒體靶向信號肽，是RNA 聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄因子，但其如何解除不育基因產(chǎn)生的毒性蛋白，還需進(jìn)一步探究。

2.3 小麥（Triticum aestivuml）主要類型Rf基因的定位與克隆

小麥作為第三大糧食作物，屬自花授粉的六倍體作物，其基因組比較龐大且復(fù)雜，因此小麥的CMS 系統(tǒng)研究相對困難。目前，研究最多的主要是CMS-T、K 和V 型3 種，現(xiàn)已檢測和定位的Rf基因已經(jīng)超過16 個(gè)。經(jīng)Rf基因的逐步解析，方便了強(qiáng)恢復(fù)系的選育，有效的解決了恢復(fù)系稀少的問題。

2.3.1 CMS-K 型 CMS-K 型小麥的不育胞質(zhì)源于粘果山羊草，是最有潛力的配子體不育類型，但其對應(yīng)的強(qiáng)恢復(fù)系較少，這是限制CMS-K 型小麥應(yīng)用的主要因素。因此，定位并克隆CMS-K 型Rf基因有助于其雜交系統(tǒng)在生產(chǎn)上的應(yīng)用。現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)和定位的CMS-K 型Rf基因是位于1BS 和2BL 上的Rfk1和Rfk2。詹克慧［54］研究表明，Rfk1與Rfk2有疊加效應(yīng)，Rfk1基 因 定 位 在1BS 染 色 體 的Xgwm11 和Xgwm347 之 間，Rfk2基 因 定 位 在2BL 染 色 體 的Xgwm526 附近。孫文鑫［17］對這兩個(gè)主效Rf基因進(jìn)行定位，而且證明了Rfk1恢復(fù)力強(qiáng)于Rfk2，但Rfk1與Rfk2的克隆還未見報(bào)道。

2.3.2 CMS-T 型 CMS-T 型小麥的不育胞質(zhì)源于提莫菲維小麥，是不育胞質(zhì)最穩(wěn)定且應(yīng)用最廣的小麥類型。目前已報(bào)道的T 型恢復(fù)系中的Rf基因共有11 個(gè)，即Rf1-Rf11。近年來，關(guān)榮霞等［55］利用ISSR 和SSR 標(biāo)記篩選，將Rf6基因標(biāo)定在UBC-808 和UBC-848 之 間。李 志 寬 等［18］利 用196 對SSR 和ISSR 標(biāo) 記 將Rf1定 位 在6BS 的Xgwm193 和Xgwm1079 之 間；Rf4定 位 在1AS 的Xgwm7062 和Xgwm136 之間。Sinha 等［56］發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的恢復(fù)基因Rf8，其位于2DS 上的Xwmc503 與Xgwm296 之間。段陽［57］選取SSR 和EST-STS 標(biāo)記，將Rf3定位在1BS 的Xfba329 和BE425889 之間，遺傳距離為2.4 cM 和1.7 cM。些定位研究為相關(guān)Rf基因的克隆奠定基礎(chǔ)。

2.3.3 CMS-V 型及其他類型 除了上述兩種常用的不育類型外，研究較多的類型有CMS-V 型、CMSAL 型和CMS-BNS 型等。石運(yùn)慶等［19］在CMS-V 型恢復(fù)系濟(jì)南13 的1B 染色體上檢測到Rfv1基因，獲得了4 個(gè)連鎖的SSR 標(biāo)記，遺傳距離均小于9 cM。桂安勝［58］以CMS-AL 型材料為親本，利用BAS 法結(jié)合SSR 標(biāo)記將Rf基因定位在1B 染色體的Xgwm413 和Xbarc8 之間。孫慧慧等［59］利用SSR 標(biāo)記在CMS-BNS 型小麥恢復(fù)系中國春中發(fā)現(xiàn)位于1A染色體上的1 個(gè)主效Rf基因位點(diǎn)，但未定位到具體位置。

2.4 大豆（Glycine max）主要類型Rf基因的定位與克隆

大豆屬油糧兼用作物，雜種優(yōu)勢利用相比水稻、玉米起步較晚，Rf基因的定位研究也甚少。目前報(bào)道的大豆CMS 類型主要有CMS-RN、ZD、M 和N 型。近些年來大豆雜種優(yōu)勢利用逐漸成為熱點(diǎn)，其Rf基因的研究也逐漸深入?，F(xiàn)已檢測到的Rf基因出現(xiàn)在3，5，10，16，17 染色體上，均未被克隆。研究者采取的策略也趨向一致，都是通過BSA 法結(jié)合SSR標(biāo)記進(jìn)行Rf基因的定位，這為探索大豆育性恢復(fù)機(jī)理、進(jìn)一步精細(xì)定位和克隆，最終應(yīng)用于實(shí)踐生產(chǎn)提供參考。

2.4.1 CMS-RN 型 CMS-RN 型是典型的配子體不育類型，其育性恢復(fù)僅靠1 對顯性基因控制。趙麗梅等［20］首次利用SSR 標(biāo)記，將Rf基因定位于16 號染色體的Satt547 附近。Wang 等［21］進(jìn)一步將Rf基因縮小至Sctt_011 和Satt547 之間。之后，任良真［6］和王鵬年［60］均以RN 型材料為親本將Rf基因均定位在16 號染色體上，定位區(qū)間在500 kb 左右，其間有8 個(gè)PPR 家族基因。

2.4.2 CMS-M 型 CMS-M 型也是配子體不育類型。湯復(fù)躍等［5］利用BSA 結(jié)合SSR 標(biāo)記技術(shù)將Rf基因定位到5 號染色體上的Satt276 和Satt545 之間，2個(gè)標(biāo)記相距1.15 Mb。但在2016 年，Wang 等［23］利用同樣的親本對Rf基因進(jìn)行了精細(xì)定位，但其位于16 號染色體GmSSR1602 和GmSSR1610 之間的162.4 kb 的區(qū)段內(nèi)，并非5 號染色體，遺傳距離分別為0.11 cM 和0.25 cM。在此區(qū)域內(nèi)有19 個(gè)ORF，其含7 個(gè)PPR 家族基因。其結(jié)果與RN 型不育恢復(fù)基因的定位區(qū)間相近?？赡茉斐蛇@種結(jié)果的原因是分離群體過少或者遺傳背景出現(xiàn)了誤差等。

2.4.3 CMS-N 型及其他類型 CMS-N 型尚未應(yīng)用于生產(chǎn)，主要用于基礎(chǔ)研究，其Rf基因與前兩種類型都不同。陶銀［61］利用923 對SSR 標(biāo)記篩選，將Rf基因定位在Sat_084 和Sat_208 之間，兩標(biāo)記遺傳距離為2.9 cM，物理距離為11.5 Mb。董建生等［24］研究發(fā)現(xiàn)中豆5 號中含有2 對存在疊加效應(yīng)的Rf基因，通過SSR 標(biāo)記篩選獲得一個(gè)連鎖的標(biāo)記Satt135，其位于17 號染色體上。李曙光等［62］在10 號染色體上發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的Rf基因，并定位在Satt311 和Satt477 之間。

除此之外，近年來其他類型的Rf基因也被定位。例如，焦東燕［7］將可以恢復(fù)CMS-ZD 型不育系的Rf基因定位在BARCSOYSSR-16-1040 和satt547之間。之后Dong 等［22］通過BSA 結(jié)合SSR 標(biāo)記建立高密度連鎖遺傳圖譜縮小了ZD 型Rf基因的定位區(qū)間，連鎖的標(biāo)記為BARCSOYSSR-16-1064 和BARCSOYSSR-16-1082，遺傳距離分別為0.59 cM 和0.83 cM。連世超等［63］以山西材料為親本，在1 號染色體上發(fā)現(xiàn)Rf基因。但由于群體數(shù)量較少，遺傳背景復(fù)雜，其定位區(qū)間均較大。

2.5 油菜（Brassica napus）主要類型Rf基因的定位與克隆

油菜是重要的油料作物，其雜種優(yōu)勢也比較明顯?，F(xiàn)今以CMS-Pol 和CMS-Ogura 系統(tǒng)應(yīng)用最廣，前一種屬同源CMS，后一種屬異源CMS。目前在油菜中已獲得了與Rf基因連鎖的標(biāo)記，其中Rfo和Rfp已被克隆。

2.5.1 CMS-Pol 型 CMS-Pol 型油菜育性可被1 對主效Rf基因恢復(fù)，即Rfp。Liu 等［30］創(chuàng)建回交群體，經(jīng)SSR 和SCAR 標(biāo)記篩選，將Rfp基因精細(xì)定位在A9 染色體的Os36 和Brs06 之間，遺傳距離分別為0.1 cM 和0.02 cM，物理距離僅為29.2 kb。此區(qū)間存在7 個(gè)完整的ORF，其中ORF2 可以編碼PPR 蛋白，可能是Rfp基因。之后郭秀娟等［29］，羅莉斯等［64］利用BSA 法結(jié)合SSR 標(biāo)記分別獲得Rfp基因緊密連鎖的SSR 標(biāo)記，即Ol13-E08 和Os31，與Liu 等的定位區(qū)間相近。Liu 等［65］通過圖位克隆法克隆獲得一個(gè)編碼PPR 蛋白的基因，即Rfp基因，全長1953 bp，含有15 個(gè)PPR 重復(fù)單元，通過加工atp6-orf224基因的轉(zhuǎn)錄本，致使不育系育性恢復(fù)。

2.5.2 CMS-Ogur 型及其他類型 CMS-Ogura 型油菜的不育細(xì)胞質(zhì)來源于蘿卜，篩選其恢復(fù)系研究者進(jìn)行了大量的工作，但未篩選到理想的恢復(fù)系。最后，學(xué)者將CMS-Ogura 型蘿卜中的強(qiáng)恢復(fù)基因?qū)胗筒酥?，可以較強(qiáng)的恢復(fù)Ogura-CMS 型油菜的育性［66］。目前定位鑒定的CMS-Ogura 型油菜的育性恢復(fù)基因主要有3 個(gè)，即Rfo、Rfob和Rft。例如，Brown 等［31］利用RFLP 標(biāo)記將Rfo基因定位在R12 和L40 之間。最后克隆獲得該Rf基因g26，其大小為687 bp，含有16 個(gè)PPR 重復(fù)單元，可以降低不育基因ORF138產(chǎn)生的毒性蛋白，致使育性恢復(fù)。Uyttewaal 等［67］利用圖位克隆法獲得Rfo基因，其含有3 個(gè)PPR 基因座，其中PPR-B 基因座編碼的蛋白可以調(diào)控不育基因的轉(zhuǎn)錄本。

除此之外，其他類型的恢復(fù)基因定位也取得了很大的進(jìn)展。官春云等［33］以野油胞質(zhì)不育系為背景， 利 用1500 多 對SSR 引 物Rf基 因 定 位 于CB10316 和BnGMS171 之間。郝建軼等［68］基于Rf基因的特點(diǎn)克隆獲得了一段長309 bp 的序列，其編碼的蛋白含有2 個(gè)PPR 基序。Wei 等［34］利用SSR和SNP 標(biāo)記將恢復(fù)CMS-Hua 型不育系的Rfh基因定位在A3 染色體的A03TPRSNP3 和mrSSR52 之間，兩標(biāo)記間僅有94 kb。易聰聰［32］建立了CMS-Mor 型回交分離群體，利用3 種標(biāo)記獲得與Rfm基因共分離的標(biāo)記YSSR-127，遺傳距離為1.1 cM，此Rfm基因是一個(gè)配子體遺傳的顯性單基因。

2.6 棉花（Gossypium spp.）主要類型Rf基因的定位與克隆

棉花也是雜種優(yōu)勢利用研究熱點(diǎn)。早在1975 年棉花就已經(jīng)實(shí)現(xiàn)“三系”配套。但由于棉花的育性不穩(wěn)定、恢復(fù)系恢復(fù)能力弱等問題，導(dǎo)致雜交棉受到了限制，因此亟需篩選到恢復(fù)力強(qiáng)的Rf基因，應(yīng)用于強(qiáng)恢復(fù)系的選育。近年來，來源于哈克尼西棉的CMS-D2和來源于三裂棉的CMS-D8的研究居多。劉利彩等［25］以CMS-D2型棉花為親本，通過BSA結(jié)合SSCP 標(biāo)記獲得與Rf1基因連鎖標(biāo)記BNL3535和343501-1，其遺傳距離分別為2.9 cM 和3.2 cM，物理距離164 kb，含有9 個(gè)PPR 家族基因。Wu 等［26］在CMS-D2型恢復(fù)系ZBR 中獲得4 個(gè)與Rf1基因共分離的InDel 標(biāo)記。之后，尤春源等［69］篩選定位來源于不同國家恢復(fù)系，獲得了與Rf基因連鎖的SSR，STS 和RAPD 標(biāo)記，為進(jìn)一步克隆奠定分子基礎(chǔ)。此外，Wang 等［28］建立CMS-D8型回交群體，利用RAPD 標(biāo)記結(jié)合CAPS 標(biāo)記將Rf2基因定位于D5 染色體的UBC352-900 和UBC683-500 之間。楊路明［70］，李丹［71］通過圖位克隆法分別以不同的供試材料，成功克隆了Rf1基因，并對其PPR 家族進(jìn)行分析。結(jié)果表明，定位區(qū)間有4 個(gè)ORF 可以編碼PPR 蛋白且存在線粒體靶向信號，其中ORF3 為Rf1基因，CDS 長1779 bp，含有10 個(gè)PPR 重復(fù)基序。這對解決恢復(fù)系的恢復(fù)力弱，恢復(fù)源少等問題具有至關(guān)重要的指導(dǎo)意義。

3 CMS/Rf 系統(tǒng)在主要作物雜交育種上的應(yīng)用

雜交水稻由我國首創(chuàng)，是擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的農(nóng)作物之一。從簡單的“三系法”育種到超級稻問世，再到第三代雜交水稻的誕生，對解決世界糧食問題有著非凡的意義。水稻雜交制種最早利用的是袁隆平院士發(fā)現(xiàn)的WA 型CMS/Rf 系統(tǒng)，由其育成的品種汕優(yōu)63，主導(dǎo)雜交水稻市場長達(dá)24 年之久。特優(yōu)63、協(xié)優(yōu)46 和岡優(yōu)22 等品種在20 世紀(jì)90 年代也曾被大量推廣。這其中具有強(qiáng)恢復(fù)力和高配合力的優(yōu)良恢復(fù)系明恢63 的育成，對雜交水稻育種有重要意義。隨著兩系法水稻品種如兩優(yōu)培九的大面積推廣，三系法品種的市場占有率逐漸萎縮。

我國最早于20 世紀(jì)80 年代開展雜交大豆研究，1993 年育成世界上第一個(gè)真正的大豆細(xì)胞質(zhì)雄性不育系，即RN 型；1995 年，找到恢復(fù)系實(shí)現(xiàn)三系配套，同樣擁有自主知識產(chǎn)權(quán)［60］。目前，RN 型CMS/Rf 系統(tǒng)是創(chuàng)制大豆雜交種最多的類型，已有18 個(gè)品種審定，已在東北大豆主產(chǎn)區(qū)大面積推廣。其中雜交種吉育612 兩年區(qū)域試驗(yàn)平均較對照增產(chǎn)16%以上，且蛋白、脂肪合計(jì)達(dá)到了國家優(yōu)質(zhì)雙高大豆標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)量與品質(zhì)雙提升的飛躍［72］。吉育609、吉育635 和吉育639 也同樣實(shí)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)與高產(chǎn)結(jié)合，其脂肪含量均達(dá)22%以上。其他細(xì)胞質(zhì)類型的雜交品種也相繼被審定，如利用M 型CMS/Rf 系統(tǒng)創(chuàng)制的雜優(yōu)豆系列，ZD 型CMS/Rf 系統(tǒng)創(chuàng)制的阜雜交豆系列，但這些品種繁殖系數(shù)較低，尚未像吉育系列品種在生產(chǎn)上大規(guī)模應(yīng)用。

雜交油菜主要種植在我國西北和西南地區(qū)，1972 年，傅廷棟院士首次發(fā)現(xiàn)甘藍(lán)型油菜中的CMSPol 型不育系，被認(rèn)為是世界上第一個(gè)實(shí)際應(yīng)用的油菜細(xì)胞質(zhì)。從1985 年世界上第一個(gè)油菜雜交種秦油二號育成起，開創(chuàng)了雜交油菜產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用時(shí)代［73］。目前，以Pol 型CMS/Rf 系統(tǒng)選育的品種，如華雜系列在生產(chǎn)上推廣面積最大。如華雜2 號于1992 年通過湖北省品種審定委員會(huì)審定，是我國第一個(gè)低芥酸油菜雜交種；最新審定的華油雜62R 作為我國首批具有應(yīng)用價(jià)值的抗根腫病油菜雜交種也通過專家鑒定，在生產(chǎn)上開始推廣應(yīng)用。除此之外，中油雜系列、秦油系列品種、隴油系列品種也是應(yīng)用較廣的油菜雜交種。

小麥細(xì)胞質(zhì)雄性不育最早在1951 年由日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)，開啟了雜交小麥研究元年。我國學(xué)者利用CMS/Rf 系統(tǒng)也育成了一些雜交小麥品種，如利用K型CMS/Rf 系統(tǒng)選育成功的901，利用T 型CMS/Rf系統(tǒng)育成的T 師優(yōu)1 號等。但在雜交小麥品種選育中也發(fā)現(xiàn)，T 型雜交小麥很難選出強(qiáng)優(yōu)勢組合，且存在易倒伏的問題，而K 型和V 型選育的雜交種中，常常伴隨單倍體植株，這些都制約了三系雜交小麥的發(fā)展。隨著光、溫敏核不育系的發(fā)現(xiàn)，其克服了細(xì)胞質(zhì)雄性不育的缺點(diǎn)，逐漸在生產(chǎn)上被大規(guī)模應(yīng)用。

我國作為主要的棉花產(chǎn)區(qū)，雜交棉花近些年發(fā)展也比較迅猛，大量雜交品種育成。利用CMS/Rf 系統(tǒng)育成的一些代表性品種如豫棉雜1 號、邯雜301 等，也在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用，尤其在我國最大的雜交棉花種植區(qū)長江流域。但雜交棉花的推廣也存在一些技術(shù)問題，如雜交制種主要還是以人工去雄授粉為主，耗費(fèi)大量人力、財(cái)力，這極大地限制了棉花雜交種的生產(chǎn)。

除上述作物外，雜交玉米作為種子雜交化最高的作物，因其屬異花授粉屬性，父母本間雜交非常容易，利用具有優(yōu)良性狀的自交系間進(jìn)行雜交育種，獲得的雜交種性狀整齊、抗性更強(qiáng)及穩(wěn)定性更好。因此基本不采用CMS/Rf 系統(tǒng)進(jìn)行品種選育，尤其是玉米的CMS/Rf 系統(tǒng)還存在育性不穩(wěn)定、易受環(huán)境影響、對應(yīng)的恢復(fù)系資源稀少及恢復(fù)能力弱等問題。

4 總結(jié)與展望

細(xì)胞質(zhì)雄性不育是利用雜種優(yōu)勢改變其產(chǎn)量的主要方法之一，其中選育穩(wěn)定不育系和強(qiáng)恢復(fù)系是利用雜優(yōu)關(guān)鍵步驟。目前對于不育系相關(guān)分子基礎(chǔ)研究已有很大突破，但恢復(fù)系中恢復(fù)基因的研究相對滯后。相比常規(guī)方法選育強(qiáng)恢復(fù)系，利用與恢復(fù)基因緊密連鎖標(biāo)記對早期世代進(jìn)行篩選，不僅可以縮短選育周期、減少工作量，同時(shí)可以鑒定恢復(fù)系和保持系。對于育性恢復(fù)基因的定位，研究者基本均是利用常用的SSR、RAPD、ISSR、InDels 及SNPs等分子標(biāo)記結(jié)合高通量測序技術(shù)，將不同材料上的Rf基因鎖定到染色體的特定區(qū)間，進(jìn)一步篩選基因和功能驗(yàn)證。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)、基因組學(xué)和測序技術(shù)的進(jìn)步，恢復(fù)基因的定位和克隆已經(jīng)取得了顯著進(jìn)展，部分恢復(fù)基因的作用機(jī)理也已明晰。目前已經(jīng)有超過12 個(gè)恢復(fù)基因被克隆，其中除水稻Rf2基因、Rf17基因和玉米Rf4基因外恢復(fù)基因均屬PPR 家族基因，其編碼的PPR 蛋白是一個(gè)簡并串聯(lián)的蛋白，且沒有核酸內(nèi)切酶活性，常常形成復(fù)合物剪接、編輯轉(zhuǎn)錄本或者改變翻譯產(chǎn)物的積累量致使育性恢復(fù)。但對于大多數(shù)CMS 系統(tǒng)中不育基因和恢復(fù)基因相互作用，以及線粒體信號傳導(dǎo)尚未被鑒定，與Rf基因連鎖的標(biāo)記距離也較遠(yuǎn)。結(jié)合高通量測序技術(shù)不僅可以加速在作物CMS 系統(tǒng)中開發(fā)新的標(biāo)記和精細(xì)定位Rf基因，而且可以挖掘與Rf基因的生物信息通路，對進(jìn)一步研究作物雜種優(yōu)勢分子調(diào)控機(jī)制提供信息和新的見解，進(jìn)而創(chuàng)制新的恢復(fù)系來源，可豐富恢復(fù)系的遺傳基礎(chǔ)，促進(jìn)分子遺傳學(xué)和雜交選育的發(fā)展。利用基因編輯技術(shù)可以將優(yōu)良的保持系轉(zhuǎn)化為環(huán)境敏感型不育系，實(shí)現(xiàn)“兩系”種，進(jìn)而促進(jìn)恢復(fù)系的選育。