李闖 文正 劉暢 鄔敏辰

（1. 江南大學(xué)生物工程學(xué)院，無錫 214122；2. 江南大學(xué)無錫醫(yī)學(xué)院，無錫 214122）

光學(xué)純環(huán)氧化物和鄰位二醇具有較高的附加值，是合成一些農(nóng)藥、醫(yī)藥以及材料等精細化學(xué)品的重要手性砌塊［1］。例如，（S）-環(huán)氧苯乙烷可以用來合成殺線蟲劑［2］，而（R）-苯乙二醇是液晶材料制造過程中重要的手性添加劑［3］。利用（R）-對氯環(huán)氧苯乙烷制備的一種神經(jīng)保護劑（R）-依利羅地，較其S型對映體具有更強的療效［4］。本研究中所涉及到的（R）-間硝基苯乙二醇（m-nitrophenyl-1，2-ethanediol，mNPED）則是α-羥基酸以及具有阿爾茨海默病療效的β-分泌酶抑制劑的重要合成子［5-6］。

通過Jacobsen 環(huán)氧化及Sharpless 不對稱雙羥基化等傳統(tǒng)化學(xué)合成法制備的手性環(huán)氧化物和鄰位二醇，有時存在產(chǎn)物光學(xué)純度和產(chǎn)率低的問題［7］。此外，在反應(yīng)過程中通常需要使用有毒的高價重金屬催化劑，給環(huán)境帶來了嚴重的威脅［8］。近年來，生物制備法作為一種低成本且環(huán)境友好的補充或替代方案而備受關(guān)注［9］，其符合國內(nèi)外社會所倡導(dǎo)的“綠色工業(yè)”和“可持續(xù)發(fā)展”，以及國家“十三五”規(guī)劃中關(guān)于“加快改善生態(tài)環(huán)境”的相關(guān)內(nèi)容。

環(huán)氧水解酶（Epoxide hydrolase，EH）廣泛存在于微生物與動、植物體內(nèi)，能夠立體選擇性的催化廉價的外消旋（racemic，rac-）環(huán)氧化物發(fā)生開環(huán)水解，保留單一構(gòu)型的環(huán)氧化物和/或生成鄰位二醇［10］。但是，不同EH 與環(huán)氧化物的反應(yīng)組合往往表現(xiàn)出不同的立體選擇性。根據(jù)這種差異性，可以將EH 催化的不對稱反應(yīng)劃分為動力學(xué)拆分和對映歸一性水解兩大類［11］，前者的理論產(chǎn)率僅有50%，而后者可達100%［12］。目前，基于EH 的歸一性水解反應(yīng)來制備手性鄰位二醇的途徑主要有：雙酶協(xié)同催化法［13-14］、酶與化學(xué)酸串聯(lián)催化法［15-16］及單酶催化法［17-18］。其中，僅利用單酶實現(xiàn)外消旋環(huán)氧化物的歸一性轉(zhuǎn)化被認為是一種理想的催化方法［19］。然而，這要求EH 針對于目標環(huán)氧化物S與R兩種對映體同時表現(xiàn)出高且互補的區(qū)域選擇性，即區(qū)域選擇性系數(shù)αS和βR均接近于100%［20］。因此，同拆分反應(yīng)相比，歸一性水解相關(guān)的報道則相對較少［21］。

本研究將菜豆來源的EH 基因pveh2 插入至冷休克表達載體，在大腸桿菌中實現(xiàn)酶的胞內(nèi)表達。隨后，以rac-間硝基環(huán)氧苯乙烷（m-nitrostyrene oxide，mNSO）為底物，利用工程菌E. coli/pveh2 全細胞測定其EH 活性和區(qū)域選擇性。將水溶性有機試劑作為底物助溶劑，并依據(jù)助溶劑的種類與劑量對全細胞EH 活性的影響，篩選出最適的緩沖液/助溶劑反應(yīng)體系，顯著提高了歸一性水解中底物rac-mNSO 的最高反應(yīng)濃度。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)基E. coliJM109、Rosetta（DE3）以及含有重組質(zhì)粒pET28a-pveh2 的工程菌E.coli/pET28a-pveh2 由實驗室保藏；克隆質(zhì)粒pUCm-T購自上海生工公司；表達質(zhì)粒pCold II 購于TaKaRa公司；Luria-Bertani（LB）液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，氯化鈉10 g/L 和酵母提取物5 g/L，pH 7.0。

1.1.2 試劑盒與工具酶 柱式質(zhì)粒提取試劑盒和DNA 膠回收試劑盒均為康為世紀產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶NcoI、NdeI 和SalI，T4DNA 連接酶以及ExTaqDNA 聚合酶均購自于TaKaRa 公司。

1.2 方法

1.2.1 基因擴增 以pET28a-pveh2 作為PCR 模板，pveh2-F（5′-CATATGGAATACATAGTACACAG AAC-3′，下劃線為NdeI 的酶切位點）和pveh2-R（5′-GTCGACTCAGAACTTGTTGATAAAATC-3′，下劃線為SalI 的酶切位點）為上下游引物進行擴增反應(yīng)：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸60 s，30 個循環(huán)；72℃充分延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳純化后切膠回收目的基因pveh2，17℃與pUCm-T 連接10 h，利用熱激法轉(zhuǎn)化E. coliJM109感受態(tài)細胞，最后經(jīng)藍白斑篩選、NcoI 單酶切驗證和DNA 測序，將結(jié)果正確的重組質(zhì)粒命名為pUCm-T-pveh2。

1.2.2 基因表達 使用NdeI 和SalI 分別處理pUCm-T-pveh2 和pCold II，并混勻酶切產(chǎn)物進行連接反應(yīng)，用連接液轉(zhuǎn)化E. coliRosetta（DE3）感受態(tài)細胞，經(jīng)過氨芐青霉素抗性平板篩選與DNA 測序，獲得重組工程菌E. coliRosetta（DE3）/pCold IIpveh2，即E. coli/pveh2。將E. coli/pveh2 的單菌落接種于含有0.1 mg/mL 氨芐青霉素的LB 培養(yǎng)基中，于37℃、220 r/min 培養(yǎng)10 h，之后按2%（V/V）的接種量轉(zhuǎn)接至新鮮LB培養(yǎng)基內(nèi)，同樣于37℃振蕩培養(yǎng)，并在OD600達到0.8-1.0 時加入異丙基-β-D-硫代半乳 糖 苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）至其終濃度為0.2 mmol/L，在15℃下誘導(dǎo)24 h 后低溫離心收集菌體。濕菌體再經(jīng)真空冷凍干燥處理，獲得的干細胞粉塊用于后續(xù)的生物催化實驗和十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析。

1.2.3 細胞EH 活性的測定 用適量的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液（50 mmol/L，pH7.0）重新懸浮干細胞，配制成均勻的細胞懸浮液，從中量取500 μL 置于25℃下預(yù)熱5 min。然后加入rac-mNSO（終濃度為5 mmol/L）開始反應(yīng)，10 min 后向體系中加入1.0 mL 乙酸乙酯（含有約8 mmol/L 正己醇作為內(nèi)標物質(zhì)）進行萃取。上層有機相經(jīng)無水硫酸鎂脫水后，借助搭載有Chiralcel?OD-H 手性色譜柱（4.6 mm Φ×250 mm L）與Waters 2489 紫外檢測器的e2695 高效液相色譜（High performance liquid chromatography，HPLC）系統(tǒng)進行檢測和分析。檢測條件：流動相為正己烷∶異丙醇 = 9∶1（V/V），流速0.8 mL/min，柱溫30℃，檢測波長254 nm。HPLC 用于檢測樣品中底物rac-mNSO、水解產(chǎn)物（R）-與（S）-mNPED的含量，保留時間分別為9.65、16.24 和18.46 min左右。細胞的EH 活性則定義為每分鐘催化水解1.0 μmolrac-mNSO 所需要的細胞量。

1.2.4 區(qū)域選擇性系數(shù)的測定 向2.0 mL 適當稀釋的細胞懸浮液中加入rac-mNSO 至其終濃度達到5 mmol/L，于25℃下振蕩反應(yīng)2 h，期間從反應(yīng)混合物中定時取樣100 μL，然后按照1.2.3 所述方法處理樣品。樣品的分析采用氣相色譜（Gas chromatography，GC）儀2010 Plus（日本島津），配備有手性毛細色譜柱CP-ChiralSil-DEX CB（安捷倫）。檢測條件：檢測器和氣化室溫度250℃，載氣為氮氣，吹掃流量為3 mL/min，分流比為1∶40。檢測期間柱溫由100℃以5℃/min 的速率上升至190℃。GC 用于檢測底物rac-mNSO 中R與S兩種構(gòu)型的含量，其保留時間分別為14.01 和15.05 min 左右。最后，各構(gòu)型產(chǎn)物的含量由HPLC 檢測。

用來表征底物和產(chǎn)物光學(xué)純度的對映體過剩率（enantiomer excess，ee）分別為：ees=［（R-S）/（R+S）］×100% ；eep=［（Rd-Sd）/（Rd+Sd）］×100%。其中，R、S、Rd和Sd分別代表（R）-、（S）-mNSO 和（R）-、（S）-mNPED 的濃度。根據(jù)公式eep= αS+βR-1+［（βR-αS）×ees×（1-c）］·c-1， 以ees×（1-c）］·c-1為橫坐標，eep為縱坐標通過線性回歸法推導(dǎo)出區(qū)域選擇性系數(shù)αS與βR值［18］，c代表底物rac-mNSO 的轉(zhuǎn)化率，為被水解消耗的racmNSO 與初始量的百分比。

1.2.5 緩沖液體系中的歸一性水解反應(yīng) 向4 組含有40 mg/mLE. coli/pveh2 干細胞的20 mL 磷酸鹽緩沖液中分別加入不同終濃度（5、10、15 和20 mmol/L）的rac-mNSO，于25℃反應(yīng)12 h，期間定時取樣，按照1.2.3 所述處理樣品，進行HPLC 檢測，計算不同時間點rac-mNSO 的c值。

1.2.6 助溶劑種類與劑量的篩選 選取5 種常見的水溶性有機試劑作為底物助溶劑：甲醇、二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）、二甲基甲酰胺（N，N-dimethylformamide，DMF）、異丙醇和丙三醇。利用磷酸鹽緩沖液分別配制含有2%、5%和8%（V/V）上述助溶劑的細胞懸浮液。按照1.2.3 所述方法測量細胞的EH 活性，對照組不添加任何助溶劑。

1.2.7 緩沖液/助溶劑體系中的歸一性水解反應(yīng) 在確定最適助溶劑與劑量后，構(gòu)建4 組含有40 mg/mL 干細胞的20 mL 緩沖液/助溶劑體系，將底物rac-mNSO 的濃度分別提高至20、30、40 和50 mmol/L，于25℃反應(yīng)12 h，按照1.2.3 所述處理樣品，進行HPLC 分析。產(chǎn)物（R）-mNPED 的產(chǎn)率 = 反應(yīng)終止時產(chǎn)物濃度/底物初始濃度×100%。

2 結(jié)果

2.1 PvEH2基因的生物信息學(xué)分析

根據(jù)pveh2 的測序結(jié)果，在GenBank 數(shù)據(jù)庫中查找到編碼PvEH2 的基因組DNA 序列（圖1），其位于菜豆（品種G19833）第6 號染色體上，包含兩段長度分別為465 bp 和239 bp 的內(nèi)含子以及951 bp的開放閱讀框，共編碼316 個氨基酸。利用BDGP啟動子在線分析工具Promoter 預(yù)測的轉(zhuǎn)錄起始位點是位于起始密碼子ATG 中腺嘌呤上游143 bp 處的鳥嘌呤。使用程序PlantCARE 預(yù)測在轉(zhuǎn)錄起始位點-30 和-135 處分別存在真核生物典型的TATA-box（TATAAAT）和CAAT-box（CAATTA）序列。此外，PvEH2 基因的啟動子中還存在與誘導(dǎo)作用相關(guān)的元件ARE、GCN4 和circadian，在-617 位存在增強子（TA-rich region），以及sp1、GT1 和GAG 等多個光感應(yīng)調(diào)控元件。以上預(yù)測結(jié)果表明該基因的轉(zhuǎn)錄水平可能受植物體外環(huán)境脅迫及光信號誘導(dǎo)的影響。

圖1 PvEH2 基因組DNA 序列和氨基酸序列

2.2 全細胞EH活性與SDS-PAGE檢測結(jié)果

以rac-mNSO 為底物測得E. coli/pveh2 的EH 活性 為15.4 U/g干細胞， 較E. coli/pET28a-pveh2 的8.1 U/g干細胞有了較為顯著的提高，而經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)后的E. coli/pCold II（含有pCold II 空質(zhì)粒的E. coli轉(zhuǎn)化子）未檢測出EH 活性。SDS-PAGE 結(jié)果（圖2）顯示，相較于E. coli/pCold II，E. coli/pET28a-pveh2 與E. coli/pveh2 均在約38.1 kD 處存在明顯的特異蛋白條帶，與預(yù)測的重組PvEH2 的理論值37898 Da 基本一致。此外，E. coli/pveh2 產(chǎn)酶活性的升高可能與PvEH2 表達量的提高有關(guān)（泳道2 和3）。

圖2 重組E. coli 轉(zhuǎn)化子的SDS-PAGE 分析

2.3 E. coli/pveh2針對rac-mNSO的對映歸一性水解

2.3.1E. coli/pveh2 的區(qū)域選擇性 由線性回歸分析推導(dǎo)出水解反應(yīng)的區(qū)域選擇性系數(shù)αS和βR分別為90.3% 和96.4%，即PvEH2 以90.3% 的 概 率 進攻（S）-mNSO 含氧三元環(huán)上的α 碳原子，使構(gòu)型在反應(yīng)前后發(fā)生翻轉(zhuǎn)，生成（R）-mNPED。相反地，針對（R）-mNSO 的情況，PvEH2 則以96.4%的概率進攻β 碳原子，使構(gòu)型得以保持，同樣生成（R）-mNPED（圖3）。說明E. coli/pveh2 或PvEH2 擁有歸一性水解rac-mNSO 的優(yōu)良特性。

圖3 E. coli/pveh2 針對于（R）-和（S）-mNSO 的區(qū)域選擇性

2.3.2 緩沖液體系中底物濃度對轉(zhuǎn)化率的影響 不同rac-mNSO 濃度下的轉(zhuǎn)化率c隨反應(yīng)進程的變化趨勢見圖4。當反應(yīng)進行到6 h 時，10 mmol/L 的racmNSO 幾乎完全水解，即c值在95.0%以上，生成82.4%eep的（R）-mNPED。然而，當?shù)孜餄舛壤^續(xù)提高至15 和20 mmol/L 時，即使反應(yīng)延長至12 h，rac-mNSO 也不能被完全地轉(zhuǎn)化。因此，需要篩選合適的水解體系。

圖4 緩沖液體系中不同濃度底物轉(zhuǎn)化率隨時間的變化

2.3.3 底物助溶劑對全細胞EH 活性的影響 測定E. coli/pveh2 在不同緩沖液/助溶劑體系中的EH 活性，以對照組的相對活性作為100%，結(jié)果如圖5 所示?？傮w上，按照E. coli/pveh2 的EH 活性由高到低依次為含有丙三醇、異丙醇、DMSO、DMF 和甲醇的緩沖液。其中，5%和8%（V/V）的丙三醇均使E.coli/pveh2的EH活性較對照組略微提高8.2%和8.9%。綜合考慮后選擇含有5%（V/V）丙三醇的緩沖液作為反應(yīng)體系。

圖5 底物助溶劑對E. coli/pveh2 全細胞EH 活性的影響

2.3.4 緩沖液/丙三醇體系中的歸一性水解 基于上述篩選的結(jié)果，構(gòu)建含有5%（V/V）丙三醇的緩沖液反應(yīng)體系，并研究了20-50 mmol/Lrac-mNSO 的水解情況（表1）。當反應(yīng)進行到12 h 時，40 mmol/L及以下濃度底物的c值超過95.0%，且（R）-mNPED的產(chǎn)率均超過90.0%。但是，當rac-mNSO 繼續(xù)提升至50 mmol/L 時，高細胞濃度（40 mg干細胞/mL 約相當于250 mg濕細胞/mL）的E. coli/pveh2 無法有效將其水解。因此，在緩沖液/丙三醇體系內(nèi)，最高底物濃度由原先單緩沖液體系的10 mmol/L 提高至40 mmol/L。另外，底物在歸一性水解反應(yīng)進程中的代表性HPLC 色譜圖如圖6 所示。

表1 緩沖液/丙三醇體系中各濃度底物在12 h 時的水解結(jié)果

圖6 底物rac-mNSO（40 mmol/L）的c 值分別達到0%（a），45.0%（b）和95.2%（c）時的HPLC 譜圖

3 討論

絕大多數(shù)植物來源的EH 屬于α/β 折疊型水解酶超家族［22］，盡管在氨基酸組成和三維結(jié)構(gòu)等方面存在一定的相似性，但是這些植物EH 的底物譜各具特色，其中也不乏擁有良好立體選擇性的野生型酶與環(huán)氧化物底物的反應(yīng)組合。例如，赤豆EH 與苯基縮水甘油醚［8］、綠豆EH 與對硝基環(huán)氧苯乙烷［17］以及馬鈴薯EH 與環(huán)氧苯乙烷［23］等。

大多數(shù)已報道的組合是關(guān)于環(huán)氧化物的拆分反應(yīng)，而借助于單酶實現(xiàn)特定環(huán)氧化物歸一性水解的案例則相對較少［21］。就rac-mNSO 而言，利用經(jīng)過突變改造后的菜豆PvEH1 進行10 mmol/L 底物的反應(yīng)，也僅使（R）-mNPED 的eep從14.7%提升至52.3%［12］。使用同樣是菜豆來源的野生型PvEH2 作為催化劑，所得二醇的eep可超過80.0%，這主要歸因于該酶針對S和R型底物高且互補的區(qū)域選擇性（αS=90.3%，βR=96.4%），均好于PvEH3（αS=64.4%，βR=71.5%）［20］、mbEHA（αS=82.0%，βR=93.0%）［24］和VrEH3（αS=74.2%，βR=89.0%）［25］。 迄 今 為止，也僅有很少的借助于生物法制備（R）-mNPED的 報 道。Jin 等［26］利用100 mg/mL 表達有EH 的Aspergillus niger濕細胞水解12.1 mmol/Lrac-mNSO，但是（R）-mNPED 的產(chǎn)率和eep僅有48%和66%。本研究采用全細胞代替其破碎液或純酶作為催化劑，主要是由于前者容易獲得且一般情況下比后者穩(wěn)定［27-28］。目前已有很多使用表達有EH 的全細胞來轉(zhuǎn)化環(huán)氧化物的報道［13，25，29］。此外，由實驗中的對照組可知，宿主E.coli/Rosetta（DE3）中未檢測到rac-mNSO 的水解活性，結(jié)果與先前報道相一致［30-31］。

由EH 介導(dǎo)的不對稱水解被認為是一種頗具研究與應(yīng)用價值的生物催化途徑，但是目前能夠?qū)崿F(xiàn)大規(guī)模催化的反應(yīng)卻很少［32］，其主要問題在于環(huán)氧化物底物在水中的溶解度低以及底物、產(chǎn)物對EH的抑制作用等［33-35］。為了克服上述瓶頸，一些有機試劑被添加到水相反應(yīng)體系內(nèi)，作為底物的助溶劑。憎水性的有機試劑與水相形成雙相體系［36-37］，而一定量的親水性有機試劑則與水互溶保持為單相體系［38-39］。在雙相體系內(nèi)，有機試劑分子和相界面的毒性容易使酶失活［40］。向反應(yīng)體系中加入適量的親水性有機試劑是一種較為溫和而有效的策略。本研究基于E. coli/pveh2 的催化活性，從預(yù)先構(gòu)建好的15 種含有不同種類和劑量親水性有機試劑的緩沖液中，篩選到最適的反應(yīng)體系為緩沖液/5%（V/V）丙三醇。這可能是由于體系內(nèi)的丙三醇一方面起到了助溶底物的作用；另一方面增加了酶的穩(wěn)定性。在相同的反應(yīng)條件下，將rac-mNSO 的最高反應(yīng)濃度較原先的緩沖液體系提高了3 倍。

4 結(jié)論

PvEH2 的基因來源于菜豆中，其轉(zhuǎn)錄水平可能與植物體外環(huán)境條件的誘導(dǎo)有關(guān)。SDS-PAGE 與全細胞EH 的測定結(jié)果表明，冷休克表達體系能夠提高PvEH2 在E. coli中的表達量，進而提高了重組工程菌的EH 活性。區(qū)域選擇性分析顯示，E.coli/pveh2 或PvEH2 針對于R和S兩種構(gòu)型的底物同時表現(xiàn)出高且互補的區(qū)域選擇性，結(jié)合底物的水解結(jié)果，證實了E. coli/pveh2 具有很好的對映歸一性水解rac-mNSO 的能力。針對磷酸緩沖液中底物濃度低的問題，本研究構(gòu)建并優(yōu)化了一種緩沖液/有機助溶劑體系，顯著的提高了底物的最高反應(yīng)濃度。