許趁心，蔡子哲,3，杜木香，劉 雪，汪 勇,3，王 瑛,3

(1.暨南大學(xué) 食品科學(xué)與工程系，廣州 510632； 2.廣東省糧油副產(chǎn)物生物煉制工程技術(shù)研究中心，廣州 510632； 3.暨南大學(xué)-薩斯喀徹溫大學(xué)“油料生物煉制與營養(yǎng)”聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，廣州 510632)

亞麻(LinumusitatissimumL.)是我國八大油料作物之一[1]，亞麻籽總產(chǎn)量約為47.47萬t，僅次于加拿大(年產(chǎn)93萬t)，位居世界第二。亞麻籽含有油脂(40%～45%)、蛋白質(zhì)(20%～25%)、亞麻籽膠(8%～14%)、亞麻木酚素(1%～5%)、膳食纖維(23%～29%)、多糖、維生素A、維生素E等營養(yǎng)物質(zhì)外，還富含特有營養(yǎng)成分——亞麻籽環(huán)肽[2]。

亞麻籽環(huán)肽是亞麻籽及亞麻籽油中的特色脂質(zhì)伴隨物，目前尚未在其他高等植物中發(fā)現(xiàn)[3]?，F(xiàn)階段發(fā)現(xiàn)的亞麻籽環(huán)肽主要有環(huán)肽A、C、D、E、F、G[4-5]，亞麻籽和亞麻籽油中環(huán)肽的總含量分別約為0.1%[2]和0.5～2.0 mg/g[6]，其潛在產(chǎn)量約為100 t，具有較大的應(yīng)用前景。環(huán)肽由8～9個氨基酸殘基組成，氨基酸首尾連接呈環(huán)狀，相對分子質(zhì)量為1 kDa左右，不存在游離氨基，相比線性肽具有一定的穩(wěn)定性[7-8]。環(huán)肽的疏水性質(zhì)使其在細(xì)胞膜之間的運(yùn)輸、組織和器官之間的分散起到重要的作用[9]。據(jù)研究報(bào)道亞麻籽環(huán)肽具有免疫調(diào)節(jié)，促進(jìn)神經(jīng)、淋巴增殖等功效[10-11]。目前，對亞麻籽環(huán)肽的研究報(bào)道主要集中在亞麻籽環(huán)肽的活性研究和潛在的藥用價值開發(fā)，而對亞麻籽環(huán)肽的快速、高效檢測研究較少，且現(xiàn)有研究成果存在以下問題：①分析時間長，分析效率較低(一般為30 min，最長可達(dá)60 min)；②柱效差，在色譜柱的選擇上，主要為C18反相色譜柱，沒有針對亞麻籽單個環(huán)肽峰進(jìn)行優(yōu)化，導(dǎo)致無法對樣品中環(huán)肽組分進(jìn)行定量；③流速和進(jìn)樣量作為HPLC參數(shù)，其變化亦是影響分離度的重要因素，然而目前關(guān)于上述參數(shù)對環(huán)肽分析的影響，尚未見系統(tǒng)性研究。

本研究以含有14種亞麻籽環(huán)肽混合標(biāo)樣為樣品，從液相色譜柱選擇、進(jìn)樣量、初始洗脫體積分?jǐn)?shù)和流速等參數(shù)，對亞麻籽環(huán)肽的HPLC分析條件進(jìn)行優(yōu)化，將優(yōu)化后的方法應(yīng)用于亞麻籽、商品亞麻籽油及亞麻籽粕中環(huán)肽組成的分析，以期實(shí)現(xiàn)對亞麻籽環(huán)肽的快速、高效分析。該方法系統(tǒng)的建立，可進(jìn)一步為亞麻籽產(chǎn)品在不同品種環(huán)肽組成指紋圖譜、環(huán)肽種類分離鑒定、亞麻籽油氧化程度評價等研究領(lǐng)域，提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

14種亞麻籽環(huán)肽混合標(biāo)樣(淡黃色粉末)，加拿大Prairie Tide化學(xué)品公司；亞麻籽、亞麻籽粕產(chǎn)自山西朔州，無霉變，呈自然風(fēng)干狀態(tài)，封口袋包裝置于4℃低溫條件下貯藏備用，山西中大科技有限公司右玉分公司；商品亞麻籽油，陜西碌碌農(nóng)夫有限公司；乙腈、甲醇，色譜純，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；超純水，實(shí)驗(yàn)室自制；無水乙醇，廣東光華科技股份有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Waters Alliance Separations Module 2695高效液相色譜儀、Waters 2998PDA二極管陣列檢測器，美國Waters公司；Kinetex? Phenyl-Hexyl LC色譜柱(150 mm×4.6 mm，2.6 μm)，飛諾美Phenomenex上海譜譽(yù)科貿(mào)有限公司；Diamonsil C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，北京迪科馬科技術(shù)有限公司；UFLC(30AD)-MS(8045)三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀,島津公司；冷凝旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；GZX-9240MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器；HC-2518高速離心機(jī)；ME104/02電子分析天平；SK8200LHC超聲波清洗器；XW-80A微型旋渦混合儀。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 HPLC-ESI-MS定性分析亞麻籽環(huán)肽組成

色譜條件：Kinetex? Phenyl-Hexyl LC色譜柱(150 mm×4.6 mm，2.6 μm)，進(jìn)樣量1 μL，流速0.4 mL/min，流動相A、B分別為乙腈和水，梯度洗脫程序見表1。

質(zhì)譜條件：ESI離子源，正離子模式Q3掃描，霧化氣流量3.0 L/min，干燥器流量10.0 L/min，加熱氣流量10.0 L/min，接口溫度300℃，脫溶劑溫度250℃，加熱塊溫度400℃，掃描范圍400～1 600。

表1 梯度洗脫程序

1.2.2 HPLC定量分析亞麻籽環(huán)肽的組成與相對含量

(1)

(2)

(3)

式中：t1為第一個環(huán)肽峰的保留時間；t2為第二個環(huán)肽峰的保留時間；w1為第一個環(huán)肽峰的峰寬；w2為第二個環(huán)肽峰的峰寬；n為環(huán)肽個數(shù)；T為最后一個峰結(jié)束后的總分析時間。

理論上，當(dāng)R大于等于1.5時，認(rèn)為相鄰的兩個峰被分開了[12]。研究重點(diǎn)考察在特定高效液相色譜條件下的分析效率(η)。η越大，則表明分析效率越高。

1.2.3 樣品前處理

1.2.3.1 亞麻籽中環(huán)肽的提取

將亞麻籽過篩，去除雜質(zhì)和塵土后，粉碎至約60目，于55℃烘干6 h。按照Gui等[6]的方法提取亞麻籽油。稱取25 g亞麻籽粉，以正己烷為試劑索氏抽提5 h后，將提取的亞麻籽油濃縮至恒重。稱量2 g亞麻籽油，加入2 mL正己烷，混勻后加入4 mL 60%甲醇水溶液渦旋5 min，離心[4]，分離下層澄清溶液。在上層液體中，重復(fù)加入4 mL 60%甲醇水溶液進(jìn)行二次渦旋提取，將兩次提取獲得的下層濾液合并、過濾、濃縮后，用乙腈溶解、定容至5 mL。使用0.45 μL濾膜過濾后注入1.5 mL Waters進(jìn)樣瓶備用。

1.2.3.2 商品亞麻籽油中環(huán)肽的提取

商品亞麻籽油環(huán)肽的提取，參照1.2.3.1中對亞麻籽油處理的方法進(jìn)行操作。

1.2.3.3 亞麻籽粕中環(huán)肽的提取

參照連瑩君等[13]的方法并作一定修改。10 g亞麻籽粕與140 mL 95%乙醇加入圓底燒瓶中，在70℃條件下回流萃取1 h后冷卻至室溫，抽濾，將提取液濃縮后取上層澄清油樣參照1.2.3.1中對亞麻籽油處理的方法進(jìn)行操作。

2 結(jié)果與討論

2.1 HPLC-ESI-MS定性分析亞麻籽環(huán)肽(見圖1)

圖1 亞麻籽環(huán)肽混合標(biāo)品的HPLC-ESI-MS譜圖

由圖1可以看出，較低流速(0.4 mL/min)洗脫時，可以實(shí)現(xiàn)所有環(huán)肽色譜峰的完全分離，基于Kinetex?色譜柱可以實(shí)現(xiàn)環(huán)肽F、G的同分異構(gòu)體(α、β-構(gòu)型異構(gòu)體)分離。結(jié)合Shim等[5]報(bào)道的環(huán)肽出峰順序及相對分子質(zhì)量信息，確定環(huán)肽在該色譜柱中的洗脫順序。從亞麻籽環(huán)肽的出峰順序可以看出，氧化反應(yīng)增加了亞麻籽環(huán)肽的極性[14]，使含一個或兩個蛋氨酸亞砜或蛋氨酸砜的氧化態(tài)亞麻籽環(huán)肽先于其還原態(tài)被洗脫(如環(huán)肽F先于N)。這表明環(huán)肽分子基團(tuán)的氧化改變了亞麻籽環(huán)肽的組成。對亞麻籽環(huán)肽的完全分離及測定，尤其是氧化態(tài)環(huán)肽[15]，是利用環(huán)肽組成差異評價亞麻籽油氧化程度的重要基礎(chǔ)。本方法可用于評價亞麻籽油氧化程度。

2.2 HPLC定量分析亞麻籽環(huán)肽的條件優(yōu)化

2.2.1 不同色譜柱對亞麻籽環(huán)肽分離的影響

基于流速1 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，洗脫程序?yàn)橐译?水初始體積分?jǐn)?shù)40%-60%，乙腈以5%/min 升至乙腈-水體積分?jǐn)?shù)為90%-10%的條件下，考察不同色譜柱對亞麻籽環(huán)肽分離的影響，結(jié)果見圖2、圖3。

圖2 亞麻籽環(huán)肽混合標(biāo)品在Diamonsil C18的色譜圖

圖3 亞麻籽環(huán)肽混合標(biāo)品在Kinetex?的色譜圖

從圖2和圖3可以看出，亞麻籽環(huán)肽混合標(biāo)樣在Diamonsil C18色譜柱分離過程中，在8～10 min處所洗脫的色譜峰(環(huán)肽H、K、D、J、N)，存在重疊現(xiàn)象。Gui等[6]使用ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱，也存在環(huán)肽色譜峰的重疊現(xiàn)象。相比Kinetex?色譜柱，在環(huán)肽L(保留時間為12.00 min)后，未見剩余2個環(huán)肽色譜峰檢出，推測其與環(huán)肽A色譜峰同時洗脫。Kinetex?色譜柱在6～8 min處，5個色譜峰(環(huán)肽H、K、D、J、N)均實(shí)現(xiàn)良好的分離?？梢钥闯?，Kinetex?色譜柱柱效高，對結(jié)構(gòu)相近的環(huán)肽具有較好的分離效果，同時可以分離含量較低的環(huán)肽，獲得的亞麻籽環(huán)肽變化規(guī)律，可作為潛在的亞麻籽產(chǎn)品加工、貯藏方式的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。因此，后續(xù)試驗(yàn)選用Kinetex?色譜柱進(jìn)行環(huán)肽的分析測定。

2.2.2 進(jìn)樣量對分析效果的影響

基于Kinetex?色譜柱，流速1 mL/min，洗脫程序?yàn)橐译?水初始體積分?jǐn)?shù)60%-40%，乙腈以5%/min升至乙腈-水體積分?jǐn)?shù)為90%-10%的條件下，考察進(jìn)樣量對分析效果的影響，結(jié)果見表2。

表2 進(jìn)樣量對平均分離度及分析效率的影響

由表2可知，隨著進(jìn)樣量的減少，平均分離度呈逐步上升趨勢。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著進(jìn)樣量的增加，各環(huán)肽峰面積相應(yīng)增大，同時相鄰的色譜峰產(chǎn)生部分重疊，造成平均分離度下降。然而，隨著進(jìn)樣量減少，樣品中含量較少的環(huán)肽，如環(huán)肽H、J、N、K、D等，色譜峰面積過小，已接近基線噪聲水平，難以辨認(rèn)及積分定量。樣品中各個環(huán)肽的有效分離和檢出是實(shí)現(xiàn)環(huán)肽定性和準(zhǔn)確定量的基礎(chǔ)。因此，選擇樣品進(jìn)樣量時，要同時兼顧含量低的色譜峰檢出限及相鄰色譜峰的分離效果，不能僅追求峰的高度而增大進(jìn)樣量。綜合考慮，確定5 μL為最適進(jìn)樣量，可以滿足對環(huán)肽定量分析的需求。

2.2.3 初始體積分?jǐn)?shù)對分析效果的影響

基于Kinetex?色譜柱，流速1 mL/min，進(jìn)樣量5 μL，乙腈分別以30%、35%、40%、45%、50%和60%的初始體積分?jǐn)?shù)，5%/min速率升至90%的洗脫程序進(jìn)行分析，考察乙腈初始體積分?jǐn)?shù)對分析效果的影響，結(jié)果見表3。

表3 初始體積分?jǐn)?shù)對平均分離度及分析效率的影響

由表3可知，隨著乙腈初始體積分?jǐn)?shù)的增大，環(huán)肽的整體保留時間縮短，分析效率隨之增大。乙腈初始體積分?jǐn)?shù)從30%上升至50%時，分析效率穩(wěn)步提高。當(dāng)乙腈初始體積分?jǐn)?shù)為60%時，分析效率上升為16.68，達(dá)到最高。從平均分離度看，乙腈初始體積分?jǐn)?shù)從30%上升至40%時，平均分離度呈上升趨勢。隨著乙腈初始體積分?jǐn)?shù)的繼續(xù)增加，平均分離度明顯下降。當(dāng)乙腈初始體積分?jǐn)?shù)達(dá)到45%時，平均分離度(1.46)已低于理論色譜峰分離度(1.5)[12]。隨著乙腈初始體積分?jǐn)?shù)的繼續(xù)增加，分析效率達(dá)到最高時，平均分離度僅有1.33，環(huán)肽G與環(huán)肽F色譜峰發(fā)生重疊，該條件無法適用于環(huán)肽的分析。

在提高分析效率的同時，需保證適當(dāng)?shù)姆蛛x度。故40%的乙腈初始體積分?jǐn)?shù)為最優(yōu)。劉尊[16]、利嘉祥[17]等在初始體積分?jǐn)?shù)為50%乙腈水的梯度洗脫程序下，41 min實(shí)現(xiàn)對環(huán)肽A、C、D、E洗脫。左洋等[15]在初始體積分?jǐn)?shù)為30%乙腈水的梯度洗脫程序中，30 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)對氧化環(huán)肽完全洗脫，而還原態(tài)環(huán)肽出峰時間長達(dá)60 min，由于分析時間過長，不利于樣品的高效率批量分析。在保證平均分離度的情況下，縮短分析時間，需進(jìn)一步研究初始洗脫體積分?jǐn)?shù)、進(jìn)樣量、流速與亞麻籽環(huán)肽各個峰之間，尤其是關(guān)鍵峰之間的分析效率。

2.2.4 流速對分析效果的影響

基于Kinetex?色譜柱，流動相乙腈-水初始體積分?jǐn)?shù)40%-60%，進(jìn)樣量5 μL，乙腈以5%/min升至乙腈-水體積分?jǐn)?shù)為90%-10%的條件下，考察流速對分析效果的影響，結(jié)果見表4。

表4 流速對平均分離度及分析效率的影響

由表4可知，在4種不同流速下，平均分離度變化不明顯，最快流速下的分離度并沒有明顯減小，高流速下各個色譜峰仍能有效分離。說明該方法色譜柱柱效較高是分析時間大幅縮短的主要原因。從分析效率上看，隨著流速的增加，出峰時間不斷提前，保留時間幾近等比例縮短，最后一個色譜峰的保留時間由最長的22.30 min縮短為8.99 min，分析時間縮短了2/3。在平均分離度相差不大的情況下，分析效率從4.50大幅增加至10.86?，F(xiàn)有的研究報(bào)道中，并未見針對流速的優(yōu)化研究。同時，為了保護(hù)儀器和色譜柱，液相儀器對柱壓有一定限制，如接口材料、色譜填充材料的受壓極限，確定最優(yōu)流速為1 mL/min。

2.2.5 乙腈體積分?jǐn)?shù)上升速率對分析效果的影響

基于Kinetex?色譜柱，進(jìn)樣量5 μL，流速0.5 mL/min，流動相乙腈-水初始體積分?jǐn)?shù)40%-60%，最終乙腈-水上升至體積分?jǐn)?shù)為90%-10%的條件下，考察乙腈體積分?jǐn)?shù)上升速率對亞麻籽環(huán)肽分離效果的影響，結(jié)果見表5。

表5 乙腈體積分?jǐn)?shù)上升速率對平均分離度和分析效率的影響

由表5可知，隨著乙腈體積分?jǐn)?shù)上升速率的減小，平均分離度呈增大趨勢。在7%/min的上升速率下，平均分離度(1.40)已低于理論上色譜峰的分離度(1.5)要求，并不能對其進(jìn)行有效積分及定量。隨著乙腈體積分?jǐn)?shù)上升速率的提高，分析效率相應(yīng)上升，當(dāng)上升速率為7%/min以上時，分析效率的增長趨于平緩，但分離度已大幅下降。綜合考慮，以5%/min為最佳乙腈體積分?jǐn)?shù)上升速率。

2.3 最佳分析條件

試驗(yàn)確定了以Kinetex? Phenyl-Hexyl LC柱(150 mm×4.6 mm，2.6 μm)為色譜柱，流動相乙腈-水初始體積分?jǐn)?shù)為40%-60%洗脫，乙腈以5%/min速度升至乙腈-水體積分?jǐn)?shù)為90%-10%，流速1 mL/min，進(jìn)樣量5 μL為最佳分析條件。在該條件下，色譜峰峰型較好，平均分離度為1.65，分析效率為10.86，總分析時間為9.09 min。較文獻(xiàn)[15，17]大幅縮短時間，不存在色譜峰重疊現(xiàn)象。

2.4 亞麻籽、商品亞麻籽油及亞麻籽粕中環(huán)肽的含量(見表6)

由表6可知，亞麻籽中除環(huán)肽F、G、H、K外，其他環(huán)肽均有檢出，其中環(huán)肽A的含量最高，為23.40%，環(huán)肽B次之，為23.11%。商品亞麻籽油中除環(huán)肽K、N、B外，其他11種環(huán)肽均有檢出，化學(xué)性質(zhì)最穩(wěn)定的環(huán)肽A的含量最多(36.93%)。亞麻籽粕中還原態(tài)的亞麻籽環(huán)肽含量較低，環(huán)肽B相對含量為1.70%，環(huán)肽L相對含量為0.11%，由于壓榨等加熱工藝對環(huán)肽的氧化穩(wěn)定性有一定影響，使含有蛋氨酸基團(tuán)的環(huán)肽發(fā)生氧化[18]。商品亞麻籽油和亞麻籽粕中環(huán)肽種類及含量較亞麻籽的多，對于含有兩個蛋氨酸砜基團(tuán)的環(huán)肽F、G，亞麻籽粕中相對含量高達(dá)6.62%和19.65%，商品亞麻籽油中僅為2.56%和7.40%，而亞麻籽中未檢出，可見亞麻籽環(huán)肽在亞麻籽中氧化程度較低，這說明亞麻籽殼對其仁具有一定的保護(hù)作用，可減緩環(huán)肽的氧化。亞麻籽中的環(huán)肽種類沒有亞麻籽粕中環(huán)肽多，亞麻籽粕在保存、加工過程中環(huán)肽發(fā)生了部分氧化，導(dǎo)致種類增多[19]。通過亞麻籽環(huán)肽組成的分析，可以推斷亞麻籽產(chǎn)品的來源及氧化程度。

表6 樣品中環(huán)肽的組成及相對含量 %

3 結(jié) 論

本研究通過優(yōu)化亞麻籽環(huán)肽高效液相色譜分析條件，分析了亞麻籽、亞麻籽油及亞麻籽粕中環(huán)肽的組成和相對含量，探究了色譜柱、梯度洗脫初始體積分?jǐn)?shù)、進(jìn)樣量、流速和乙腈體積分?jǐn)?shù)上升速率對亞麻籽環(huán)肽HPLC分析的影響，并利用HPLC-ESI-MS進(jìn)行定性分析。HPLC最優(yōu)條件為：采用Kinetex?色譜柱，流動相乙腈-水初始體積分?jǐn)?shù)為40%-60%，乙腈以5%/min升至乙腈-水體積分?jǐn)?shù)為90%-10%，流速1 mL/min，進(jìn)樣量5 μL。最優(yōu)條件下環(huán)肽混合標(biāo)樣的平均分離度為1.65，分析效率為10.86，分析時間為9.09 min。該方法可有效、快速檢測亞麻籽、商品亞麻籽油和亞麻籽粕中的環(huán)肽組成。本研究可為今后亞麻籽相關(guān)產(chǎn)品的溯源、品質(zhì)評價等方面，提供一定的分析方法基礎(chǔ)。