張 振，汪廣厚

（1. 北京世橋生物制藥有限公司，北京 101301； 2. 首都醫(yī)科大學(xué)，北京 100069）

帕立骨化醇（19-去甲-1，25-二羥維生素D2）是一種選擇性維生素D 受體激動(dòng)劑（VDRA），可激發(fā)維生素D 反應(yīng)通路產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。該藥主要用于治療接受血液透析的慢性腎功能衰竭患者的繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)[1]。因帕立骨化醇注射液在本公司生產(chǎn)車(chē)間存在其他共線產(chǎn)品，為避免交叉污染，需對(duì)帕立骨化醇?xì)埩粑镞M(jìn)行檢測(cè)。本研究中參考藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GMP）指南確定帕立骨化醇注射液在制藥設(shè)備上的最大允許殘留限度為0.13 ng/cm2[2]，參考藥典要求[3]，以此限度采用反相液相色譜法[4]和外標(biāo)定量的方式，建立帕立骨化醇注射液殘留清潔分析方法，并對(duì)該方法進(jìn)行驗(yàn)證[5-7]，以確保此方法能有效地檢測(cè)清潔帕立骨化醇注射液的生產(chǎn)設(shè)備表面殘留物，以防止帕立骨化醇對(duì)后續(xù)產(chǎn)品造成交叉污染[8]?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器、試藥與材料

1.1 儀器

1260 型高效液相色譜儀（美國(guó)Aglient 公司）；XPE205 型電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；3-5N 型離心機(jī)（湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司）；XH-C型旋渦混合器（新寶儀器廠）；KH500DE 型超聲波清洗機(jī)（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥與材料

帕立骨化醇乙醇溶液對(duì)照品（USP 對(duì)照品，批號(hào)為R016S0，含量為508 μg/mL）；聚酯纖維棉簽（深圳市華晨陽(yáng)科技有限公司，批號(hào)為CY715A）；乙腈、乙醇均為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil100-C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：15%乙腈（A）-乙腈（B），梯度洗脫（見(jiàn)表1）；檢測(cè)波長(zhǎng)：252 nm；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：100 μL；柱溫：25 ℃；樣品室溫度：5 ℃；稀釋劑、擦拭溶劑：50%乙醇；擦拭材料：不銹鋼板10 cm×10 cm，有機(jī)玻璃板，鋼化玻璃板和聚四氟乙烯板。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

2.2 溶液制備

空白棉簽液：預(yù)處理中，將100 根棉簽置500 mL 燒杯中，加約250 mL 甲醇，超聲（功率250 W，頻率40 kHz，下同）處理20 min，倒掉甲醇，用250 mL 新鮮甲醇重復(fù)該步驟2 次，再用250 mL 水重復(fù)該步驟1 次，最后用250 mL 新鮮乙醇重復(fù)該步驟2 次。將棉簽置60 ℃烘箱中烘干或自然風(fēng)干。將包裹在2 根預(yù)處理過(guò)的干凈棉簽頂端的棉布剪下，放入離心管中，用1 mL 擦試劑和1 mL稀釋劑浸濕，加塞后超聲15 min，渦旋2 min，取出棉布，3 000 r/min 離心5 min，收集上清液，置自動(dòng)進(jìn)樣瓶中。

空白輔料液：精密移取6.5 mL 帕立骨化醇注射液輔料，置200 mL 容量瓶中，用稀釋劑定容，搖勻，精密移取1 mL 置10 mL 容量瓶中，用稀釋劑定容，搖勻。

表面干擾溶液：移取1 mL 擦拭劑置15 mL 塑料離心管中，2 根棉簽浸濕稀釋劑，然后在清潔后的設(shè)備表面進(jìn)行擦拭，取樣框范圍10 cm×10 cm，在擦拭過(guò)程中用棉簽蘸少量清潔溶液，首先用1 根棉簽橫向擦拭，翻轉(zhuǎn)棉簽再縱向擦拭；然后用另外1 根棉簽沿對(duì)角線擦拭，翻轉(zhuǎn)棉簽再沿另一方向?qū)蔷€擦拭，在擦拭時(shí)注意棉簽一定沿一個(gè)方向擦拭，不可來(lái)回擦拭。擦拭過(guò)程中要求取樣框范圍內(nèi)都要擦到，詳見(jiàn)圖1。擦拭后按樣品溶液配制方法提取，即得。

圖1 棉簽擦拭過(guò)程

對(duì)照溶液：精密移取帕立骨化醇USP 對(duì)照品溶液，用稀釋劑稀釋成質(zhì)量濃度為6.5 ng/mL 的溶液，即得。

標(biāo)準(zhǔn)添加溶液：精密移取帕立骨化醇USP 對(duì)照品溶液適量，用稀釋劑稀釋成質(zhì)量濃度約為0.13 μg/mL的溶液，即得。

樣品溶液：用微量注射器分別在3 塊清潔過(guò)的10 cm×10 cm 不銹鋼板均勻滴加標(biāo)準(zhǔn)添加液100 μL，讓其自然風(fēng)干。用2 根預(yù)處理過(guò)的棉簽按棉簽擦拭過(guò)程擦拭，然后將棉簽頂端包裹的棉布剪下，放入上述裝有1 mL 擦拭劑的離心管中，加入1 mL 稀釋劑，蓋緊蓋子。超聲處理15 min，再渦旋2 min，取出棉布，3 000 r/min離心5 min，收集上清液。

2.3 方法學(xué)考察

專(zhuān)性屬試驗(yàn)：分別取稀釋劑、擦拭劑、空白棉簽液、空白輔料液、對(duì)照溶液、表面干擾溶液和樣品溶液各100 μL 注入液相色譜儀，按擬訂色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖（見(jiàn)圖2），可見(jiàn)，稀釋劑、擦拭劑、空白棉簽、空白輔料、表面干擾溶液在主峰位置均無(wú)干擾。

檢測(cè)限和定量限測(cè)定：取帕立骨化醇對(duì)照品適量，并用稀釋劑稀釋。取信噪比（S/ N）約為3 的溶液作檢測(cè)限溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，得檢測(cè)限為0.059 ng。取S/ N約為10 的溶液作定量限溶液并測(cè)定，得定量限為0.198 ng。

圖2 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：精密移取帕立骨化醇USP 對(duì)照品溶液，用稀釋劑稀釋得質(zhì)量濃度分別為1.98，6.60，13.21，19.81，26.42，33.02 ng/mL 的對(duì)照品系列溶液，分別精密量取100 μL，以上述色譜條件測(cè)定其峰面積，以溶液的質(zhì)量濃度（X，ng/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=474.02X-49.72，r=0.999 9（n=6）。結(jié)果表明，帕立骨化醇質(zhì)量濃度在1.98 ～33.02ng/mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

回收試驗(yàn)：取3 塊潔凈的10 cm×10 cm 擦拭材料，用微量注射器分別均勻滴加標(biāo)準(zhǔn)添加溶液50，100，150 μL，讓其自然風(fēng)干，每個(gè)水平平行制備3 份。然后用2 根預(yù)處理過(guò)的棉簽按棉簽擦拭過(guò)程擦拭并提取棉簽，按上述色譜條件檢測(cè)，并計(jì)算回收率和校正因子。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 回收試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

精密度試驗(yàn)：取100 μL 對(duì)照溶液，按色譜條件分別在同一時(shí)間重復(fù)進(jìn)樣6 次，考察日內(nèi)精密度，連續(xù)3 d重復(fù)進(jìn)樣6 次，考察日間精密度，并記錄峰面積。結(jié)果RSD均小于2.0% （n=6），表明儀器精密度良好，詳見(jiàn)表3。

表3 儀器精密度試驗(yàn)結(jié)果（ n=6）

重復(fù)性試驗(yàn)：依法制備并測(cè)定6 份100%準(zhǔn)確度水平樣品。結(jié)果各樣品的取樣回收率均在87.6% ～93.5%之間，RSD為2.9%，表明方法重復(fù)性良好。

重現(xiàn)性試驗(yàn)：由另外一名試驗(yàn)員在不同日期，使用不同的液相系統(tǒng)和不同的色譜柱，按100%準(zhǔn)確度水平樣品的制備方法制備6 份不銹鋼樣品溶液，并與重復(fù)性結(jié)果進(jìn)行比較。經(jīng)計(jì)算，樣品取樣回收率均在105.5% ～125.7%之間，RSD均不超過(guò)7.0%，2 名試驗(yàn)員差值為16.5%，表明方法重現(xiàn)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：將對(duì)照品和樣品溶液儲(chǔ)存于5 ℃條件下，并分別于0，1，2，3，5，7 d 測(cè)定。經(jīng)計(jì)算，與0 d 回收率的差值均不超過(guò)10.0%，表明對(duì)照品溶液和樣品溶液在5 ℃條件下存儲(chǔ)7 d 穩(wěn)定。

2.4 殘留量檢測(cè)

采用該清潔分析方法對(duì)我廠車(chē)間生產(chǎn)帕立骨化醇注射液后并完成清潔的設(shè)備進(jìn)行擦拭取樣，共評(píng)估27個(gè)點(diǎn)，編號(hào)為SC1-SC27，其中SC26 的檢測(cè)結(jié)果為0.08 ng/cm2，其他點(diǎn)均未檢測(cè)出殘留。

3 討論

目前車(chē)間生產(chǎn)的產(chǎn)品為共線生產(chǎn)，存在產(chǎn)品間的交叉污染風(fēng)險(xiǎn)。控制交叉污染的有效措施之一就是對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行清潔驗(yàn)證，目的是證明所有與產(chǎn)品接觸的設(shè)備所使用的清洗程序能有效地除去產(chǎn)品殘留，達(dá)到預(yù)先確定的限度，從而達(dá)到對(duì)下批產(chǎn)品無(wú)影響的目的。目前計(jì)算殘留限度的方法為1/1 000 日劑量，半數(shù)致死量（LD50）和10 ×10-6。上述判定是根據(jù)基于風(fēng)險(xiǎn)防止藥品生產(chǎn)中交叉污染及“共用設(shè)施中不同藥品生產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)識(shí)別所用基于健康的暴露限設(shè)定指南”實(shí)施問(wèn)題的征求意見(jiàn)稿[9]。2018 年4 月，該指南最終稿發(fā)布，第4 季度做出相應(yīng)的修訂，所有產(chǎn)品的清潔限度均需用每日允許暴露量（PDE）進(jìn)行計(jì)算，應(yīng)根據(jù)所涉及物料，合理確認(rèn)產(chǎn)品殘留。故本研究的最大允許殘留限度分別采用了10×10-6、最低日治療劑量、LD50和PDE 4 種方式進(jìn)行計(jì)算，限度分別為1.58，0.13，0.15，0.16 ng/cm2。可見(jiàn)基于最低日治療劑量，帕立骨化醇注射液的最大允許殘留限度最低，風(fēng)險(xiǎn)最大，因此采用該限度作為限度水平。試驗(yàn)過(guò)程中取樣面積為100 cm2，故標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為6.5 ng/mL（100 cm2×0.13 ng/cm2÷2 mL=6.5 ng/mL）。2 mL 為樣品總體積，包括1 mL 的擦拭劑及1 mL 稀釋劑。

清潔分析方法開(kāi)發(fā)過(guò)程中，關(guān)鍵點(diǎn)分別為樣品的擦拭提取和分析方法的專(zhuān)屬性、靈敏度和可重復(fù)性。經(jīng)多次試驗(yàn)最終選取了50%乙醇作為擦拭溶劑[10-11]和稀釋溶劑。為消除空白棉簽的干擾，將方法設(shè)置為梯度洗脫，為增加靈敏度，降低了樣品的稀釋倍數(shù)，增加了樣品的進(jìn)樣量，同時(shí)需要保證良好的峰形。由于在清潔擦拭取樣過(guò)程中，人員操作非常關(guān)鍵，為保證方法的可重復(fù)性及重現(xiàn)性[12]，文中進(jìn)行相應(yīng)考察，結(jié)果良好。

由于在生產(chǎn)過(guò)程中物料會(huì)與不同材質(zhì)的生產(chǎn)設(shè)備相互接觸，不同的材質(zhì)對(duì)帕立骨化醇的吸附能力存在差異，采用相同的擦拭回收方法，可能會(huì)出現(xiàn)取樣回收結(jié)果不一致的情況，故對(duì)不同材質(zhì)均進(jìn)行了回收率研究[13]，包括不銹鋼、鋼化玻璃、有機(jī)玻璃和聚四氟乙烯。結(jié)果4 種材質(zhì)所得結(jié)果均符合標(biāo)準(zhǔn)，但不同材質(zhì)間的回收率有明顯差異。

因?yàn)橹扑幵O(shè)備清潔驗(yàn)證過(guò)程中，樣品并不能一起送至實(shí)驗(yàn)室，有時(shí)間隔會(huì)很長(zhǎng)，為了節(jié)約時(shí)間和成本，需要盡量將樣品一起檢測(cè)，所以穩(wěn)定性研究非常必要。不同藥品的穩(wěn)定性存在很大差異，美國(guó)注射藥物協(xié)會(huì)建議：在進(jìn)行溶液穩(wěn)定性研究時(shí)，如果藥品不具備良好的穩(wěn)定性，可在低溫下進(jìn)行研究；如果藥品非常不穩(wěn)定，那么應(yīng)同時(shí)考察殘留的藥品降解產(chǎn)物，避免殘留的降解產(chǎn)物對(duì)其他產(chǎn)品造成污染。

綜上所述，該方法靈敏度、準(zhǔn)確性、重復(fù)性和穩(wěn)定性均良好，適用于帕立骨化醇注射液清潔殘留樣品的檢測(cè)。在清潔驗(yàn)證取樣時(shí)，應(yīng)采用50%乙醇作為擦拭溶劑，為降低風(fēng)險(xiǎn)，最后結(jié)果應(yīng)用最大校正因子值1.6 進(jìn)行校正[14]，以有效控制交叉污染。