馬成成 王 鑫 高 英 香 雪 胡婉麗 柴 曄

(蘭州大學(xué)第二醫(yī)院血液科，蘭州 730030)

漿細(xì)胞疾病以分泌單克隆免疫球蛋白(monoclonal immunoglobulin,MIg)為特征，具有高度異質(zhì)性。MIg是指漿細(xì)胞或B淋巴細(xì)胞過度增殖產(chǎn)生的免疫球蛋白分子或片段,臨床常見于意義未明的單克隆免疫球蛋白血癥(monoclonal gammopathy of undetermined significance，MGUS)、多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)、原發(fā)性巨球蛋白血癥(macroglobulinemia，WM)、原發(fā)性淀粉樣變(amyloidosis，AL)及POEMS綜合征。MIg的檢測主要依賴骨髓穿刺樣本分析，傳統(tǒng)的檢測方法包括血清蛋白電泳(serum protein electrophoresis，SPE)、免疫固定電泳(immunofixation electrophoresis，IFE)，血清游離輕鏈(serum free light chain，sFLC)[1]。SPE對于低濃度MIg難以精確定量，IFE只能定性MIg,sFLC僅能間接反映漿細(xì)胞克隆程度，這些方法都難以精確檢測微小殘留(minimal residual disease，MRD)，MRD的精確檢測是通過檢測骨髓穿刺標(biāo)本實(shí)現(xiàn)的，但常常由于骨髓病灶分布不均及骨髓稀釋而導(dǎo)致檢測結(jié)果差異較大[2]。血清重輕鏈(heavy/light chain，HLC)檢測優(yōu)勢在于依靠外周血樣本分析，具有敏感度高、獲取簡便、分布均勻、能直接反映漿細(xì)胞克隆程度等，但HLC檢測技術(shù)并未廣泛應(yīng)用于臨床，只有部分科研機(jī)構(gòu)進(jìn)行臨床研究。本文就HLC檢測推算出的HLC比值及“HLC對抑制”對于漿細(xì)胞疾病的早期診斷、危險分層、療效評估、疾病監(jiān)測、判斷預(yù)后及治療方面的潛在價值進(jìn)行綜述。

1 HLC檢測方法

2009年Bradwell[3]首次提出HLC檢測方法，該方法通過定量重鏈及輕鏈確定的完整免疫球蛋白(比如IgGκ、IgGλ、IgAκ、IgAλ)水平，推算出受累免疫球蛋白與非受累免疫球蛋白的比值，即HLC比值(IgGκ/IgGλ，IgAκ/IgAλ)[4]。HLC檢測的原理是特異性識別被隱藏起來的重鏈與輕鏈相結(jié)合時的隱藏區(qū)表位，檢測分兩部分，以IgGκ型蛋白血癥為例，第一部分為IgGκ，第二部分檢測為IgGλ，在IgGκ和IgGλ中，升高的一個即為受累重輕鏈，另一個則為非受累重輕鏈(正常IgG)，二者差值絕對值即為單克隆IgG，亦即M蛋白。具體操作為通過免疫，聚合，吸附等一系列程序，采用綿羊抗體分別識別6種分子：IgGκ、IgGλ、IgAκ、IgAλ、IgMκ、IgMλ，抗體靶點(diǎn)作用于重鏈和輕鏈之間的表位，使用免疫比濁法定量免疫球蛋白。IgG、IgA、IgM的參考范圍參照梅奧診所實(shí)驗(yàn)室參數(shù)[5]，HLC檢測操作方便，其檢測試劑盒(IgGκ/λ、IgAκ/λ)均購自英國The Binding site公司。患者血清經(jīng)過采集、離心、分裝、保存?zhèn)溆?，采用免疫比濁法定量檢測rHLC(IgGκ/λ、IgAκ/λ比值)。盡管SPE技術(shù)已經(jīng)有很大進(jìn)步，但在M蛋白鑒別和定量上仍存在問題，當(dāng)M蛋白與其他血清蛋白比如轉(zhuǎn)鐵蛋白、補(bǔ)體等共同遷移時在電泳條帶上表現(xiàn)為從α2區(qū)移動到γ條帶，此時難以鑒別M蛋白；如果M蛋白濃度低或合并感染時會表現(xiàn)出多克隆征象，此時M蛋白可能無法分解為一個單獨(dú)的條帶。IFE是一種較為靈敏的檢測方法，也是目前檢測和表征M蛋白的金標(biāo)準(zhǔn),國際骨髓瘤工作組(International Myeloma Working Group ，IMWG)建議用比濁法定量總Ig，但該方法不能區(qū)分MIg和正常的多克隆Ig。有報道SPE測定M蛋白濃度偏高，尤其是在IgG和IgM型M蛋白血癥中[6]。HLC比值異常與患者無進(jìn)展生存期(progression-free survival，PFS)和總體生存期(overall survival，OS)相關(guān)，在臨床上可參考HLC比值來監(jiān)測疾病進(jìn)展及早期預(yù)測疾病復(fù)發(fā)[7-10]。

2 HLC比值及“HLC對抑制”在MGUS和冒煙型骨髓瘤(SMM)中的應(yīng)用

2.1MGUS和MM疾病特征 MGUS和SMM是一種癌前克隆病變，MGUS的MIg<30 g/L,骨髓漿細(xì)胞比例低于10%，并且無CRAB癥狀，也稱骨髓瘤癌前病變，腫瘤負(fù)荷相對較低。目前認(rèn)為所有的MM患者由MGUS或SMM進(jìn)展而來，盡管這些疾病存在重疊，但因各自生物學(xué)和疾病演變特征不同而被鑒別。2014年歐洲骨髓瘤網(wǎng)絡(luò)(European Myeloma Network,EMN)提到MGUS每年惡變風(fēng)險為1%，低風(fēng)險的MGUS患者20年內(nèi)進(jìn)展為MM風(fēng)險為5%[11]。SMM介于MGUS與MM之間的階段，骨髓漿細(xì)胞>10%和/或MIg>30 g/L,但是無CRAB癥狀，比MGUS進(jìn)展風(fēng)險大，并且在確診后5年內(nèi)進(jìn)展為MM風(fēng)險是10%。MIg的定量對于MGUS和SMM患者疾病進(jìn)展風(fēng)險預(yù)測具有重要意義[12]。由于MGUS和SMM中的MIg濃度相對較低，HLC檢測可以彌補(bǔ)電泳技術(shù)的不足，精確測定MIg濃度，評估疾病風(fēng)險。HLC檢測方法的出現(xiàn)，使得研究者對HLC比值及“HLC對抑制”在MGUS和SMM疾病進(jìn)展的預(yù)測方面進(jìn)行了深入探討。

2.2HLC比值及“HLC對抑制” 受累與非受累的免疫球蛋白組成一對HLC對(HLC matched-pair)，受累的免疫球蛋白會抑制非受累的免疫球蛋白，這種現(xiàn)象稱為“HLC對抑制”(HLC matched-pair supression)[13]。在IgA或IgM亞型中，“HLC對抑制”明顯縮短患者的PFS，而IgM患者的“HLC對抑制”和演變模式與疾病進(jìn)展獨(dú)立相關(guān)[14]，這表明“HLC對抑制”有助于MGUS和SMM患者疾病危險分層，尤其是在IgG亞型患者中，雖然HLC檢測還未常規(guī)應(yīng)用于臨床，但I(xiàn)gA MGUS患者97%的敏感性表明，幾乎所有的MGUS患者都可使用HLC檢測克隆性和定量[15，16]。值得注意的是，在不同重鏈亞型中HLC異常比例不同，可能是由于IgG型MIg參數(shù)范圍下限比IgA和IgM濃度高所致[17]。Katzman等[5]發(fā)現(xiàn)，999例MGUS患者中，66%患者HLC比值異常，其中IgG型、IgA型和IgM型MGUS中HLC比值異常比例分別為56%、96%、90%，即使是在很低的MIg濃度，HLC比值仍會出現(xiàn)異常，多變量分析HLC比值在MGUS中敏感性高，對于MGUS診斷意義不顯著，并且多因素分析顯示HLC比值異常對于MGUS疾病進(jìn)展無顯著意義，但“HLC對抑制”能夠反映單克隆漿細(xì)胞對多克隆漿細(xì)胞的抑制程度，且是MGUS患者疾病進(jìn)展的獨(dú)立危險因素[5]。關(guān)于MGUS危險分層的研究，根據(jù)初診時包含危險因素的個數(shù)將患者分為5個亞組，發(fā)現(xiàn)各亞組之間其疾病進(jìn)展風(fēng)險差異顯著，并通過構(gòu)建危險分層模型，證實(shí)有助于早期識別高危患者，從而制定個體化治療方案并長期隨訪。與單純的MIg定量相比，“HLC對抑制”更能鑒別高危MGUS患者，是疾病危險分層、判斷預(yù)后的因素之一。

MGUS、SMM進(jìn)展為MM的危險因素為MIg濃度、漿細(xì)胞比例、Ig重鏈分型、sFLC比值、尿克隆輕鏈、未受累的多克隆Ig[18]，“HLC對抑制”反映的是MIg對多克隆Ig的抑制，因此HLC抑制程度可根據(jù)輕、中、重度進(jìn)行疾病危險分層，預(yù)測MGUS或SMM進(jìn)展風(fēng)險，識別高危患者并對這部分患者密切隨訪，直至疾病進(jìn)展，并且選擇合適的治療方案及干預(yù)時間，最終延長患者的PFS及OS。

3 HLC比值及“HLC對抑制”在MM中的應(yīng)用

3.1MM疾病特征 MM是漿細(xì)胞惡性增殖性疾病，以血或尿中出現(xiàn)單克隆免疫球蛋白為特征。MM的診斷基于MIg濃度，MM的療效評估是基于血清和尿蛋白電泳中MIg的減少水平，2016年IMWG已經(jīng)新增了MRD作為MM療效評判的標(biāo)準(zhǔn)。隨著新藥及自體造血干細(xì)胞移植(autologous stem cell transplantation，ASCT)的應(yīng)用，MM的預(yù)后明顯改善，但仍無法治愈。MM患者獲得完全緩解(complete response，CR)并不能明顯改善預(yù)后，但持續(xù)MRD陰性患者的PFS和OS都要優(yōu)于MRD未轉(zhuǎn)陰患者。SPE檢測時，在46%的IgA型和4%的IgG型MM患者中，MIg常遷移至SPE的其他條帶區(qū)域，被轉(zhuǎn)鐵蛋白、β脂蛋白及C3濃度影響,而HLC檢測可克服傳統(tǒng)檢測方法的不足，精確測定低濃度的MIg，還可鑒別受累的免疫球蛋白及未受累的免疫球蛋白，同時，HLC比值異常提示單克隆性，受累的HLC(involved HLC，iHLC)為M蛋白定量提供依據(jù)，能夠精確反映腫瘤負(fù)荷，并且總IgG HLC(IgGκ+IgGλ)與總IgG(total IgG)定量一致,有望為治療后評估療效提供一個更精確的MIg測定。

3.2HLC比值 大部分患者的SPE與HLC比值具有良好的一致性，但部分SPE陽性患者的HLC比值卻表現(xiàn)為正常[19，20]，考慮HLC檢測IgG型MIg敏感性比IgA、IgM低，除此之外，還與MM患者在治療期間出現(xiàn)新的克隆(IgGκ治療后出現(xiàn)IgGλ)或MM患者為不同亞型的雙克隆有關(guān)，若sFLC比值增加，則考慮治療過程中可能出現(xiàn)輕鏈逃逸，結(jié)果疾病進(jìn)展或復(fù)發(fā)，這表明當(dāng)懷疑臨床復(fù)發(fā)時sFLC與HLC聯(lián)合應(yīng)用對監(jiān)測MM復(fù)發(fā)的重要性。反之，在完全緩解的MM患者中，SPE、IFE、sFLC均正常，但HLC比值異常，表明MM患者仍存在MRD[21，22]。通過動態(tài)監(jiān)測同一MM患者的HLC比值變化，發(fā)現(xiàn)HLC比值恢復(fù)正常的時間遲于傳統(tǒng)檢測方法，因此HLC檢測MRD較敏感，可作為MM患者M(jìn)RD的輔助評價方法[23]。新診斷的MM患者誘導(dǎo)治療后，80%的患者HLC正常，且聯(lián)合sFLC和HLC測定檢測MRD陰性比例與單獨(dú)HLC檢測結(jié)果相當(dāng)，但后者更容易實(shí)行[24]，且HLC聯(lián)合IFE、sFLC敏感性比單獨(dú)檢測方法敏感性更高，通過多種方法檢測MIg的敏感性時，sFLC比值正常的患者可出現(xiàn)HLC比值異常，HLC比值異?；颊邚?fù)發(fā)率較高[25]，除此以外，HLC比值與β-2微球蛋白被認(rèn)為與預(yù)后相關(guān)，通過風(fēng)險分層模型分析，發(fā)現(xiàn)β-2微球蛋白大于3.5 mg/L和HLC比值異常的患者預(yù)后較差，比ISS分期具有更高價值[7]。HLC比值變化反映疾病進(jìn)程，為MM患者的療效評估、治療選擇及預(yù)后提供重要的參數(shù)，尤其是IgG型多發(fā)性骨髓瘤患者化療后HLC比值異常會縮短無進(jìn)展生存期[20]。

3.3“HLC對抑制” “HLC對抑制”驅(qū)動致HLC比值異常，與治療后腫瘤活性及多克隆免疫重建有關(guān)。“HLC對抑制”在新診斷的MM、復(fù)發(fā)難治性MM及ASCT患者中都提示不良預(yù)后。在新診斷的MM患者中，存在“HLC對抑制”的MM患者總體生存時間明顯縮短,尤其是在IgG型MM患者中[26，27]?！癏LC對抑制”在未達(dá)到VGPR的患者中抑制程度顯著，即使患者能夠達(dá)到首次緩解，但仍影響患者PFS。Ludwig等[28]采用多變量分析證實(shí)顯著的“HLC對抑制”可作為縮短OS的獨(dú)立危險因素，提示特異性免疫失調(diào)會影響MM患者的OS，值得注意的是，在復(fù)發(fā)難治性MM患者中，也得出相同結(jié)論。對于進(jìn)行ASCT的MM患者，“HLC對抑制”反映了克隆細(xì)胞的持續(xù)存在，而與全身的免疫缺陷無關(guān)[29，30]。在療效評估方面，根據(jù)“HLC對抑制”程度對MM患者分層，MIg濃度越高，“HLC對抑制”程度越高，PFS越短。根據(jù)IMWG的評估標(biāo)準(zhǔn)，部分療效評估為VGPR的患者，在HLC評估標(biāo)準(zhǔn)中卻為CR，但是這兩種方法評估為CR的患者PFS相似，說明HLC評估并未破壞傳統(tǒng)評估的有效性。

在達(dá)到深度緩解時(IFE陰性、sFLC正常)，HLC比值及“HLC對抑制”的價值在于提高了MRD檢測的敏感性，是縮短PFS、OS的危險因素，HLC檢測方法進(jìn)行療效評估與傳統(tǒng)檢測方法結(jié)果相似，但是在獲得更深程度緩解的患者中HLC檢測比IFE更敏感[8]，HLC可能是評估CR的一個更合適的工具。而“HLC對抑制”與機(jī)體免疫重建相關(guān)。相反，當(dāng)IFE陰性，SPE、HLC正常時，在骨髓活檢前我們還應(yīng)該檢測sFLC，明確有無輕鏈逃逸或其他亞克隆的發(fā)生，避免不必要的有創(chuàng)性檢查，HLC與sFLC不一致時，更加說明了MM疾病的異質(zhì)性，在MM病程中發(fā)生克隆演化，出現(xiàn)亞克隆，產(chǎn)生了完整Ig。

4 HLC比值及“HLC對抑制”在WM中的應(yīng)用

4.1WM疾病特征 WM是一種淋巴漿細(xì)胞淋巴瘤，其特征是骨髓中存在漿細(xì)胞樣淋巴細(xì)胞浸潤，并伴有外周血單克隆免疫球蛋白M(IgM)增高。單克隆IgM與腫瘤負(fù)荷相關(guān)，并且是WM療效評估、疾病進(jìn)展的重要血清學(xué)指標(biāo)。IgM在血清中易形成相對分子質(zhì)量較大的多聚體，導(dǎo)致凝膠孔堵塞，影響單克隆IgM測定水平，而傳統(tǒng)方法對低濃度IgM敏感性差，不能精確反映腫瘤負(fù)荷程度，另有一些樣本含有冷球蛋白，需要高溫下才能分析，以防單克隆IgM的沉淀，傳統(tǒng)方法面臨挑戰(zhàn)，HLC檢測提高了IgM敏感性。

4.2HLC比值 Boyle等[31]比較了HLC、SPE和濁度計測定三種方法對于WM診斷的敏感性及療效評估的差異，結(jié)果顯示，在所有檢測的WM血清中，IgM HLC比值均異常。盡管定量在三種方法中并不一致，但HLC檢測評估的疾病分層與國際指南評估一致。HLC檢測為傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室定量單克隆IgM提供了一種替代方法，從而能更好用于WM患者的管理[32]。國內(nèi)曾報道過一例雙M蛋白血癥的WM患者，報告中提及HLC比值異常與免疫球蛋白克隆性相關(guān)，尤其是2種單克隆M蛋白電泳條帶完全重疊時，HLC檢測仍然可用于初步診斷[33]。

4.3“HLC對抑制” 因?yàn)閃M患者的IgM含量較MGUS高，所以“HLC對抑制”對多克隆免疫球蛋白抑制程度也較嚴(yán)重，且與疾病克隆程度一致。HLC檢測對于雙克隆MIg具有診斷價值，能精確定量IgM，“HLC對抑制”與疾病克隆相關(guān)，未來對于疾病進(jìn)展預(yù)測及預(yù)后判斷具有一定臨床價值，有可能作為當(dāng)前檢測方法的補(bǔ)充或取代目前的M蛋白測定技術(shù)，但仍需更多前瞻性臨床試驗(yàn)證實(shí)。HLC檢測對于大部分WM患者敏感性高，特異性相對較差。另外，對于高濃度的單克隆IgM,HLC檢測方法是否優(yōu)于傳統(tǒng)方法仍沒有確鑿證據(jù)證明。

5 HLC比值及“HLC對抑制”在AL中的應(yīng)用

5.1AL疾病特征 AL又稱免疫球蛋白輕鏈淀粉樣變性(immunoglobulin light-chain amyloidosis)，其特征是骨髓克隆性漿細(xì)胞過度產(chǎn)生免疫球蛋白輕鏈(κ或λ)，聚集并沉積到組織或器官形成淀粉樣變性。AL淀粉樣變性中，血清游離輕鏈即為MIg。目前AL疾病主要是通過sFLC檢測κ和λ輕鏈監(jiān)測M蛋白。研究表明，sFLC測定對于輕鏈型AL淀粉樣變性診斷及預(yù)后具有重要意義[34],無論是在化療還是移植患者中，是sFLC而不是完整的MIg決定了AL患者對治療的反應(yīng)，從而影響患者的生存期，梅奧研究組也有類似報道[35]。

5.2HLC比值與“HLC對抑制” 在AL患者中HLC比值異常很少見，但是“HLC對抑制”的程度的與預(yù)后相關(guān)。2016年的一項(xiàng)研究所納入的199例未經(jīng)治療的AL患者中，HLC異?；颊哒?7.2%，sFLC異?；颊哒?1.9%，HLC與sFLC結(jié)合敏感度為100%[36]。結(jié)論顯示，sFLC異常提示OS縮短，但HLC卻與OS無明顯相關(guān)性，在sFLC結(jié)果正常的患者中，HLC檢測有可能作為補(bǔ)充試驗(yàn)來定量單克隆蛋白。另有研究表明，嚴(yán)重的“HLC對抑制”是心臟AL患者預(yù)后不良的因素，也是自診斷后生存期超過6個月的有效標(biāo)志[37]。

AL發(fā)病機(jī)制決定了sFLC對于該疾病的預(yù)后價值，因此未來sFLC與HLC檢測方法聯(lián)合可增強(qiáng)AL患者疾病監(jiān)測的敏感性；“HLC對抑制”在AL中的意義仍需在未來更多的縱向研究中驗(yàn)證，需在使用新藥治療的更多患者中證實(shí)。

6 HLC比值及“HLC對抑制”在POEMS綜合征中的應(yīng)用

6.1POEMS疾病特征 POEMS(polyneuropathy,organomegaly,endocrinopathy,monoclonal plasma cell disorder,and skin changes)是一種罕見的漿細(xì)胞增多的副瘤綜合征，其特征主要是：多發(fā)性周圍神經(jīng)病變、臟器腫大、內(nèi)分泌病變、 單克隆性漿細(xì)胞疾病和皮膚改變，并由此而得名。該疾病中單克隆蛋白的血清濃度通常較低，并且在大多數(shù)情況下不適用于監(jiān)測疾病活動，限制了其預(yù)后價值。

6.2HLC比值 目前HLC檢測的出現(xiàn)對于漿細(xì)胞疾病的監(jiān)測和預(yù)后評估具有一定優(yōu)勢。2016年的一項(xiàng)納入了90例POEMS患者的研究，分別測定了基線HLC及治療后的HLC比值，其中有66%的患者基線HLC比值異常[37],治療后HLC有所改善，但仍有48%異常[38]。該研究表明，基線HLC異?；蛑委熀驢LC比值異常都是不良預(yù)后的獨(dú)立危險因素。因此，HLC在POEMS綜合征的臨床診治當(dāng)中具有一定的預(yù)后價值。

“HLC對抑制”在POEMS中暫無相關(guān)研究報道。POEMS綜合征MIg濃度相對較低，HLC對于低濃度MIg敏感性高，因此HLC檢測方法精確定量MIg，對POEMS綜合征診斷、監(jiān)測疾病活動及評估療效具有重要價值。

7 總結(jié)與展望

M蛋白是漿細(xì)胞疾病診斷、療效評估、預(yù)后評價的核心指標(biāo)。HLC檢測為M蛋白精確定量、評估疾病克隆程度及微小殘留病灶監(jiān)測帶來了新的契機(jī)。同時HLC比值及“HLC對抑制”對于疾病進(jìn)展、預(yù)后分層及早期預(yù)測疾病復(fù)發(fā)具有重要意義。近年來，HLC比值及“HLC對抑制”在MM中的研究較多，與MM發(fā)病率、病例數(shù)較多、容易復(fù)發(fā)有關(guān)，目前MM患者預(yù)后追求MRD持續(xù)陰性，因此，HLC比值及“HLC對抑制”在MRD方面的研究較多，但仍存在一定的局限性，需要更多的研究來驗(yàn)證。