李靜，苗龍，周文策,

（1.蘭州大學第一臨床醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730000；2.蘭州大學第一醫(yī)院 普通外科，甘肅 蘭州 730000）

膽結(jié)石疾病是世界范圍內(nèi)的常見病。它在西方國家非常普遍，影響著超過10%的人口[1]，而在過去的幾十年里，隨著經(jīng)濟的快速發(fā)展和生活方式、飲食習慣的西化，膽結(jié)石在我國的發(fā)病率已接近西方[2]。隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，近年來出現(xiàn)了多種非培養(yǎng)的分子技術(shù)方法，包括16s RNA測序、宏基因組測序等；這些技術(shù)在人類微生物組研究中的應用，使人們對人體微生態(tài)有了更加全面、深入的認識[3]，消化道微生態(tài)與膽結(jié)石形成的關(guān)系也受到廣泛關(guān)注，使結(jié)石形成機制的研究進入了微生物研究新階段。本文主要從消化道微生態(tài)在人體微生態(tài)中的地位、膽結(jié)石發(fā)病機制的研究概況、膽道微生態(tài)與膽結(jié)石疾病的關(guān)系及腸道微生態(tài)與膽結(jié)石疾病的關(guān)系幾個方面，針對消化道微生態(tài)與膽結(jié)石疾病的關(guān)系進行系統(tǒng)綜述。

1 消化道微生態(tài)是人體微生態(tài)的重要組成部分

人體內(nèi)每個微生物棲息地都具有獨特的微生物群落，并且它們之間并不是相互隔離的[4]。之后發(fā)現(xiàn)不僅個體的菌群組成高度個性化，而且它們的時間變異性也具有明顯的個性化特征[5]。消化道微生態(tài)系統(tǒng)作為人體微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，擁有人體微生物群落個體差異性、時間空間變異性等特點，且隨時間變化差異性較小，同時其個體差異性主要與遺傳因素相關(guān)[6]。

1.1 消化道微生態(tài)的特點

消化道為長腔型且不同部位生理功能不同，其微生物數(shù)量及優(yōu)勢菌群分布也存在差異。在消化道的不同部位，細菌的組成和數(shù)量是不同的，胃酸、膽汁和胰腺的分泌物會阻礙大多數(shù)細菌在胃和小腸近端定殖，在胃和十二指腸（10～103）、小腸（104～107）、大腸（1011～1012）中，大腸的菌群含量最高，占糞便質(zhì)量的60%[7]。除了沿胃腸道軸的菌群組成變化外，表面黏附菌群和管腔菌群也不同，黏膜表面的厭氧菌與好氧菌之比較腔內(nèi)低[8]。消化道微生物群參與多種機體功能，但其個體差異性大且多變的特點，導致其參與生理功能及疾病發(fā)生的機制復雜，尚需進一步研究明確。

1.2 消化道微生態(tài)與疾病的關(guān)系

眾多研究表明，消化道微生態(tài)失調(diào)與多種疾病相關(guān)：口腔微生物可能在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展中占據(jù)重要地位[9]；膽道微生物參與膽結(jié)石的形成[10]，同時與膽道惡性腫瘤的進展相關(guān)[11]；腸道菌群失調(diào)與心血管疾病、肥胖[12]，糖尿病[13]、代謝綜合征[14]、非酒精性肝硬化（NAFLD）[15]、結(jié)直腸惡性腫瘤[16]、膽結(jié)石[17]等疾病之間可能存在直接聯(lián)系。與膽結(jié)石形成相關(guān)的消化道微生物群主要為膽道及腸道微生物群，且這兩者間存在密不可分的聯(lián)系。

2 膽結(jié)石發(fā)病機制的研究概況

膽結(jié)石的形成是一個復雜的遺傳和環(huán)境因素相互作用的過程。一項對雙胞胎的大型研究[18]表明，在有癥狀的膽結(jié)石患者中，基因?qū)Ρ硇偷呢暙I為25%，共有的環(huán)境因素占13%，獨特的環(huán)境因素占62%。近年來的研究[19-20]發(fā)現(xiàn)膽結(jié)石的危險因素包括：性別（女性）、年齡、懷孕、早產(chǎn)、缺乏運動、肥胖和營養(yǎng)過剩，同時代謝綜合征（如糖尿病、甲亢等）的相關(guān)因素也增加了患膽結(jié)石的風險。

膽結(jié)石發(fā)病機制復雜，且不同成分類型的結(jié)石其形成機制不同。膽固醇結(jié)石的形成機制包括 5個方面，它們共同促進膽固醇結(jié)晶和膽石形成：(1) 遺傳因素和造石基因；(2) 肝膽固醇分泌過多；(3)膽汁過飽和及快速相變；(4) 膽囊運動減弱； (5) 腸道因素，包括腸道菌群因素。棕色素結(jié)石的形成機制包括：(1) 遺傳因素；(2) 肝臟膽紅素分泌過多；(3)膽汁淤積；(4) 細菌感染[21]。其中，細菌可能通過改變膽汁成分或減弱膽囊運動功能參與結(jié)石形成[17]。

綜上所述，膽結(jié)石疾病為多因素作用的結(jié)果，膽固醇結(jié)石及膽色素結(jié)石的形成過程中均有微生物及其代謝產(chǎn)物參與，在此基礎上我們對消化道微生態(tài)與不同類型膽結(jié)石的形成關(guān)系的研究進行整理歸納，以梳理其內(nèi)容并為未來的研究明確方向。

3 膽道微生態(tài)與膽結(jié)石疾病的關(guān)系

3.1 膽道微生物群參與膽結(jié)石形成的機制

早在一個世紀前就有學者[22]在膽結(jié)石患者的膽汁中培養(yǎng)出了多種細菌，推測膽道細菌感染可能參與結(jié)石的形成。50年后，Maki就細菌參與結(jié)石形成的機制提出了假說，即細菌產(chǎn)生的外源性β-葡萄糖苷酶（β-G）可將結(jié)合膽紅素水解為游離膽紅素和葡萄糖醛酸，游離膽紅素可與膽汁中的鈣離子結(jié)合形成膽紅素鈣，為膽色素結(jié)石的主要成分[23]。該結(jié)論在以犬為模型的動物實驗中被證實[24]。其后，有學者[25-27]發(fā)現(xiàn)細菌黏液中的黏蛋白可通過相互凝集構(gòu)成的網(wǎng)狀支架將膽汁中的膽紅素鈣、棕櫚酸鈣沉淀，甚至將細菌微菌落聚集在一起而形成結(jié)石。Stewart等[26]通過檢測棕色色素結(jié)石患者膽道內(nèi)的細菌源性β-G和細菌黏液（檢測率分別為62%和100%），提出在結(jié)石形成過程中，細菌產(chǎn)生的黏液可能比β-G具有更重要的作用。Robins等[27]研究報道，膽道感染細菌所產(chǎn)生的磷脂酶，可以通過水解磷脂生成的棕櫚酸與膽汁中的鈣離子結(jié)合形成不溶于水的棕櫚酸鈣沉淀，參與棕色素結(jié)石的形成。Shen等[28]采用WMS測序技術(shù)在膽總管結(jié)石患者感染的多種細菌中鑒定出了pldA基因，從基因水平證明細菌源性磷脂酶參與棕色色素結(jié)石的形成。以上眾多研究表明，膽道微生態(tài)在膽結(jié)石的形成過程中發(fā)揮著重要作用，主要通過細菌代謝產(chǎn)生的β-G、黏蛋白及磷脂酶參與膽結(jié)石的發(fā)病，當然仍有其他未知機制需要我們繼續(xù)探索。

3.2 膽道內(nèi)的微生物存在自我保護機制

多年來的傳統(tǒng)觀點認為，因膽汁的特殊理化性質(zhì)，如膽汁酸、營養(yǎng)限制、pH及滲透壓的變化均不利于細菌在膽道生長繁殖，導致正常膽道是無菌環(huán)境[29]。在發(fā)生膽道感染時，在膽道中定植的細菌存在著自我保護機制：(1) 細菌可通過形成抗原性弱的L型細菌（即細胞壁缺陷型變體）逃避機體免疫系統(tǒng)的攻擊，使其可在膽道中長期生存，使膽道持續(xù)處于慢性炎癥狀態(tài)中[30]；(2) 細菌生物膜為黏附于細菌表面的組成復雜的聚集體，其組成包括：黏液、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、多糖及核酸等；細菌可通過形成生物膜保護包裹于其中的微生物，嵌入生物膜內(nèi)的細菌對宿主的免疫清除、抗生素以及機械應力都具有高度抗性[31]。定植在膽道的細菌通過炎癥或改變膽道的運動功能引起一系列膽道疾病。

3.3 膽道微生物的來源

膽道感染的細菌從何而來？眾多研究者進行了探討。研究[10]采用16S rRNA擴增子測序技術(shù)，對6例膽結(jié)石患者的膽道、十二指腸、胃和口腔的細菌群落進行了研究。該研究首次在同一個體中進行比較研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有膽道細菌均可在上消化道檢出，膽道微生物群與十二指腸液樣本的相似度高于胃液或唾液樣本，支持了膽道細菌起源于腸道細菌逆行感染的假設。腸道細菌逆行感染到膽道（即腸膽反流）主要與Oddi括約肌的功能有關(guān)，Oddi括約肌的主要功能是控制膽汁排放、防止腸內(nèi)容物反流，當其功能異常時，腸內(nèi)容物反流至膽道，從而導致膽道細菌感染[32]。除此之外還有血源性、易位性多種學說, 各有其證據(jù),也可能同時并存[17]。

近年來，隨著對膽道微生態(tài)研究的深入及焦磷酸測序的應用，健康膽道無菌的觀點遭受了挑戰(zhàn)。Jiménez等[33]在健康豬的膽道發(fā)現(xiàn)有細菌存在。隨后Molinero等[34]針對從無肝膽疾病的肝移植供體的膽汁進行了分析，首次在沒有任何肝膽疾病的個體的膽汁中檢測到細菌群落。因此，我們可以認為，膽道本身存在一個微生態(tài)系統(tǒng)，在膽道疾病致病因素的作用下，這個微生態(tài)系統(tǒng)的平衡受到干擾而失衡，如優(yōu)勢菌群變化、菌群多樣性降低、微生物代謝改變等，通過具體的致病機制引發(fā)疾病。

4 腸道微生態(tài)與膽結(jié)石疾病的關(guān)系

4.1 腸道微生物與膽結(jié)石的形成有關(guān)

Wu等[17]首次采用16S rRNA擴增子測序（簡稱16S測序）技術(shù)對膽囊結(jié)石患者及健康者的膽汁及糞便進行研究，發(fā)現(xiàn)膽囊結(jié)石患者存在明顯的腸道菌群失調(diào)。Wang等[35]通過構(gòu)建小鼠膽固醇結(jié)石模型，得出數(shù)據(jù)顯示致石飲食（LD）喂食的小鼠腸道微生物的豐富度和多樣性降低。厚壁菌門以及厚壁菌門與擬桿菌門之比顯著降低。兩組間腸道菌群組成在門、科、屬水平上也存在差異。因此認為腸道菌群失調(diào)可能與小鼠膽固醇結(jié)石的形成密切相關(guān)。有學者[36]發(fā)現(xiàn)，膽囊切除改變流向腸道的膽汁，從而改變膽汁酸與腸道微生物之間的作用關(guān)系，即膽囊切除術(shù)后患者結(jié)石復發(fā)率高可能與腸道菌群的改變有關(guān)。從人類樣本和小鼠模型樣本均得出腸道微生物群與膽結(jié)石的形成相關(guān)的結(jié)論，但仍需更嚴謹?shù)膭游飳嶒瀬碜C明其正確性。

Maurer等[37]通過小鼠膽固醇結(jié)石模型探究T細胞功能在結(jié)石形成過程中的作用時，發(fā)現(xiàn)來自不同飼養(yǎng)機構(gòu)的BALB/c小鼠，膽固醇結(jié)石患病率不同。Fremont-Rahl等[38]就該現(xiàn)象提出假設：這些差異可能是因為這兩個機構(gòu)之間的飼養(yǎng)條件明顯不同導致的。Fremont-Rahl等[38]為探究在這些密切相關(guān)的小鼠亞系之間觀察到的膽固醇結(jié)石患病率的顯著差異是否與胃腸道常駐微生物群有關(guān)，進行了菌群移植實驗，其數(shù)據(jù)表明宿主微生物群的差異改變了膽固醇膽結(jié)石表型的成分，并且主要通過炎癥和改變膽囊運動功能來實現(xiàn)[38]。Fremont-Rahl等[38]通過更嚴謹科學的實驗方法再次證明腸道微生態(tài)參與膽結(jié)石的發(fā)病，并初步探討了其可能的發(fā)病機制。

4.2 腸道微生物參與膽結(jié)石形成的機制

針對腸道微生物通過何種途徑參與膽結(jié)石的形成，許多研究者為此進行了探索。一項關(guān)于腸道菌群失調(diào)與膽固醇膽結(jié)石相關(guān)的細菌群落組成的大規(guī)模研究中發(fā)現(xiàn)，膽結(jié)石患者的大約70%腸道細菌在膽道中被檢測到。因此他們認為腸道微生物可能通過逆行進入膽道引起膽道感染誘發(fā)結(jié)石發(fā)生[17]。

吳碩東團隊[39]發(fā)現(xiàn)在飲食誘導的金黃地鼠膽固醇結(jié)石模型中，出現(xiàn)了腸道運輸（IT）功能下降，表明腸道功能在膽固醇結(jié)石形成過程中可能起著重要的作用。該團隊進一步就豚鼠膽固醇結(jié)石形成過程中腸道轉(zhuǎn)運功能下降的細胞和分子機制進行了研究。結(jié)果提示高膽固醇飲食通過抑制c-kit/scf信號通路，導致豚鼠小腸卡哈爾間質(zhì)細胞（ICC）數(shù)量減少和功能障礙，導致小腸自發(fā)性節(jié)律性收縮功能障礙及IT功能下降，這參與了膽固醇結(jié)石的形成[40]。

正常情況下，大多數(shù)腸道細菌位于腸腔和外黏液層。在某些病理情況下，腸道細菌可能會破壞腸道上皮，通過門靜脈到達肝臟，即腸道細菌向肝臟易位[41]。Ma等[42]在一項研究腸道微生物群促進自身免疫性膽管炎的研究中發(fā)現(xiàn)，腸道微生物群驅(qū)動肝臟細菌易位，通過Toll樣受體2（TLR2）參與自身免疫性膽管炎的發(fā)病。

Liu等[43]通過實驗發(fā)現(xiàn)在接觸有機氯農(nóng)藥的小鼠中，腸道微生物群豐度和組成發(fā)生了異常，說明腸道微生物群會受到食物中毒素的影響，可能與膽結(jié)石的發(fā)病有關(guān)。最近的研究[44]表明，經(jīng)腸道微生物代謝食物中的膽堿等產(chǎn)生的三甲胺-N-氧化物（TMAO）可作用于肝臟引起膽汁膽固醇高分泌參與膽結(jié)石形成，證明了微生物可以通過影響代謝來參與疾病的發(fā)生。

綜上所述，腸道微生物可能存在多種通路參與膽結(jié)石的形成：(1) 腸道細菌逆行至膽道引起膽道慢性炎癥；(2) 在膽結(jié)石致病因素的作用下，腸道屏障受損，腸黏膜通透性增加，腸道微生物通過門靜脈到達肝臟，發(fā)生細菌肝臟易位；(3)微生物隨肝臟分泌膽汁進入膽道系統(tǒng)，破壞了膽道微生態(tài)的平衡，引起膽道感染從而誘發(fā)結(jié)石形成；(4) 易位到肝臟的微生物造成肝臟分泌膽汁的異常，膽汁代謝發(fā)生變化，如形成致石膽汁，從而引起膽結(jié)石形成；當然，還需要進一步更嚴謹?shù)膭游锬Ｐ蛯嶒瀬眚炞C以上假設。

5 小 結(jié)

越來越多的疾病的發(fā)生被認為與消化道微生態(tài)有關(guān)，而消化道微生態(tài)參與膽結(jié)石的形成也逐漸被眾多研究者認可。膽道中的微生物群存在自我保護機制，從而可以在膽道中長期生存，通過引起膽道慢性炎癥及微生物代謝產(chǎn)生的β-G、黏蛋白、磷脂酶等物質(zhì)誘導膽結(jié)石的產(chǎn)生。此外腸道微生物群通過逆行至膽道引起膽道感染、細菌易位、內(nèi)毒素血癥影響膽汁代謝等途徑參與膽結(jié)石形成。

消化道微生態(tài)參與膽結(jié)石形成的機制存在很大爭議，部分學者[45]認為腸道微生物群可以影響宿主免疫系統(tǒng)和代謝系統(tǒng)，但不會導致細菌移位或傳播，一定程度上否定了細菌易位學說。消化道微生物群落及其代謝產(chǎn)物容易受多種內(nèi)在及外界環(huán)境因素的影響而發(fā)生變化，因此，通過對糞便或膽汁中的菌群進行16SrRNA擴增子測序或代謝組學研究來表示腸道微生物群的多樣性，不一定與膽結(jié)石疾病表型相關(guān)，即這些實驗并不能說明消化道微生態(tài)與膽結(jié)石發(fā)生的因果關(guān)系，這需要更多更嚴謹?shù)募S便移植實驗來更好的說明。另外一個較大的挑戰(zhàn)是識別整個消化道微生態(tài)系統(tǒng)中某個微生物或微生物代謝物起到關(guān)鍵作用是很困難的。到目前為止，很多實驗的結(jié)果仍然是描述性的，其背后的機制還需要進一步了解。