楊文斌，李曉娜，管淑玉, *

1. 廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院（廣州 511400）；2. 國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥數(shù)字化質(zhì)量評(píng)價(jià)技術(shù)重點(diǎn)研究室（廣州 511400）

近年來(lái)，在保健食品中非法添加化學(xué)藥物及化學(xué)成分越來(lái)越復(fù)雜與隱蔽，這給消費(fèi)者帶來(lái)極大的安全隱患和危害，也給監(jiān)管部門帶來(lái)監(jiān)管困難與挑戰(zhàn)。2018年國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局（CFDA）公布的10起保健食品欺詐和虛假宣傳典型案例中，就有2起案件是關(guān)于減肥類保健食品非法添加酚酞與鹽酸西布曲明[1]。酚酞是化學(xué)品和臨床處方藥，主要用于治療習(xí)慣性、頑固性便秘。過(guò)量或長(zhǎng)期濫用，可造成人體電解質(zhì)代謝紊亂，嚴(yán)重時(shí)甚至可誘發(fā)心律失常，是國(guó)家明令禁止非法添加的非食用物質(zhì)[2]。一些不法商販為達(dá)到快速減肥的效果，在保健食品中非法添加酚酞。因此，針對(duì)減肥類保健食品中非法添加酚酞的情況，建立一種快速、穩(wěn)定、靈敏的檢測(cè)方法，具有重要意義。

目前，用于檢出非法添加酚酞的方法主要有拉曼光譜法、HPLC-DAD法、HPLC-MS/MS法等[3]。這些方法檢測(cè)儀器昂貴、操作繁瑣、專屬性低。而免疫分析方法，尤其是ELISA，技術(shù)操作簡(jiǎn)單快速、靈敏度高、不需要昂貴的儀器設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)。逐漸成為市場(chǎng)上檢測(cè)化合物有效手段之一。

傳統(tǒng)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法中，小分子半抗原與蛋白偶聯(lián)后通過(guò)疏水作用吸附在酶標(biāo)板上，而這種吸附作用會(huì)影響抗原與抗體的結(jié)合反應(yīng)[4-5]。小分子半抗原與蛋白偶聯(lián)的過(guò)程繁瑣，重復(fù)性較差，不利于檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)化。該方法將酚酞氨基化后通過(guò)戊二醛直接交聯(lián)于酶標(biāo)板微孔上，避免傳統(tǒng)ELISA檢測(cè)的缺點(diǎn)。對(duì)其主要影響因素如包被濃度、封閉條件、抗體稀釋度等進(jìn)行優(yōu)化，建立一種新型的檢測(cè)酚酞ELISA方法。

1 材料

1.1 儀器與試劑

酶標(biāo)儀（ELX800，BioTek Instruments）；低溫高速離心機(jī)（北京博勱行公司）；恒溫磁力攪拌器（JB-3，常州澳華公司）；AVANCE 500 MHz核磁共振儀（瑞士布魯克拜厄斯賓有限公司）。

脫脂奶粉（北京Solarbio公司，批號(hào)232100）；卵清蛋白（OVA，合肥博美生物科技公司，批號(hào)AL7514）；辣根過(guò)氧化物酶（HRP，標(biāo)記的羊抗鼠IgG，北京Solarbio公司，批號(hào)20180607）；96孔可拆卸酶標(biāo)板（上海斯信生物科技有限公司，批號(hào)171224-079）；酚酞（天津大茂，批號(hào)20160917）；濃硝酸（廣州化學(xué)試劑廠，20080601-1）；氨基乙酸（天津福晨化學(xué)試劑，20150205）免疫抗原（廣東工業(yè)大學(xué)制備，批號(hào)PHCB170302）；酚酞多克隆抗體血清（自制）；50%戊二醛（麥克林公司，批號(hào)M00318013）；連二亞硫酸鈉（天津永大化學(xué)試劑，20170804）；3, 3’, 5, 5’-四甲基聯(lián)苯胺（北京Solarbio公司，批號(hào)0759）。

1.2 溶液的配置

pH 7.4磷酸鹽緩沖液（PBS）：0.60 g NaH2PO4·2H2O和5.816 g Na2HPO4·12H2O，用蒸餾水定容至1 L；pH 9.6碳酸鹽緩沖液：1.59 g Na2CO3和2.93 g NaHCO3，蒸餾水定容至1 L；酶標(biāo)二抗稀釋液及洗滌液（PBST）：含0.05%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液；TMB顯色液：10 mg TMB+1 mL H2O+10 μL 30% H2O2配成顯色劑，取100 μL顯色劑加入至9.9 mL底物緩沖液（蒸餾水溶解0.51 g檸檬酸和1.84 g Na2HPO4·12H2O并定容至100 mL）中混勻即為TMB顯色液；終止液為2 mol/L濃硫酸。

2 方法與結(jié)果

2.1 氨基化酚酞的制備

稱取1 g酚酞溶解于20 mL丙酮并置于100 mL單口瓶中，加入1 mL濃硝酸，不停攪拌，將體系升溫至60℃，攪拌反應(yīng)12 h。反應(yīng)結(jié)束后，將20 mL水滴入到反應(yīng)液中，析出大量黃色晶體，經(jīng)過(guò)濾、用少許冷乙醇洗滌，烘干，過(guò)濾得到黃色固體a[6]。向100 mL三口瓶中加入0.5 g 3, 3’-二硝基酚酞、0.25 g無(wú)水碳酸鈉，向瓶中加入20 mL DMF、10 mL去離子水，快速攪拌溶解。在60～70 ℃溫度下，分批量加入1.5 g連二亞硫酸鈉。溶液由紅色逐漸變淡。加完料后升溫回流1 h。冷卻，過(guò)濾，用少量水沖洗殘留的鹽分，抽真空干燥得到灰白色固體b，合成路線見(jiàn)圖1。

圖1 氨基化酚酞的合成路線圖

化合物b1H-NMR譜峰由AVANCE 500 MHz核磁共振儀測(cè)得，如圖2所示。產(chǎn)物在δ=4.60時(shí)有一單峰，即為苯環(huán)氨基上的氫。δ=9.17時(shí)的峰為苯環(huán)上羥基氫。說(shuō)明應(yīng)用連二亞硫酸鈉已經(jīng)將苯環(huán)上硝基還原成氨基。

圖2 化合物b 1H-NMR圖譜

2.2 氨基化酚酞包被ELISA微孔板的制備

用pH 9.6碳酸鹽緩沖液（CBS）將50%戊二醛稀釋成6.5%，加入到酶標(biāo)板中，每孔200 μL，37 ℃孵育2 h。PBST洗滌3次。用DMF溶解氨基化酚酞并用PBS稀釋至4 μg/mL，加入酶標(biāo)板中，每孔100 μL，37 ℃孵育2 h。PBST洗滌后，用適當(dāng)濃度的氨基乙酸結(jié)合剩余的醛基部分，37 ℃孵育2 h。PBST洗滌3次后，加入5%脫脂奶粉，每孔200 μ L，進(jìn)行封閉，37 ℃孵育2 h，用PBST洗滌5次后，冰箱4 ℃保存[3-4]。包被原理見(jiàn)圖3。

圖3 氨基化酚酞包被微孔板的過(guò)程

2.3 酚酞間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA（ic-ELISA）檢測(cè)方法的研究

2.3.1 ic-ELISA檢測(cè)的一般步驟

在制備好的微孔板中加入一定濃度樣品及抗體，37 ℃孵育1 h。PBST洗滌5次，加入PBST稀釋1 000倍后的酶標(biāo)二抗，37 ℃孵育1 h，用PBST洗滌5次后，向酶標(biāo)板中加入每孔100 μ L的TMB顯色液，37 ℃孵育15 min后加入每孔50 μL 2 mol/L濃硫酸終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)測(cè)定OD值[7-8]。

2.3.2 封閉條件的優(yōu)化

在包被氨基酚酞的酶標(biāo)板上加入濃度分別為0.1，0.2，0.3，0.4和0.5 mol/L氨基乙酸，每孔200 μL。37 ℃孵育2 h后，5%脫脂奶粉37 ℃封閉2 h。PBST洗滌3次，加入PBS緩沖液，37 ℃孵育1 h，后續(xù)步驟同2.3.1。由圖4可知，氨基乙酸濃度0.1 mol/L時(shí)，酶標(biāo)二抗與酶標(biāo)板微孔的非特異性結(jié)合最低，確定0.1 mol/L的氨基乙酸為最佳封閉濃度。

圖4 封閉液的優(yōu)化

2.3.3 抗體稀釋液的篩選

為減少血清的非特異性結(jié)合，按上述最佳封閉條件，對(duì)戊二醛處理后的酶標(biāo)板進(jìn)行封閉。分別用1%卵清蛋白（OVA）、2.5%脫脂奶粉、PBST稀釋抗體血清，按2.3.1的步驟測(cè)定OD450nm值。結(jié)果見(jiàn)圖5，向抗體血清中加入一定量的脫脂奶粉可減少血清的非特異性結(jié)合，因此對(duì)脫脂奶粉濃度做進(jìn)一步考察。用PBS配置含0，1%，2%，3%，4%和5%脫脂奶粉作為抗體的稀釋液，在未包被氨基酚酞的酶標(biāo)板中進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖6。3%脫脂奶粉抗體稀釋液，有利于避免抗體血清的非特異性結(jié)合。

圖5 抗體稀釋液的選擇

圖6 脫脂奶粉濃度的篩選

2.3.4 最佳包被抗原及抗體稀釋度的確定

采用方陣滴定法確定包被抗原濃度、抗體稀釋倍數(shù)。包被原氨基化酚酞質(zhì)量濃度為2，3，4，5和6 μ g/mL。抗體血清由1︰50倍比稀釋至1︰1 600。采用間接非競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定OD450nm值。通過(guò)間接非競(jìng)爭(zhēng)ELISA確定最佳包被濃度及抗體的稀釋倍數(shù)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。為確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性及方便分析，一般選取OD450nm值1左右。ic-ELISA檢測(cè)時(shí)血清的量為50 μL，因此選OD450nm值2.0左右。由表1可知，氨基酚酞質(zhì)量濃度4 μ g/mL、抗體血清稀釋倍數(shù)1︰100時(shí)，OD450nm=2.017，即包被抗原的最佳質(zhì)量濃度4 μg/mL，抗體的最佳稀釋倍數(shù)1︰100。

表1 方陣滴定法確定工作濃度

2.3.5 樣品溶劑篩選及TMB顯色時(shí)間的優(yōu)化

將酚酞分別溶解于二甲基亞砜（DMSO）、二甲基甲酰胺（DMF）、甲醇、乙醇試劑中，配置成50 ng/mL的溶液。在未包被氨基酚酞的酶標(biāo)板中加入樣品與多克隆抗體，同2.3.1的步驟測(cè)定OD450nm值。發(fā)現(xiàn)DMSO、DMF可破壞封閉液，導(dǎo)致抗體的非特異性結(jié)合增加，而甲醇與乙醇影響較小，因此首選乙醇作為樣品的溶劑。

2.3.6 ic-ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

配置0.1，1，10，100，1 000和10 000 ng/mL酚酞標(biāo)準(zhǔn)品溶液，由確定的各因素最佳值進(jìn)行間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)，按2.3.1的步驟測(cè)定OD450nm值。以酚酞標(biāo)準(zhǔn)品的濃度作為橫坐標(biāo)，B/B0值作為縱坐標(biāo)構(gòu)建ic-ELISA曲線。如圖7所示。酚酞質(zhì)量濃度在10～1 000 ng/mL區(qū)間線性較好。分別測(cè)定質(zhì)量濃度為10，50，100，200，400，800和1 000 ng/mL酚酞標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度，以酚酞濃度的對(duì)數(shù)值作為橫坐標(biāo)，以抑制率作為橫坐標(biāo)得到標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖8）。擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線得到方程為y=38.795x-22.554，R2=0.980 2，檢測(cè)范圍IC20～I(xiàn)C80為（12.50～439.93 ng/mL）酚酞的IC50=74.15 ng/mL。說(shuō)明酚酞多克隆抗體靈敏度較高。

圖7 ic-ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線點(diǎn)的確定

圖8 酚酞抗體血清抑制率標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.7 精密度試驗(yàn)

酚酞標(biāo)準(zhǔn)品溶液質(zhì)量濃度為30，150和300 ng/mL。按照2.3.6建立的ic-ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)平行孔進(jìn)行精密度檢測(cè)。得到該方法的精密度RSD，為4.5%～9.3%。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同質(zhì)量濃度酚酞溶液的檢測(cè)精密度（n=4）

2.3.8 加標(biāo)回收率

配制質(zhì)量濃度為30，150和300 ng/mL酚酞標(biāo)準(zhǔn)品溶液。按照2.3.6建立的ic-ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)。計(jì)算酚酞的加標(biāo)回收率及變異系數(shù)RSD。由表3可知，在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，加入30，150和300 ng/mL的酚酞標(biāo)準(zhǔn)液，每個(gè)濃度測(cè)定3次。測(cè)定的平均回收率為89.76%，變異系數(shù)RSD=7.96%。說(shuō)明在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，該方法用于檢測(cè)酚酞的含量具有準(zhǔn)確性與重復(fù)性。

表3 不同質(zhì)量濃度酚酞溶液的回收率測(cè)定結(jié)果（n=3）

3 討論與結(jié)論

通過(guò)氨基化酚酞直接包被酶標(biāo)板，建立酚酞含量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線。該方法消除包被過(guò)程中，載體蛋白構(gòu)象改變導(dǎo)致小分子半抗原與抗體結(jié)合力下降的因素，且不需要制備包被抗原。因此直接偶聯(lián)ELISA更利于檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)化及檢測(cè)的穩(wěn)定性。為減少抗體血清的非特異性結(jié)合，用0.1 mol/L氨基乙酸結(jié)合微孔板上多余的醛基。對(duì)抗體稀釋液進(jìn)行優(yōu)化，3%脫脂奶粉可有效避免抗體血清的非特異性結(jié)合。試驗(yàn)建立的酶聯(lián)免疫方法與儀器檢測(cè)方法相比操作更簡(jiǎn)便、費(fèi)用更低，可快速測(cè)定大批量樣品。在市場(chǎng)監(jiān)督酚酞的非法添加中具有應(yīng)用價(jià)值。