李冰 云哲琳 董長(zhǎng)城

研究發(fā)現(xiàn)，PD1/PD-L1信號(hào)通路主要作用于細(xì)胞的增殖和分化過(guò)程，由于腫瘤細(xì)胞的增殖及分化過(guò)程均有別于正常細(xì)胞，故該通路與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[1-3]。有研究發(fā)現(xiàn)PD1和PD-L1在胃癌、乳腺癌等惡性腫瘤中存在高表達(dá)，其可能參與疾病發(fā)生和發(fā)展過(guò)程[4-6]。但關(guān)于PD1和PD-L1在肝癌中的表達(dá)及意義的研究鮮見(jiàn)。本研究對(duì)肝癌組織中PD1和PD-L1的表達(dá)水平進(jìn)行分析，并探討其與病理特征間的相關(guān)性。

資料與方法

一、一般資料

選取2015年1月-2018年12月內(nèi)蒙古包鋼醫(yī)院就診的80例肝癌患者作為研究對(duì)象。排除：排除標(biāo)準(zhǔn)為：合并重大惡性腫瘤者；合并精神疾病、心理疾病患者。其中男38例，女42例；年齡21～65歲，平均年齡(37.3±2.9)歲; 腫瘤直徑(0.4～6.8 cm)，平均腫瘤直徑(3.32 ± 0．22) cm。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者自愿簽署知情同意書(shū)。

二、方法

(一)RT-PCR檢測(cè) PD1和PD-L1 mRNA的表達(dá)水平 提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄， SYBR green染料法進(jìn)行定量，以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參。引物：(PD1-F: 5′-ATCTCACCGCTCGTTT-CCT-3′ ; PD1-R: 5′-CACTGCAAACCTCGGTGATG-3′; PD-L1-F: 5′-GGTA ATCCGTTTCCCTTGA-3′ ; PD-L1-R: 5′-CCTAATTTATGAGCC-TATC-3′ ; GAPDH-F: 5′-GGTAG-AACGTCCGTGTTTCA-3′ ; GAPDH-R: 5′-TTCAGTCCCA-GTCATGGAAC-3′)。

PCR反應(yīng)程序:在98 ℃下進(jìn)行30 s的預(yù)變性，接著在98 ℃下進(jìn)行10 s的變性，再在50 ℃下進(jìn)行30 s的退火，最后在72 ℃下進(jìn)行45 s延伸，一共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。

(二) Western blot檢測(cè)和PD1和PD-L1蛋白的表達(dá)水平 采用BCA試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)含量，上樣20 μg，凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉2 h，分別孵育PD1和PD-L1一抗，4℃過(guò)夜，洗膜，孵育二抗，顯影。

(三)免疫組化檢測(cè)PD1和PD-L1蛋白表達(dá)水平 所有腎透明細(xì)胞癌患者的腫瘤組織作為腎透明細(xì)胞癌組標(biāo)本，其相應(yīng)的臨近非腫瘤組織樣本(距離腫瘤組織2 cm以上)作為非腫瘤組織組標(biāo)本。取病理石蠟標(biāo)本，切片6張。用5%血清進(jìn)行室溫封閉40 min后，加入1∶1 000的單克隆抗體4℃過(guò)夜孵育。隔天加入1∶1 000的二抗，在37℃孵育30 min，顯色，封片。拍照，收集數(shù)據(jù)并計(jì)算圖片中PD1和PD-L1蛋白表達(dá)的平均光密度。

三 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用t檢驗(yàn)分析2組間計(jì)量資料的比較。采用卡方檢驗(yàn)分析兩組間計(jì)數(shù)資料的比較。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、 PD1和PD-L1 mRNA和蛋白表達(dá)水平結(jié)果

RT-PCR結(jié)果表明肝癌組PD1和PD-L1 mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組均升高(P<0.05)。Western blot 結(jié)果表明肝癌組PD1和PD-L1蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組升高(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 PD1和PD-L1 mRNA表達(dá)水平灰度比值結(jié)果(±s)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

二、免疫組化檢測(cè)PD1和PD-L1蛋白水平

采用免疫組化方法檢測(cè)組織中PD1和PD-L1表達(dá)陽(yáng)性率，肝癌組PD1蛋白表達(dá)陽(yáng)性率高于對(duì)照組(50.00%>31.25%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。肝癌組PD-L1蛋白表達(dá)陽(yáng)性率高于對(duì)照組(72.50%>37.50%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

三、 PD1和PD-L1表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系

統(tǒng)計(jì)分析證實(shí)PD1表達(dá)與肝癌患者腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。PD-L1表達(dá)與肝癌患者腫瘤直徑密切相關(guān)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 PD1和PD-L1與患者臨床病理學(xué)特征關(guān)系分析

討 論

PD1/PD-L1信號(hào)通路與腫瘤細(xì)胞的增殖分化密切相關(guān)，PD1和PD-L1是一種與乳腺癌、結(jié)腸癌和胃癌等相關(guān)的腫瘤標(biāo)志物[7-8]。Colette等[9]研究發(fā)現(xiàn)，PD1/PD-L1信號(hào)通路與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Liu等[10]研究表明，與非腫瘤組織相比，乳腺癌腫瘤組織的PD1和PD-L1的基因，蛋白表達(dá)陽(yáng)性率均升高。但關(guān)于PD1和PD-L1在肝癌中的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系研究較少。

本研究結(jié)果顯示，與非腫瘤組織相比，肝癌組PD1和PD-L1的基因，蛋白表達(dá)陽(yáng)性率均升高，提示肝癌患者腫瘤組織中PD1和PD-L1高表達(dá)。統(tǒng)計(jì)分析證實(shí)PD1表達(dá)與肝癌患者腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，PD-L1表達(dá)與肝癌患者腫瘤直徑密切相關(guān)，結(jié)果提示PD1和PD-L1可以作為肝癌患者病情評(píng)估的標(biāo)志物。

綜上所述，PD1和PD-L1在肝癌中表達(dá)顯著增高，且可能與肝癌發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后相關(guān)，但還需要更多大樣本的臨床研究、前瞻性研究來(lái)驗(yàn)證。