張小玉 張紅梅 王雷 臧志棟

原發(fā)性膽汁性膽管炎(primary biliary cholangitis，PBC)是一種自身免疫介導的慢性膽汁淤積性肝病，臨床表現(xiàn)以血清抗線粒體抗體(AMA)陽性、IgM升高，組織病理學特征表現(xiàn)為小葉間膽管為中心的炎性細胞浸潤、小膽管增生以及膽汁淤積，可慢性進展至肝纖維化，最終導致肝硬化。由于PBC 患者在發(fā)病初期缺乏明顯的臨床表現(xiàn)，大多數(shù)病人確診時已到了病程晚期，治療非常困難, 且PBC在我國的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，由此研究PBC的病因和發(fā)病機制，具有十分重要的意義[1]。

CD4+T淋巴細胞在PBC的致病過程中發(fā)揮著重要作用, 在不同細胞因子的刺激下可分化為不同亞群，包括輔助性T淋巴細胞Th1、Th2、Thl7及調(diào)節(jié)性T淋巴細胞(Treg) 等[2]，Th17是新發(fā)現(xiàn)的一種CD4+T淋巴細胞亞型，以分泌 IL-17為特征，在自身免疫性疾病中扮演著十分重要的角色[3]。 研究表明 Thl7細胞的分化與多種細胞因子密切相關，特別是IL-22、和IL-23等在誘導時起到了十分重要的作用[4]。本項目是研究CD4+T淋巴細胞/ Th17在原發(fā)性膽汁性膽管炎患者外周血單個核細胞中的表達，以初步探討Thl7等細胞因子與PBC疾病的發(fā)生及疾病分期以及發(fā)展的關系。

資料與方法

一、病例選擇

選擇病例來自2018 年 7 月至 2019 年 7 月在南京市第二醫(yī)院(南京市中醫(yī)藥大學附屬南京醫(yī)院)收治的患者，共24 例，其中女性 20例,男性 4 例，年齡35～60歲，平均年齡48.32歲。根據(jù)2009年美國肝病學會診斷標準和歐洲肝病學會診斷標準，診斷 PBC 需符合下列 3項診斷標準中的兩項：(1)血清抗線粒體抗體(AMA)陽性；(2)血清堿性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)和(或)谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(gamma-glutamyltransferase，GGT)水平升高；(3)肝臟典型病理改變。所有患者均排除了病毒性肝炎及藥物性肝病等慢性肝臟疾病，同時征得病人本人同意后，簽署知情同意書，所有患者給與肝穿刺活檢，在腹部彩超的引導下行肝臟穿刺活檢術，采用統(tǒng)一標準閱片，根據(jù) Scheuer 評分系統(tǒng)對標本進行病理分期：Ⅰ期為小膽管炎期，Ⅱ期為細小膽管增生期，Ⅲ期為瘢痕期，Ⅳ期為肝硬化期。選取同期肝血管瘤切除標本的遠端正常肝組織作為正常對照組，男性13例，女性11例，年齡32～60歲，平均年齡52.25歲，兩組人員具有可比性。固定肝穿組織分別送南京中醫(yī)藥大學附屬南京醫(yī)院病理教研室一份，另一份南京中醫(yī)藥大學附屬南京醫(yī)院肝病研究所。

二、研究方法

(一)抽取研究對象外周靜脈血5 mL，采用統(tǒng)一方法利用流式細胞儀檢測患者血CD4+T淋巴細胞/ Th17細胞比值，血生化檢測研究對象的肝功能，檢測ALP、GGT等的數(shù)值。

(二)外周血單個核細胞的分離與培養(yǎng)：抽取患者外周靜脈血5 mL，PBS稀釋后，以血：Ficoll為1∶2的比例將血標本緩慢加入到Ficoll試劑中，400 g，離心30 min，吸取白色薄膜層到新的離心管中，用PBS洗兩次后重懸計數(shù)。將分離的PBMC置于含有10 mL/dL FBS的1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，不加刺激，收集上清進行細胞因子測定。

(三)細胞因子檢測采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA)檢測樣本血清中IL-23、IL-17的表達水平。ELISA試劑盒購自中國上海Arigo公司。實驗操作方法嚴格按照試劑盒說明書進行。

三、統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

一、PBC組與對照組外周血及肝組織中 CD4+T淋巴細胞/ Th17的比較

表1顯示，與HC組比較，PBC組外周血、肝組織中CD4+T淋巴細胞/ Th17值表達量明顯高于HC組(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。

表1 PBC組與對照組肝組織中 CD4+T

與HC組比較，▲P<0.05

二、PBC組與對照組Th17 、IL-17、IL-23、等細胞因子濃度的比較

表2顯示，與HC組比較，PBC組的Th17 、IL-17、IL-23、水平顯著增高(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義；與HC組比較， TGF-β表達水平也增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；

三、Th17 、IL-17、IL-23、TGF-β水平與ALT、TBil、GGT、ALP、AST的比較

血清Thl7相關細胞因子水平與各項臨床及實驗室指標的相關性分析如表3所示，與ALT、Tbil、GGT、ALP、AST、呈正相關(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。

四、CD4+T淋巴細胞/Th17及IL-17在PBC Ⅰ-Ⅱ期和PBCⅢ-Ⅳ期中的比較

PBC患者PBCⅢ-Ⅳ期肝組織和外周血中CD4+T淋巴細胞/ Th17數(shù)值明顯比PBC Ⅰ-Ⅱ期值升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且IL-17表達在PBC Ⅰ-Ⅱ期和PBCⅢ-Ⅳ期血清量差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表4。

表2 各組血清CD4+T相關細胞因子水平比較(±s)

與HC組比較，▲P<0.05

表3 各組血清Thl7相關細胞因子水平與臨床及實驗室指標相關性分析

▲：P<0.05：▲▲：P<0.01

表4 PBC Ⅰ-Ⅱ期和PBC Ⅲ-Ⅳ期2組間比較(±s)

討 論

原發(fā)性膽汁性膽管炎(primary biliary choloangitis,PBC )是一種以肝臟為相對特異性免疫病理損傷器官的自身免疫性疾病，全球范圍內(nèi)40歲以上的女性發(fā)病率約為1/1 000，我國的流行病學調(diào)查結(jié)果表明，中年女性的發(fā)病率為155.8/10萬[1],。PBC病理特點為進行性、非化膿性肝內(nèi)小膽管炎，以瘙癢、黃疸為主要表現(xiàn)，到疾病晚期可產(chǎn)生腹水、消化道出血及肝性腦病、最后發(fā)展為肝衰竭。臨床上90%～95%的PBC患者血清中可以檢測出高滴度的抗線粒體抗體(AMA)， PBC發(fā)病機制至今尚未完全闡明，Harada等應用病原相關分子模式(PAMP)刺激膽管上皮細胞發(fā)現(xiàn)也能夠產(chǎn)生Thl7誘導因子(IL-6、IL-1B、IL-23)[6-7]。最近一項研究：敲除IL-17A的小鼠膽管損害減輕、AMA抗體和IFN水平顯著降低；敲除IL-22的PBC小鼠也出現(xiàn)了膽管損害減輕和IFN水平下降。另外，在PBC小鼠模型中IL-23/Thl7通路也促進了IL-12/IFN介導的免疫病理損傷過程[8-9]。

本研究表明PBC患者的肝組織和血清中CD4+T淋巴細胞/ Th17及細胞活化因子IL-17、IL-23水平與健康人群相比均顯著升高，通過相關性分析，我們的研究表明PBC患者的ALP、GGT、IgG表達量明顯提高，各血漿細胞因子IL-17、IL-23表達量與各項臨床及實驗室指標ALT、TBil、GGT、ALP、AST、呈正相關(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。外周血及肝組織中CD4+T淋巴細胞/ Th17及IL-17在PBC Ⅲ-Ⅳ期中的數(shù)值明顯高于PBC I-Ⅱ期，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，這與眾多的研究結(jié)果一致[10]，反映出PBC患者存在膽汁淤積、膽管堵塞以及不同程度的肝細胞損傷和肝功能下降的情況。表明CD4+T淋巴細胞尤其是輔助性T淋巴細胞Thl7參與了PBC的炎癥反應過程，可能在PBC疾病過程中發(fā)揮了重要作用。

我們的研究結(jié)果提示PBC患者受損的門管區(qū)及外周血中存在大量的CD4+T淋巴細胞浸潤，CD4+T淋巴細胞/ Th17、IL-17在PBC的發(fā)生過程中具有重要作用，CD4+T細胞的異?；罨驮鲋吃赑BC發(fā)病過程中起了十分重要的作用，參與其細胞因子介導的伴有AMA形成的自身免疫過程，我們期待在通過對PBC發(fā)生發(fā)展機制的研究過程中通過復雜的免疫學調(diào)控網(wǎng)絡找到更多的方向和證據(jù)，為臨床患者帶來希望和健康保障。