黃翀 鄭雅慧 張巨波

肝纖維化是病毒性肝炎、酒精性肝病等各種慢性肝損傷后肝臟的創(chuàng)傷愈合反應(yīng)，其特征為肝臟中過量細(xì)胞外基質(zhì)蓄積，破壞肝組織結(jié)構(gòu)和功能，是慢性肝病發(fā)展至肝硬化的必經(jīng)病理階段[1-6]。最新全球疾病負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，2017年超過132萬人死于各種慢性肝病及相關(guān)肝硬化，造成了嚴(yán)重的社會經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[7]。因此當(dāng)前亟待闡明肝纖維化的發(fā)病機(jī)制，制訂有效的抗纖維化治療策略，改善患者預(yù)后。

資料與方法

一、數(shù)據(jù)來源

本研究芯片數(shù)據(jù)下載自GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed)。GSE19865芯片采用GPL8824平臺(Agilent-019119 Mouse miRNA Microarray 1.0 G4472A)，包含3只橄欖油處理小鼠及5只四氯化碳處理小鼠。GSE66278芯片采用GPL17017平臺(TaqMan Rodent microRNA A array v 2.0),包含2只正常小鼠及6只四氯化碳處理小鼠。

二、芯片分析及差異miRNA篩選

miRNA芯片分析采用數(shù)據(jù)庫自帶軟件GEO2R(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r)。GSE19865芯片以橄欖油處理組為對照組，四氯化碳處理組為肝纖維化組進(jìn)行分析。GSE66278以正常小鼠為對照組，四氯化碳處理組為肝纖維化組進(jìn)行分析。選取P<0.05且差異倍數(shù)|logFC|≥0.585為條件篩選差異 miRNA。

三、miRNA靶基因預(yù)測

miRNA靶基因預(yù)測采用TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_72/)及microT-CDS(http://diana.imis.athena-innovation.gr/DianaTools/index.php?r=microT_CDS/index)兩款在線軟件進(jìn)行分析，預(yù)測結(jié)果取交集得到miRNA靶基因。

四、靶基因功能分析

利用Cytoscape 軟件(version 3.5.1)的ClueGO插件對靶基因進(jìn)行功能分析，包括Gene Ontology(GO) biological process, GO molecular function以及Reactome pathway分析，對P<0.05的富集結(jié)果通過Cytoscape進(jìn)行可視化。

結(jié) 果

一、差異microRNA

通過GEO2R進(jìn)行芯片分析，按P<0.05且差異倍數(shù)|logFC|≥0.585為條件篩，GSE19865芯片中miRNA上調(diào)37個，下調(diào)0個；GSE66278芯片中miRNA上調(diào)19個，下調(diào)18個，見表1。兩組芯片中表達(dá)均上調(diào)的miRNA為mmu-miR-802，見圖1A，其在不同芯片中的表達(dá)水平見圖1B。

二、miRNA靶基因

TargetScan預(yù)測得到mmu-miR-802潛在靶基因250個，microT-CDS預(yù)測分析顯示mmu-miR-802潛在靶基因?yàn)?66個，通過對兩款軟件預(yù)測結(jié)果取交集得到mmu-miR-802靶基因138個，見圖2。

三、靶基因Pathway分析及GO分析

通過Cytosccape插件ClueGO對138個靶基因進(jìn)行功能分析，結(jié)果顯示上述基因顯著富集于22條Reactome pathway，36種生物學(xué)過程及21種分子功能，見圖3。其中富集最顯著的前10位的信號通路為：Mitochondrial biogenesis, Signaling by TGF-beta receptor complex, PKMTs methylate histone lysines, Toll like receptor (TLR) 4 cascade, MyD88:MAL(TIRAP) cascade initiated on plasma membrane, MyD88-independent TLR4 cascade, TLR9 cascade, TLR10 cascade, TLR3 cascade, TLR5 cascade; 富集最顯著的前10位生物學(xué)過程包括Histone-lysine N-methyltransferase activity, Regulation of nucleobase-containing compound transport, Wnt signaling pathway, calcium modulating pathway, Activation of JUN kinase activity, Response to gamma radiation, Circadian regulation of gene expression, Cellular response to glucose starvation, Protein neddylation, Adipose tissue development, Cellular response to amino acid stimulus; 富集最顯著的前10位分子功能包括Protein self-association, Thyroid hormone receptor binding, Positive regulation of lipase activity, Positive regulation of JUN kinase activity, Activation of JUN kinase activity, Poly-Pyrimidine tract binding, Poly(U) RNA binding, Histone methyltransferase activity, Protein-lysine N-methyltransferase activity, Lysine N-methyltransferase activity。

四、靶基因PPI網(wǎng)絡(luò)分析

將138個靶基因上傳至NetworkAnalyst網(wǎng)站(http://www.networkanalyst.ca/)，選擇STRING數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白相互作用分析，生成蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，見圖4。如圖所示，根據(jù)蛋白相互作用的程度，鑒定出網(wǎng)絡(luò)中包含8個關(guān)鍵基因：YWHAE，PPP2CA， RHOA， FOS， PSMD2，CDK19，ATF2，PAFAH1B1。

圖1A 韋恩圖顯示基因芯片GSE19865及GSE66278中差異基因分布情況，右側(cè)為具體基因名稱，紅色標(biāo)注的miR-802為兩組芯片中表達(dá)均上調(diào)的miRNA B miR-802在兩組芯片不同樣本中的表達(dá)水平

圖2 韋恩圖顯示同時被TargetScan及microT-CDS預(yù)測到的miR-802靶基因有138個

討 論

肝纖維化的發(fā)生是促纖維化因子刺激下各種信號通路相互作用的復(fù)雜過程，涉及眾多基因表達(dá)的調(diào)控，包括表觀遺傳學(xué)調(diào)控[8]。本研究通過GEO數(shù)據(jù)庫獲取肝纖維化miRNA芯片GSE19865及GSE66278，利用差異基因在線分析工具GEO2R獲取差異表達(dá)miRNA，通過取交集得到肝纖維化模型中表達(dá)上調(diào)的miRNA，即miR-802。通過綜合TargetScan及microT-CDS軟件預(yù)測結(jié)果，得到138個靶基因。通路分析顯示，這些靶基因主要參與線粒體生成，TGF-beta信號通路，組蛋白賴氨酸甲基化，Toll樣受體信號傳導(dǎo)等；生物學(xué)過程分析提示靶基因主要參與組蛋白賴氨酸甲基化，堿基轉(zhuǎn)運(yùn)，Wnt及鈣調(diào)通路，JUN 激酶活化，基因表達(dá)的晝夜調(diào)控，葡萄糖饑餓的細(xì)胞應(yīng)答， 蛋白類泛素化修飾，脂肪組織發(fā)育及細(xì)胞對氨基酸刺激的應(yīng)答；此外分析提示靶基因的分子功能包括結(jié)合甲狀腺激素受體，正向調(diào)控脂肪酶活性，正向調(diào)控JUN 激酶活性，組蛋白甲基化等。

通過蛋白間相互作用分析，發(fā)現(xiàn)了8個位于調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中心的關(guān)鍵蛋白： YWHAE、PPP2CA、 RHOA、FOS、PSMD2、CDK19、ATF2、PAFAH1B1。RHOA是Rho家族一員，屬于小分子GTP酶，是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子開關(guān)之一，在細(xì)胞增殖、遷移、黏附等過程中發(fā)揮重要作用。已有研究表明，RhoA能夠調(diào)控潛伏態(tài)TGF-β1分泌，并能影響Ⅰ型膠原表達(dá)[9,10]。研究發(fā)現(xiàn)，活性增強(qiáng)能夠促進(jìn)肝星狀細(xì)胞活化，加重肝纖維化[11]。YWHAE是信號通路中重要的接頭蛋白，通過結(jié)合含有磷酸絲氨酸的蛋白介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。既往研究發(fā)現(xiàn)，YWHAE能夠調(diào)控神經(jīng)元形態(tài)發(fā)生[12]。此外，YWHAE能夠阻止小鼠受精卵由G2期進(jìn)入M期[13]，YWHAE在肝纖維化中的作用有待進(jìn)一步研究。PPP2CA是蛋白磷酸酶2 A的催化亞基，蛋白磷酸酶2 A是最主要的絲/蘇氨酸磷酸酶之一，參與細(xì)胞生長及分化的負(fù)向調(diào)控。前列腺癌時，PPP2CA能夠逆轉(zhuǎn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的生長及轉(zhuǎn)移[14]。PPP2CA能夠抑制甲狀腺癌細(xì)胞的遷移及侵襲[15]，PPP2CA在肝纖維化中的作用目前尚未見報道。FOS能夠與JUN家族蛋白二聚化形成轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體，從而調(diào)控細(xì)胞增殖、分化及轉(zhuǎn)化等過程，此外，某些情況下FOS表達(dá)與細(xì)胞凋亡相關(guān)。早期研究發(fā)現(xiàn)，c-FOS能夠促進(jìn)增殖性疾病如肺癌、間皮瘤及肺纖維化等發(fā)展，而抑制蛋白激酶C能夠減少c-FOS表達(dá)，有望阻止疾病進(jìn)展[16]。c-FOS表達(dá)見于丙型肝炎病毒感染患者，且其表達(dá)與肝纖維化分期及肝炎癥分級相關(guān)[17]。高糖可以誘導(dǎo)FOS表達(dá)，促進(jìn)TGF-beta1產(chǎn)生，從而導(dǎo)致腹膜纖維化的發(fā)生[18]。在心肌成纖維細(xì)胞中，c-FOS能夠誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白過表達(dá)，引起心臟纖維化[19]，在肝纖維化中FOS是否發(fā)揮類似作用有待明確。PSMD2為26S蛋白酶體的非催化亞基之一，蛋白酶體主要參與蛋白質(zhì)降解。既往研究發(fā)現(xiàn)，敲低PSMD2表達(dá)能夠減弱蛋白酶體活性，抑制肺癌細(xì)胞生長，誘導(dǎo)其凋亡[20]。PSMD2通過增強(qiáng)蛋白酶體對p21及p27的降解，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖生長[21]。在輻射導(dǎo)致的皮膚纖維化大鼠模型中，通過蛋白組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，包括PSMD2在內(nèi)的多個蛋白酶體亞基異常表達(dá)，提示靶向泛素-蛋白酶體系統(tǒng)或能有效治療皮膚纖維化[22]。目前，尚無報道闡明PSMD2在肝纖維化中的作用。CDK19屬于周期蛋白依賴性激酶之一，在多種細(xì)胞生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用，包括脂質(zhì)代謝調(diào)控及發(fā)育生物學(xué)等[23]。CDK19能夠促進(jìn)NF-κB介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄[24]。在多種腫瘤中，CDK19通過誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移[25]，然而CDK9介導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是否參與肝纖維化的發(fā)生目前仍不清楚。ATF2為作為轉(zhuǎn)錄因子能夠結(jié)合DNA，該過程依賴于ATF2形成同源二聚體或與c-Jun形成異源二聚體，激活CRE依賴的轉(zhuǎn)錄過程。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ATF2還具有組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性，能夠特異性介導(dǎo)組蛋白H2及H4乙?；痆26]。早期研究發(fā)現(xiàn)，博來霉素能夠促進(jìn)ATF2磷酸化，進(jìn)而介導(dǎo)肺纖維化的發(fā)生[27]。在心臟纖維化中，去甲腎上腺素能夠增強(qiáng)TGF-beta1對ATF2的磷酸化作用，促進(jìn)心臟纖維化進(jìn)展[28]。ATF2是否影響肝纖維化有待進(jìn)一步證實(shí)。PAFAH1B1是血小板活化因子乙酰水解酶的非催化亞基，又稱LIS1，該基因突變或缺失會導(dǎo)致無腦回綜合癥。研究發(fā)現(xiàn)，YWHAE及PAFAH1B1基因微缺失會導(dǎo)致獨(dú)特的腦白質(zhì)病變[29]。此外，研究表明PAFAH1B1基因單倍體不足會擾亂齒狀回GABA神經(jīng)元，破壞突觸的興奮/抑制平衡[30]。在肝臟內(nèi)，PAFAH1B1缺失會誘發(fā)脂肪肝，并加速小鼠肝癌的發(fā)生[31]，但其在肝纖維化中的具體作用有待進(jìn)一步探索。

A Reactome 通路分析 B GO生物學(xué)過程分析 C GO分子功能分析

圖3miR-802靶基因功能分析

圖4 基于STRING數(shù)據(jù)庫的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

本研究從GEO數(shù)據(jù)庫獲取不同肝纖維化基因芯片，通過差異表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)miR-802在纖維化組表達(dá)顯著上調(diào)。通過結(jié)合不同軟件進(jìn)行靶基因預(yù)測，得到了138個潛在的miR-802靶基因。隨后，借助生物信息學(xué)軟件，對這些靶基因的功能進(jìn)行了富集分析，發(fā)現(xiàn)多條信號通路及生物學(xué)過程參與了肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。最后，通過蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn)了8個核心基因，其中RHOA能夠通過調(diào)控潛伏態(tài)TGF-beta1分泌及I型膠原表達(dá)參與肝纖維化。FOS，ATF2在肺纖維化及心臟纖維化發(fā)揮一定作用，PSMD2參與了皮膚纖維化的發(fā)生，PAFAH1B1能夠誘發(fā)脂肪肝的發(fā)生，這些基因在肝纖維化中的作用有待進(jìn)一步闡明，而YWHAE，PPP2CA，CDK19目前尚無纖維化性疾病或肝臟疾病中的相關(guān)報道，但其在肝纖維化中的潛在作用值得關(guān)注和探索。