李秋鴻，黃清松，毛建文

(廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院/廣東省生物活性藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006)

人胚胎干細(xì)胞(hESCs)來源于人囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，在體外培養(yǎng)時(shí)具有自我更新和多向分化的潛能，其體外分化的過程可再現(xiàn)早期胚胎發(fā)育的各個(gè)階段[1-3]。定型內(nèi)胚層細(xì)胞是包括甲狀腺、肺、胰腺、肝臟和腸道在內(nèi)等器官的胚胎前體[4]。不管是脊椎動(dòng)物的體內(nèi)胚胎發(fā)育還是人多能干細(xì)胞的體外定向分化，定型內(nèi)胚層的產(chǎn)生都必須依賴于TGF-β/nodal/activin信號(hào)通路的激活[5]。該信號(hào)通路的激活往往伴隨著細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)的發(fā)生，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，表現(xiàn)為細(xì)胞形態(tài)、黏附和遷移能力等方面的變化[6-9]。在體外，將人胚胎干細(xì)胞定向分化為定型內(nèi)胚層[10]或中胚層[11]的過程中都可以檢測出與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)有關(guān)的表面蛋白表達(dá)發(fā)生變化，例如E-cadherin、N-cadherin等。在胚胎發(fā)育過程中，鋅指蛋白SNAIL家族的激活能夠促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生遷移運(yùn)動(dòng)[12]，體外定型內(nèi)胚層細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的獲得與SNAIL家族之間的關(guān)系目前報(bào)道較少。為了研究SNAIL家族在定型內(nèi)胚層分化過程中的作用，本實(shí)驗(yàn)通過干擾SNAI1基因的表達(dá)，探討SNAI1與定型內(nèi)胚層命運(yùn)及與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)之間的關(guān)系。

1 材料

1.1 細(xì)胞

人胚胎干細(xì)胞細(xì)胞株H1購于威斯康星州WiCell研究所(Wicell,Madison,WI)。

1.2 主要試劑

mTeSR1培養(yǎng)基(Stemcell Technologies)；Matrigel基底膠(BD Biosciences)；Accutase細(xì)胞消化液(Sigma)；RPMI/B27培養(yǎng)基(Gibco)；激活素A(Peprotech)； FBS (HyClone)；DAPI(Sigma)；FOXA2抗體(R&D system)；小鼠來源的SNAI1單克隆抗體(Cell Signaling Technology)；HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗、Alexa Fluor?488 標(biāo)記的驢抗羊二抗(Invitrogen)；Trizol試劑(MRC)；ReverTra Ace qPCR RT Kit (TOYOBO)；SYBR Premix Ex Taq Kit(TAKARA)；western化學(xué)顯色試劑盒(MILLIPORE)；siSNAI1-1#(銳博生物)；siSNAI1-2#(銳博生物)；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine RNAiMAX(Thermo scientific)。

1.3 主要儀器

Zeiss LSM 710共聚焦顯微鏡(德國Carl Zeiss)；CFX96 Touch實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀 (美國Bio-Rad公司)；倒置熒光顯微鏡(德國Carl Zeiss)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將人胚胎干細(xì)胞系H1接種于鋪有Matrigel基底膠的6孔板上，加入mTeSR1培養(yǎng)基在37 ℃、5%(φ)CO2的條件下培養(yǎng)，每天換液。當(dāng)培養(yǎng)板中細(xì)胞密度較大時(shí)，按照1∶4～1∶6的比例用Accutase細(xì)胞消化液進(jìn)行傳代。

2.2 定型內(nèi)胚層分化

在24孔板中提前半小時(shí)預(yù)先鋪好Matrigel基底膠，將6孔板中密度達(dá)50%左右的H1細(xì)胞用Accutase消化液進(jìn)行消化，細(xì)胞密度以第2天細(xì)胞接近鋪滿整個(gè)培養(yǎng)孔為宜。細(xì)胞貼壁成功并鋪滿整個(gè)培養(yǎng)孔后加入含有50 ng/mL Activin A重組蛋白的RPMI/B27培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)3 d，每天更換新鮮的分化培養(yǎng)基[13]。

2.3 siRNA轉(zhuǎn)染

嚴(yán)格按照轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine RNAiMAX 說明書的操作步驟進(jìn)行。

2.4 Western blot檢測siRNA對(duì)SNAI1蛋白的干擾效果

收集細(xì)胞并裂解蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入兔抗人SNAI1多克隆抗體，4 ℃條件下孵育過夜，TBS /T清洗3次，加入相對(duì)應(yīng)的HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗，室溫孵育1 h，TBS/T清洗3次，滴加顯影液和定影液于暗室中顯影成像。

2.5 qRT-PCR檢測FOXA2、GATA4/6、KLF8、TGFβ1、SNAI1等基因的表達(dá)

將在24孔板中培養(yǎng)的H1細(xì)胞向內(nèi)胚層定向誘導(dǎo)3 d后，吸棄培養(yǎng)基上清液，用PBS緩沖液清洗3次，每孔中加入約1 mL Trizol試劑，反復(fù)吹打直至細(xì)胞完全溶解。加入氯仿分層，取水相至預(yù)冷的異丙醇中獲得總RNA沉淀，洗滌晾干，將RNA沉淀重新溶于蒸餾水，測定濃度。根據(jù)ReverTra Ace qPCR RT Kit說明書操作，取2 μg總RNA將其反轉(zhuǎn)為cDNA并適度稀釋，用作PCR模板。采用SYBR Premix Ex Taq Kit進(jìn)行qPCR反應(yīng)，內(nèi)參為GAPDH。所用引物的序列如下：FOXA2，5′-ACTACCCCGGCTACGGTTC-3′(正向)，5′-AGGCCCGTTTTGTTCGTGA-3′(反向);GATA4，5′-CGACACCCCAATCTCGATATG-3′(正向)，5′-GTTGCACAGATAGTGACCCGT-3′(反向)；GATA6，5′-CTCAGTTCCTACGCTTCGCAT-3′ (正向)，5′-GTC GAGGTCAGTGAACAGCA-3′(反向)；KLF8，5′-CCCAAGTGGAACCAGTTGACC-3′(正向)，5′-GAC GTGGACACCACAAGGG-3′(反向)；TGFβ1，5′-CTAATGGTGGAAACCCACAACG-3′(正向)，5′-TATCGC CAGGAATTGTTGCTG-3′(反向)；SNAI1，5′-ACTGCA ACAAGGAATACCTCAG-3′(正向)，5′-GCACTG GTACTTCTTGACATCTG-3′(反向);GAPDH，5′-AGG GCTGCTTTTAACTCTGGT-3′(正向)，5′-CCCCACTTG ATTTTGGAGGGA-3′ (反向)。

2.6 免疫熒光檢測FOXA2蛋白的表達(dá)

4%多聚甲醛固定細(xì)胞，處理30 min后用PBS清洗3次，然后加入0.3% Triton X-100/PBS溶液通透30 min，PBS清洗3次，加入10% FBS/PBS溶液室溫孵育1 h。加入羊抗人BFOXA2一抗于4 ℃冰箱中孵育過夜，PBS清洗3次，加入相對(duì)應(yīng)的Alexa Fluor?488 標(biāo)記的驢抗羊免疫熒光二抗，避光孵育2 h，PBS清洗3次，加入DAPI避光孵育5 min，PBS清洗3次,封片。使用Zeiss LSM 710共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察和拍照。

2.7 細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)能力檢測

采用劃痕法測定內(nèi)胚層定向分化第3天的細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)能力：用無菌針頭快速劃過單層培養(yǎng)的細(xì)胞表面，形成無細(xì)胞區(qū)，該區(qū)域附近的細(xì)胞可以向無細(xì)胞區(qū)遷移運(yùn)動(dòng)，拍照、測量起始的無細(xì)胞區(qū)的邊界距離，然后將細(xì)胞放置回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后再取出拍照、測量無細(xì)胞區(qū)邊界距離，由此可計(jì)算出細(xì)胞24 h內(nèi)的遷移距離。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 驗(yàn)證siSNAI1的干擾效果

將hESCs誘導(dǎo)為內(nèi)胚層細(xì)胞的過程中加入干擾SNAI1表達(dá)的siRNA，與正常對(duì)照相比，分化第3天細(xì)胞內(nèi)SNAI1基因的mRNA含量顯著下降(P<0.01)，見圖1。通過蛋白免疫印跡法也證實(shí)分化第3天內(nèi)胚層細(xì)胞中SNAI1蛋白的表達(dá)受到明顯抑制，見圖2。

0123t/d0.00200.00150.00100.00050.0000相對(duì)表達(dá)量NCsiSNAI1-1siSNAI1-2SNAI1**

與siSNAI1-1組、siSNAI1-2組比較：**P<0.01。

圖1分化過程中經(jīng)siSNAI1處理后細(xì)胞內(nèi)SNAI1基因的mRNA含量

Figure1Gene expression ofSNAI1 after siSNAI1 treatment in endoderm differentiation

3.2 干擾SNAI1基因的表達(dá)對(duì)FOXA2表達(dá)的影響

在內(nèi)胚層細(xì)胞分化過程中，F(xiàn)OXA2在分化第2天左右就會(huì)發(fā)生上調(diào)，分化第3天在細(xì)胞中高表達(dá)。阻礙SNAI1基因的表達(dá)導(dǎo)致FOXA2在第2天左右上調(diào)失敗(P<0.05)，直接影響分化第3天FOXA2在細(xì)胞中的表達(dá)量(P<0.05)，結(jié)果見圖3。細(xì)胞免疫熒光檢測分化第3天細(xì)胞內(nèi)FOXA2蛋白的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，siRNA處理的細(xì)胞幾乎不表達(dá)FOXA2，說明細(xì)胞的內(nèi)胚層分化命運(yùn)受到抑制，見圖4。

0123SNAI1GAPDH

1. hESCs; 2. siSNAI1-1 D3; 3. siSNAI1-2 D3; 4. NC D3。

圖2經(jīng)siSNAI1處理后細(xì)胞內(nèi)SNAI1蛋白含量

Figure2IntracellularSNAI1 protein content after siSNAI1 treatment

0123t/dNCsiSNAI1-1siSNAI1-2FOXA20.0160.0120.0080.0040.000相對(duì)表達(dá)量**

與siSNAI1-1組、siSNAI1-2組比較：*P<0.05。

圖3分化過程中經(jīng)siSNAI1處理后細(xì)胞表達(dá)FOXA2的情況

Figure3Expression ofFOXA2 mRNA in siSNAI1-treated cells during endodermal differentiation

圖4經(jīng)siSNAI1處理3 d后細(xì)胞表達(dá)FOXA2蛋白的情況

Figure4Expression of FOXA2 protein in siSNAI1-treated cells at 3 days

3.3 干擾SNAI1基因的表達(dá)對(duì)GATA4、GATA6、TGFβ1、KLF8 mRNA表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步驗(yàn)證SNAI1基因的表達(dá)受阻對(duì)內(nèi)胚層細(xì)胞命運(yùn)的影響，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測細(xì)胞中GATA4、GATA6的mRNA表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照相比，siRNA處理的細(xì)胞中內(nèi)胚層標(biāo)記基因GATA4、GATA6的表達(dá)非常低(P<0.01)。同時(shí)qRT-PCR結(jié)果還表明與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)相關(guān)的基因TGFβ1、KLF8的表達(dá)也受到影響(P<0.01)，見圖5。

0.00040.00030.00020.000100.0040.0030.0020.0010相對(duì)表達(dá)量0.0120.0100.0080.0060.0040.0020相對(duì)表達(dá)量0.000250.000200.000150.000100.000050GATA4GATA6TGFβ1KLF8NCD3siSNAI1-1siSNAI1-2****************

與NC組比較：**P<0.01。

圖5經(jīng)siSNAI1處理3 d后細(xì)胞表達(dá)GATA4、GATA6、TGFβ1、KLF8的情況

Figure1Expression ofGATA4、GATA6、TGFβ1 andKLF8 mRNA in siSNAI1-treated cells at 3 days

3.4 干擾SNAI1基因的表達(dá)對(duì)細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)能力的影響

如圖6所示，將hESCs誘導(dǎo)為內(nèi)胚層細(xì)胞的過程中，細(xì)胞會(huì)獲得遷移運(yùn)動(dòng)能力，細(xì)胞由上皮狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)殚g充質(zhì)狀態(tài)。加入干擾SNAI1表達(dá)的siRNA后，細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)能力受到明顯限制(P<0.01)。

****siSNAI1-2D3siSNAI1-1D3NCD3400300200100024h遷移距離/?m

與NC組比較：**P<0.01。

圖6經(jīng)siSNAI1處理3 d后細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)能力的變化

Figure6Cell migration assay after siSNAI1 treatment at 3 days

4 討論

原腸胚期是動(dòng)物胚胎發(fā)育過程中的一個(gè)重要階段，此時(shí)外、中、內(nèi)3個(gè)胚層開始出現(xiàn)，盡管內(nèi)胚層細(xì)胞的數(shù)量在胚胎總細(xì)胞數(shù)中占比不高[14]，但是卻能夠產(chǎn)生機(jī)體中的大部分內(nèi)臟器官。盡管這些內(nèi)臟器官在形態(tài)和功能上存在差異，但它們的形成都與細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)密不可分[15]。SNAI1對(duì)于細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)至關(guān)重要，干擾SNAI1的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)、功能發(fā)生改變，甚至是遷移運(yùn)動(dòng)能力的喪失[16- 17]。研究發(fā)現(xiàn)SNAI1敲除的小鼠胚胎無法正常出生，推測可能與原腸胚期細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)過程受阻有關(guān)[18]，而在小鼠的胚胎干細(xì)胞(mESCs)中異位過表達(dá)SNAI1則會(huì)促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生遷移運(yùn)動(dòng)[19]。

胚胎干細(xì)胞是由囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)衍生而來，能夠分化為內(nèi)、中、外原始三胚層來源的多種類型的細(xì)胞，是未來細(xì)胞治療的重要資源。然而干細(xì)胞真正的臨床研究進(jìn)展緩慢，其應(yīng)用還存在不少安全問題，這主要是由于人們對(duì)分化過程的本質(zhì)及機(jī)制的認(rèn)識(shí)還非常有限[20]。以內(nèi)胚層分化為例，研究發(fā)現(xiàn)將人胚胎干細(xì)胞定向分化為內(nèi)胚層細(xì)胞的過程中可以觀察到細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生了明顯改變，這些細(xì)胞還具有與體內(nèi)分化細(xì)胞相似的遷移運(yùn)動(dòng)能力，盡管細(xì)胞運(yùn)動(dòng)與其命運(yùn)之間有何聯(lián)系尚不清楚。

本實(shí)驗(yàn)利用RNA干擾技術(shù)，通過抑制SNAI1的表達(dá)，探討SNAI1對(duì)定型內(nèi)胚層分化過程的影響及其在細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)中所起的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)干擾SNAI1的表達(dá)會(huì)阻礙內(nèi)胚層的定向分化過程，定型內(nèi)胚層譜系命運(yùn)轉(zhuǎn)變過程嚴(yán)重受阻，分化的細(xì)胞幾乎不表達(dá)定型內(nèi)胚層的標(biāo)志蛋白，同時(shí)與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)有關(guān)的基因表達(dá)明顯下調(diào)，細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)能力有限。由此說明SNAI1不僅在定型內(nèi)胚層分化過程中起著決定細(xì)胞命運(yùn)的作用，還能夠阻止細(xì)胞獲得相應(yīng)的遷移運(yùn)動(dòng)能力。推測細(xì)胞獲得遷移運(yùn)動(dòng)能力可能是人胚胎干細(xì)胞成功分化為定型內(nèi)胚層細(xì)胞的前提。