李鈺婷，蔡大可,占心佾，鄭柳怡，楊九妹，黃雪君，黃丹娥，陳玉興，甘海寧

(1.廣州中醫(yī)藥大學第五臨床醫(yī)學院，廣東 廣州 510405； 2.廣東省中醫(yī)藥工程技術研究院， 廣東 廣州 510095； 3.廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點實驗室，廣東 廣州 510095)

高脂血癥是一系列心血管疾病發(fā)病的重要原因，其發(fā)病機制復雜，目前公認的發(fā)病原因主要包括炎癥因子、氧化應激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、腸道菌群及基因多態(tài)性等方面[1]。因此，不同的高脂血癥動物模型因發(fā)病機制的差異性，會導致降脂藥物藥效評價的差異性。最新研究發(fā)現(xiàn)，高脂血癥的形成、發(fā)展甚至并發(fā)癥中均可引發(fā)炎癥反應[2]，由此可見，在降脂藥物的篩選中，抗炎作用是一重大攻破點。但是炎癥與脂代謝之間的關系仍不明確，需要在特定的模型進行闡述，從而為降脂藥物的評價提供參考。

Triton WR-1339所致的高脂血癥模型是常用的急性高脂血癥動物模型。其所致的高脂血癥具有造模時間短、致內(nèi)源性脂質(zhì)代謝紊亂的特點，主要用于降血脂藥物的篩選[3]和脂質(zhì)代謝機制的探索。該模型具有多種致病機制：包括抑制肝臟脂蛋白水解酶HPL和血清的脂蛋白水解酶LPL活性[4]，促進HMG-CoA的活性[5]等，且其具有顯著的炎癥病變特點[5]，但炎癥與Triton WR-1339所致脂質(zhì)代謝紊亂的相關性并未充分闡述清楚。與調(diào)控脂代謝密切相關的Kupffer細胞是肝臟中固有的巨噬細胞，可通過先天免疫反應促進肝臟炎癥反應。Kupffer細胞的激活，會使肝臟產(chǎn)生促炎因子如IL-1β、IL-6和MCP-1等[6-8]，其對肝細胞的調(diào)控作用，亦是脂代謝紊亂的一個重要原因。本實驗通過對不同時間點及多次注射Triton WR-1339研究炎癥與高脂血癥之間的關系及發(fā)生的先后順序。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

BS224S電子天平(1/萬)，購自德國SARTORIUS公司；JJ3000動物電子秤，購自G&G公司；5424型小型高速離心機，購自德國Eppendorf公司；Bio-RAD全自動酶標儀，購自美國伯樂公司；DP72顯微鏡購自日本OLYMPUS；-80 ℃超低溫冰箱，購自美國Thermo公司。

1.2 試劑

Triton WR-1339(批號：Lot#MKCC6730),購自美國Sigma-Aldrich公司；總膽固醇(TC，批號:20180722)和總?cè)ジ视?TG,批號：20180822)，購自上?？菩郎锛夹g研究所；即用型SABC法免疫組化試劑盒，購自武漢博士德生物工程有限公司；IL-1β、IL-6、MCP-1 ELISA試劑盒，均購自天津安諾瑞康生物技術有限公司；4%組織細胞固定液，購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。

1.3 藥物配制

稱取相應量的Triton WR-1339，加入相應量的生理鹽水，用玻璃棒直接攪拌溶解成質(zhì)量濃度為0.12 g/mL的溶液。

1.4 實驗動物

SPF級C57BL/6小鼠60只，雄性，體質(zhì)量18～22 g，廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供，實驗動物合格證號：44007200056604；動物飼養(yǎng)環(huán)境：廣東省第二中醫(yī)院(廣東省中醫(yī)藥工程技術研究院)SPF級動物實驗室，使用許可證號：SYXK(粵)2015-0059。

1.5 方法

1.5.1 動物模型的建立 在實驗室環(huán)境下常規(guī)飼養(yǎng)3 d后，將60只C57BL/6雄性小鼠隨機分為6組，每組10只，分別為正常組(0 h)、4 h組、8 h組、36 h組、2T組、3T組。除正常組外，其他小鼠肌肉注射Triton WR-1339溶液(0.1 g/mL)；正常組、4 h組、8 h組和36 h組在對應的時間點進行取材；在前4組取材的同時對2T組和3T組進行第2次注射，36 h后將2T組取材，同時對3T組進行第3次注射，36 h后將3T組小鼠取材。取材操作為對小鼠進行摘眼球取血，后將其處死，取約100 mg肝臟置于4%組織細胞固定液中，待檢測相應指標。

1.5.2 血清TC、TG含量的檢測 將6組血樣進行10 000 r/min離心5 min，取血清，按照試劑盒說明書分別測定血清中TC、TG的含量。

1.5.3 ELISA檢測血清中IL-1β、IL-6和MCP-1的含量 用上述制備的血清，根據(jù)ELISA試劑盒的說明書，用多功能酶標儀在A450下檢測A值，再根據(jù)公式算出IL-1β、IL-6和MCP-1在血清中的含量。

1.5.4 肝臟病理形態(tài)學觀察 將置于4%組織細胞固定液的肝臟進行包埋，切片，進行蘇木青-伊紅染色，染色切片在顯微鏡下觀察肝臟病理變化并隨機選取拍照視野，采用Image-pro plus 6.0軟件分析圖片中炎癥細胞浸潤面積，計算百分比。

1.5.5 免疫組化 用上述蠟片依照SABC免疫組化試劑盒，將切好的石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，熱修復抗原，血清封閉，加一抗、二抗、SABC液，DAB顯色，蘇木素輕度復染，脫水，顯微鏡下鏡檢，隨機選取拍照視野，采用Image-pro plus 6.0軟件對肝臟組織CD68、IL-1β陽性表達面積進行半定量分析。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 Triton WR-1339對小鼠血清TC和TG的影響

如表1所示，小鼠血清TC和TG的含量在造模4 h和8 h均無明顯變化，36 h開始明顯增加(P<0.05或0.01)，隨著注射次數(shù)增加，呈現(xiàn)上升趨勢。

2.2 Triton WR-1339對小鼠血清IL-1β、IL-6和MCP-1的影響

如表2所示，造模8 h后小鼠血清中IL-1β和MCP-1的含量開始明顯升高(P<0.05)，隨著注射次數(shù)增加呈上升趨勢(P<0.05或0.01)；IL-6在3T時含量明顯增加(P<0.05)。

表1 小鼠血清TC和TG的含量變化

組別TCTG正常組4.12±0.911.53±0.354 h組4.74±1.511.73±0.338 h組4.65±0.231.20±0.2536 h組7.83±2.22#8.94±3.98##2T組11.27±1.63##15.04±2.58##3T組14.90±3.05##17.05±2.46##

與正常組比較：#P<0.05,##P<0.01。

表2 小鼠血清IL-1β、IL-6和MCP-1的含量變化

組別IL-1βMCP-1IL-6正常組57.57±1.1338.61±3.9453.28±3.204 h組59.10±1.1743.50±8.4760.27±6.348 h組60.22±2.06#62.69±17.98#47.83±7.7936 h組60.73±2.28#65.16±14.10#49.35±8.242T組63.07±3.44##59.68±14.17#55.81±5.233T組72.20±5.17##80.43±17.93##64.93±8.88#

與正常組比較:#P<0.05,##P<0.01。

2.3 Triton WR-1339對小鼠肝臟病理形態(tài)學的影響

如圖1所示，與正常組比較，4 h后肝細胞出現(xiàn)空泡樣病變(a)和炎性浸潤(b)，8 h后炎性細胞浸潤面積明顯增加(P<0.05)；而在注射Triton WR-1339 2次后，炎性細胞浸潤面積顯著性增加(P<0.01)，且由脂質(zhì)堆積所致的細胞空泡樣病變明顯。

2.4 Triton WR-1339對小鼠肝臟IL-1β和CD68蛋白表達的影響

從圖2免疫組化結果可發(fā)現(xiàn)，小鼠肝臟正常組IL-1β和CD68的表達都較少。與正常組比較，肌注Triton WR-1339 4 h后肝臟IL-1β的陽性表達顯著增加(P<0.05或0.01)；8 h后肝臟CD68的陽性表達明顯增加(P<0.05)，2次以上注射顯著增加(P<0.01)，均呈棕黃色，多分布于胞質(zhì)。

與正常組比較：#P<0.05,##P<0.01。

與正常組比較：#P<0.05,##P<0.01。

圖2各組小鼠肝臟CD68、IL-1β表達比較
Figure2Comparison of the expression of liver CD68 and IL-1βin each group (200×)

3 討論

高脂血癥的治療是預防心腦血管疾病發(fā)生的關鍵點，因而對于降脂藥物的研究是當前一大熱點。但由于高脂血癥的誘因及其發(fā)生機制有所不同，為了更有針對性地篩選降脂藥物，在藥理實驗研究中，有各種不同誘因?qū)е碌母咧Y動物模型：高脂飼料喂養(yǎng)、脂肪乳劑灌胃法、復合因素造模法等[9]。Triton WR-1339是常用的急性高脂血癥模型，其通過給實驗動物尾靜脈或肌肉注射或腹腔注射的方式，抑制脂蛋白酯酶的活性及極低密度脂蛋白與其他脂蛋白交換，從而增加血漿TG和TC的含量[10]。由于Triton WR-1339所致的高脂血癥模型是一種急性反應，通過體內(nèi)自身代謝后即會消退，能夠體現(xiàn)機體對炎癥及脂代謝的自愈調(diào)節(jié)作用。本課題組前期研究[11]發(fā)現(xiàn)，肌肉注射Triton WR-1339后36 h，血漿中TG和TC含量達到峰值。所以采用36 h為注射間隔時間點，考察其多次注射對血脂的影響。

高脂血癥一般均伴隨著炎癥反應，有學者推測是由于高脂血癥患者血脂代謝紊亂，血脂在血管內(nèi)皮積存，從而對血管內(nèi)皮產(chǎn)生損傷作用，因而出現(xiàn)一系列炎癥反應[12]。本實驗結果發(fā)現(xiàn)，注射Triton WR-1339 36 h后模型小鼠血脂相比于正常組小鼠明顯升高，且隨著注射次數(shù)增加，血清中TC和TG顯著升高，而在還未出現(xiàn)高脂血癥前，注射后8 h血清IL-1β和MCP-1已明顯升高，且與血脂的變化呈正相關。MCP-1屬于CC趨化因子家族的一個小細胞因子，目前已知的單核細胞、巨噬細胞、成纖維細胞等在受到某些刺激下可被誘導分泌MCP-1，MCP-1對單核/巨噬細胞具有特異性趨化激活作用[13]，巨噬細胞(Kupffer細胞)在激活狀態(tài)下可分泌IL-1β、IL-6等炎癥因子，產(chǎn)生炎癥反應。本研究發(fā)現(xiàn)，8 h時，肝臟的炎性浸潤面積開始明顯增加，與MCP-1增加的時間點一致，說明MCP-1在招募巨噬細胞，且巨噬細胞標記物CD68[14]和M1型巨噬細胞分泌的炎癥因子IL-1β[15]的表達量在8 h后明顯增加。由以上結果推測，Triton WR-1339所致的高脂血癥后于炎癥反應的發(fā)生，且與巨噬細胞的招募和極化分型有關。

本實驗結果提示，Triton WR-1339可刺激血清中MCP-1的分泌，進而激活和招募巨噬細胞，繼而分泌炎癥因子，其與該模型所致的急性高脂血癥呈正相關，但炎癥與高脂血癥之間的關聯(lián)還需進一步考究。本研究旨在探索Triton WR-1339所致脂代謝紊亂與炎癥反應的關系，為研究降脂藥物的動物模型篩選提供了參考。