曾文蘭，吳朝文

(深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院，廣東 深圳 518110)

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是一類以中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞完整性被破壞以及肺泡毛細(xì)血管彌漫性損傷為特征，最終導(dǎo)致呼吸衰竭，甚至死亡的呼吸道感染類疾病，其中肺水腫和急性呼吸性窘迫是其主要的臨床表現(xiàn)[1]。ALI以其顯著的高發(fā)病率和死亡率的特點(diǎn)對(duì)公共健康產(chǎn)生重大影響，研究統(tǒng)計(jì)ALI致死率已高達(dá)30%～50%[2]。機(jī)械通氣、激素和抗炎藥物是目前臨床上常用的治療方法，但均存在明顯缺點(diǎn)，如應(yīng)用機(jī)械通氣，由于受各種條件限制，難以廣泛推廣，而激素和抗炎等藥物副作用明顯，預(yù)后差等[3]，故尋找安全有效的防治ALI藥物顯得尤為緊迫。

杜仲(Eucommia ulmoides)是杜仲科植物杜仲的干燥樹皮，具有強(qiáng)筋壯骨、調(diào)理沖任、固經(jīng)安胎和補(bǔ)益肝腎的功效。近年來研究表明其主要有效成分杜仲黃酮具有抗氧化、抗炎和抗衰老等藥理作用[4]。目前杜仲黃酮對(duì)脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)ALI的研究尚未見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)擬基于TGF-β/smad信號(hào)通路探討杜仲黃酮對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠ALI的影響及其作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

DMEM培養(yǎng)基、LPS(美國(guó)Sigma)；胎牛血清(Sciencell生物技術(shù)公司)；地塞米松(DEX)片(規(guī)格0.75 mg/片，廣東南國(guó)藥業(yè)有限公司)；杜仲(亳州市安博藥業(yè)有限公司)；腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)ELISA檢測(cè)試劑盒(博士德生物技術(shù)有限公司)；超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測(cè)試劑盒、丙二醛(MDA)含量檢測(cè)試劑盒(南京建成股份有限公司)；TGF-β和Smad2單抗(上海鈺博生物科技有限公司)。

1.2 主要儀器

RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鄭州市亞榮儀器有限公司)；752N紫外可見分光光度計(jì)(南京曉曉儀器設(shè)備有限公司)；XDS-1倒置顯微鏡(南京山特儀器有限公司)；BC-6900全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)； H1650R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；BS-1101多功能酶標(biāo)儀(南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；YB-6LF生物組織石蠟包埋機(jī)(亞光科技股份有限公司)；KD-3390智能感知石蠟切片機(jī)(上海珂淮儀器有限公司)；K8420全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)(南京世研儀器設(shè)備有限公司)。

1.3 細(xì)胞與動(dòng)物

Raw264.7細(xì)胞由上海中科院細(xì)胞庫(kù)提供。BALB/c小鼠，60只，SPF級(jí)，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)買于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(粵)2015-0014。

1.4 方法

1.4.1 杜仲黃酮的提取及含量檢測(cè) 參照文獻(xiàn)[5]的方法提取杜仲黃酮，主要工藝條件如下：精確稱取杜仲1 kg，使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%乙醇，料液比(g∶mL)為1∶10，80 ℃條件下分別提取3次，每次回流2.0 h，并使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸去乙醇，濃縮至原體積1/30。使用紫外分光光度法，檢測(cè)波長(zhǎng)為500 nm，檢測(cè)得杜仲黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.27%。

1.4.2 Raw264.7細(xì)胞培養(yǎng) 用0.25%的胰蛋白酶2.5 mL,37 ℃恒溫水浴箱中振蕩消化15 min,加入DMEM培養(yǎng)基終止消化。反復(fù)吹打并調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/mL，吸出細(xì)胞懸液放入培養(yǎng)瓶,置于37 ℃、 5%(φ)CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。傳代后的細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞重新長(zhǎng)滿匯合后，用于細(xì)胞存活率和培養(yǎng)液中TNF-α和IL-1β的含量測(cè)定。

1.4.3 分組與給藥 適應(yīng)性喂養(yǎng)小鼠1周后，按動(dòng)物體質(zhì)量隨機(jī)分為6組，包括假手術(shù)組、模型組、DEX組，杜仲黃酮低劑量(DZ-L)組、中劑量(DZ-M)組、高劑量(DZ-H)組，每組10只。于造模前連續(xù)灌胃給藥7 d，DEX組灌胃給藥2 mg/(kg·d)，DZ-L、DZ-M和DZ-H組分別灌胃給藥50、100、200 mg/(kg·d)，假手術(shù)組和模型組以等量生理鹽水灌胃。

1.4.4 小鼠ALI模型的建立 各組小鼠連續(xù)灌胃給藥7 d后，末次給藥1 h后開始造模，2%異戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，仰臥固定于37 ℃恒溫手術(shù)臺(tái)。參照文獻(xiàn)[6]方法造模，造模主要步驟如下：小心剃去頸部正中毛發(fā)，酒精消毒，正中切開頸部皮膚約2 cm，暴露及分離氣管，利用胰島素注射器于氣管內(nèi)慢慢滴注LPS 5 mg/kg(0.5 mL/kg)，假手術(shù)組氣管內(nèi)滴注等量生理鹽水，碘伏消毒傷口并縫合皮膚，建立小鼠急性肺損傷模型。造模24 h后，摘眼球取血，4 ℃冰箱靜置3 h后，3 500 r/min離心15 min，分離血清，-20 ℃保存，待測(cè)。各組小鼠小心剪開頸部皮膚并分離氣管，行氣管插管。剖開胸部，結(jié)扎右支氣管，用磷酸緩沖液灌洗左肺，共3次，2 mL/次，收集BALF并離心(4 ℃，1 300 r/min，5 min)。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 RAW264.7細(xì)胞存活率測(cè)定 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Raw264.7細(xì)胞，用含10%(φ)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋為1×105/mL，100 μL接種于96孔板，空白對(duì)照組和模型組(LPS 80 ng/mL)更換成新鮮含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，杜仲黃酮給藥組加入不同濃度的杜仲黃酮含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(終濃度分別為2、4、8、16、32、64 μmol/L)，調(diào)零組為無細(xì)胞組，其他步驟同空白對(duì)照組，每組設(shè)立6個(gè)平行孔，24 h后，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率。按照下列公式計(jì)算存活率：存活率=(處理組吸光度值-調(diào)零組吸光度值)/(空白對(duì)照組吸光度值-調(diào)零組吸光度值)×100%。

1.5.2 RAW264.7細(xì)胞上清培養(yǎng)液TNF-α和IL-1β含量測(cè)定 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Raw264.7細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋為1×105個(gè)細(xì)胞后接種于12孔板中，貼壁培養(yǎng)24 h后分為空白對(duì)照組、模型組(LPS 80 ng/mL)、DZ-L組(4 μmol/L)、DZ-M組(8 μmol/L)和DZ-H組(16 μmol/L)。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞上清液，離心5 min(3 500 r/min)。按照TNF-α和IL-1β檢測(cè)試劑盒說明書步驟分別檢測(cè)TNF-α和IL-1β的含量。

1.5.3 BALF蛋白含量測(cè)定 BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)BALF中蛋白含量，實(shí)驗(yàn)操作均按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5.4 BALF中白細(xì)胞計(jì)數(shù) 用800 μL 0.01 mol/L(pH 7.4)的PBS緩沖液重懸BALF沉淀物，吹打均勻后，取400 μL于血液分析儀中檢測(cè)白細(xì)胞數(shù)目。

1.5.5 肺濕干質(zhì)量比(W/D) 稱取左肺上葉為濕質(zhì)量，將左肺上葉放入恒溫干燥箱(105 ℃)烤72 h，干燥至恒質(zhì)量，并稱取記錄為干質(zhì)量，按下列公式計(jì)算：肺濕干質(zhì)量比=濕質(zhì)量/干質(zhì)量。

1.5.6 肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察 取右肺下葉，10%(φ)中性甲醛浸泡固定24 h，流水沖洗12 h，常規(guī)石蠟包埋，切片，蘇木精伊紅染色，封片，顯微鏡下進(jìn)行病理觀察。

1.5.7 生化指標(biāo)檢測(cè) 血清中SOD活性和MDA的含量測(cè)定按照相應(yīng)檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5.8 肺組織TGF-β1和Smad2的表達(dá)水平 BCA試劑盒檢測(cè)肺組織勻漿總蛋白濃度，加入等量樣品于電泳槽進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。經(jīng)過轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育TGF-β1(1∶3 000)、Smad2(1∶2 000)一抗過夜; 洗膜、孵育二抗(1∶7 000)、洗膜、顯影，使用Image J軟件半定量分析各條帶灰度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 杜仲黃酮對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率的影響

從圖1結(jié)果可知，2、4、8、16、32、64 μmol/L杜仲黃酮分別處理RAW264.7細(xì)胞24 h后，杜仲黃酮給藥終濃度為32 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率為84.23%；而給藥終濃度為64 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率為74.53%。

105100959085807570650248163264c(杜仲黃酮)/(μmo?L-1)存活率/%

圖1杜仲黃酮對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率的影響

2.2 杜仲黃酮對(duì)RAW264.7細(xì)胞TNF-α和IL-1β的影響

從圖2結(jié)果可見：與空白對(duì)照組比較，模型組TNF-α和TNF-1β含量明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，DEX組和杜仲黃酮給藥組TNF-α和TNF-1β含量均明顯降低(P<0.05)。與DEX組比較，DZ-L組TNF-α和TNF-1β含量明顯升高(P<0.05)。與DZ-L組比較，DZ-H組TNF-α和TNF-1β含量明顯降低(P<0.05)。

aabbdbcbbbbd9008007006005004003002001000TNF-α/(ng?mL-1)IL-β/(ng?mL-1)706050403020100aabbddbccbbddbABCDEF

A.空白對(duì)照組； B.模型組； C. DEX組； D. DZ-L組； E. DZ-M組； F. DZ-H組。

與空白對(duì)照組比較：aaP<0.01；與模型組比較：bP<0.05，bbP<0.01；與DEX組比較：cP<0.05，ccP<0.01；與DZ-L組比較：dP<0.05，ddP<0.01。

圖2杜仲黃酮對(duì)RAW264.7細(xì)胞TNF-α和IL-1β含量的影響

2.3 杜仲黃酮對(duì)BALF蛋白含量和白細(xì)胞的影響

從圖3結(jié)果可見：與假手術(shù)組比較，模型組小鼠蛋白含量和白細(xì)胞數(shù)量均明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，DEX組和杜仲黃酮給藥組小鼠蛋白含量和白細(xì)胞數(shù)量均明顯降低(P<0.05)。與DEX組比較，DZ-L組小鼠蛋白含量和白細(xì)胞數(shù)量明顯升高(P<0.05)。與DZ-L組比較，DZ-H組小鼠蛋白含量和白細(xì)胞數(shù)量明顯降低(P<0.05)。

2.4 杜仲黃酮對(duì)肺組織濕干質(zhì)量比的影響

從圖4結(jié)果可見：與假手術(shù)組比較，模型組小鼠肺組織濕干質(zhì)量比明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，DEX組和杜仲黃酮給藥組小鼠肺組織濕干質(zhì)量比均明顯降低(P<0.05)。與DEX組比較，DZ-L組小鼠肺組織濕干質(zhì)量比明顯升高(P<0.05)。與DZ-L組比較，DZ-H組小鼠肺組織濕干質(zhì)量比明顯降低(P<0.05)。

2.5 杜仲黃酮對(duì)肺組織病理形態(tài)學(xué)的影響

從圖5結(jié)果可見：假手術(shù)組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡腔無滲出液，肺泡間隔無水腫，無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組小鼠肺組織有大小不一的散在出血斑塊，彌漫性肺水腫，肺泡壁和肺泡間隔明顯增寬，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。與模型組比較，DEX組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)比較完整，肺間隔未見明顯增厚，肺泡滲出液少，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)也較少；DZ-H組小鼠肺泡滲出液和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較少，肺間隔增厚較輕，出血現(xiàn)象較輕；DZ-L組和DZ-M組小鼠肺組織的病理變化改善不及DZ-H組。

蛋白含量/(g?L-1)1.41.21.00.80.60.40.20.0aabbddbccbbdbbaabbddbcbbdbb876543210白細(xì)胞數(shù)量/?108個(gè)?L-1蛋白含量白細(xì)胞數(shù)量ABCDEF

A.假手術(shù)組； B.模型組； C. DEX組； D. DZ-L組； E. DZ-M組； F. DZ-H組(下同)。

與假手術(shù)組比較：aaP<0.01；與模型組比較：bP<0.05，bbP<0.01；與DEX組比較：cP<0.05，ccP<0.01；與DZ-L組比較：dP<0.05，ddP<0.01。

圖3杜仲黃酮對(duì)各組小鼠BALF蛋白含量和白細(xì)胞數(shù)量的影響

bbdaabbbcbbd121086420W/DABCDEF

與假手術(shù)組比較：aaP<0.01；與模型組比較：bP<0.05，bbP<0.01；與DEX組比較：cP<0.05；與DZ-L組比較：dP<0.05。

圖4杜仲黃酮對(duì)各組小鼠肺組織濕干質(zhì)量比的影響

2.6 杜仲黃酮對(duì)小鼠血清SOD、MDA的影響

從圖6結(jié)果可見：與假手術(shù)組比較，各組小鼠血清SOD活性和MDA含量明顯升高(P<0.05)；DEX組小鼠血清SOD活性明顯比模型組升高(P<0.05)，而MDA含量明顯降低(P<0.05)。與DEX組比較，DZ-L組小鼠血清SOD活性明顯升高(P<0.05)，MDA含量明顯降低(P<0.01)。與DZ-L組比較，DZ-H小鼠血清SOD活性明顯升高(P<0.05)，MDA含量明顯降低(P<0.05)。

圖5各組小鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察(HE染色，20×)

Figure5Effect of flavonoids from Eucommia umoides on the pathological changes of lung tissues in each group (HE staining,20×)

abcbbbbdbbaabbddbccbbdbb160140120100806040200454035302520151050MDA含量/(μmo?L-1)SOD/(U?mL-1)ABCDEE

與假手術(shù)組比較：aP<0.05,aaP<0.01；與模型組比較：bP<0.05，bbP<0.01；與DEX組比較：cP<0.05，ccP<0.01；與DZ-L組比較：dP<0.05。

圖6杜仲黃酮對(duì)各組小鼠血清SOD活性和MDA含量的影響

2.7 杜仲黃酮對(duì)各組小鼠肺組織TGF-β1和Smad2表達(dá)的影響

從圖7結(jié)果可見：與假手術(shù)組比較，各組小鼠肺組織TGF-β1和Smad2表達(dá)量明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，DEX組小鼠肺組織TGF-β1和Smad2表達(dá)量明顯降低(P<0.05)，而DZ-H組小鼠TGF-β1和Smad2表達(dá)量明顯比DEX組降低(P<0.05)。與DZ-L組比較，DZ-H組小鼠TGF-β1和Smad2表達(dá)量明顯降低(P<0.05)。

ABCDEFTGF-β1β-ActinSmad2aabbbbcdbaabbbbbcdbb1.21.00.80.60.40.20.01.00.80.60.40.20.0TGD-β1/β-actinSmad2/β-actinABCDEF

與假手術(shù)組比較：aP<0.05,aaP<0.01；與模型組比較：bP<0.05，bbP<0.01；與DEX組比較：cP<0.05；與DZ-L組比較：dP<0.05。

圖7杜仲黃酮對(duì)各組小鼠肺組織TGF-β1和Smad2表達(dá)的影響

3 討論

急性肺損傷是由各種因素所致的肺彌漫性炎癥損傷，以呼吸窘迫及進(jìn)行性低氧血癥為特征，是臨床常見危重癥。多種病因均可誘發(fā)ALI，其中革蘭陰性菌感染所致的肺炎是ALI最常見的發(fā)病因素，內(nèi)毒素是革蘭陰性菌感染時(shí)解體后所釋放的一種毒性物質(zhì)，可激活機(jī)體的免疫體統(tǒng)，誘使TNF-α、IL-1β等炎癥細(xì)胞因子的釋放，引起機(jī)體急性炎癥，是目前研究ALI較理想的誘導(dǎo)劑[7]。雖然ALI致病機(jī)制目前尚未完全明確，但較多研究認(rèn)為肺組織的炎癥反應(yīng)失衡是導(dǎo)致各種ALI的根本原因[8]，而氧化損傷也是導(dǎo)致ALI的重要原因之一[9]。地塞米松是臨床上常見的一種糖皮質(zhì)激素類藥物，長(zhǎng)期過量用藥可引起較多的副作用，因此其臨床應(yīng)用受到一定限制。有研究表明地塞米松可較好地減輕ALI所致的肺組織損傷[10]，故本研究以地塞米松作為陽性對(duì)照藥，對(duì)比杜仲黃酮對(duì)ALI的影響。

近年研究發(fā)現(xiàn)杜仲黃酮具有抗氧化、消炎、抗衰老等多種藥理作用[4]。TNF-α和IL-1β等細(xì)胞炎癥因子，參與多種組織炎癥損傷，兩者含量高低可反映肺組織炎癥的嚴(yán)重程度[11]。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組比較，模型組TNF-α和IL-1β含量顯著升高(P<0.05)，而給予杜仲黃酮后可明顯降低細(xì)胞TNF-α和IL-1β含量(P<0.05)，表明杜仲黃酮可明顯減輕ALI所致的炎癥反應(yīng)。

BALF蛋白含量和肺濕干質(zhì)量比可反映肺組織血管通透性的異常以及肺水腫的嚴(yán)重程度[12]，而白細(xì)胞數(shù)量可間接反映肺組織中中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)情況以及炎癥的嚴(yán)重程度[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠蛋白含量、肺濕干質(zhì)量和白細(xì)胞數(shù)量均明顯升高(P<0.05)，表明模型組肺組織水腫和炎癥比較嚴(yán)重，提示造模成功。與模型組比較，杜仲黃酮給藥組小鼠蛋白含量、肺濕干質(zhì)量比和白細(xì)胞數(shù)量均明顯降低(P<0.05)，提示杜仲黃酮給藥組可改善肺組織水腫程度和炎癥程度，并呈劑量依賴性。此外，肺組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)模型組小鼠肺組織損傷嚴(yán)重，可見彌漫性肺水腫，肺泡壁和肺泡間隔明顯增寬，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。而給予杜仲黃酮后上述病理變化明顯減輕。

SOD和MDA是臨床常規(guī)使用的檢測(cè)機(jī)體抗氧化活性的兩個(gè)重要指標(biāo)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠血清SOD活性明顯升高(P<0.05)，MDA含量明顯降低(P<0.01)，給予杜仲黃酮后可明顯升高血清SOD活性(P<0.05)，降低MDA含量(P<0.05)，且呈劑量依賴性，表明杜仲黃酮可明顯減輕氧化應(yīng)激損傷，從而保護(hù)肺組織。

TGF-β1是一種多功能的細(xì)胞因子，其在細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化、胚胎發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)、損傷后修復(fù)等方面均起著十分重要的作用，TGF-β1是ALI后纖維化密切相關(guān)的細(xì)胞因子之一，其致纖維化作用最強(qiáng)[15]。Smads作為TGF-β1的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，研究表明[16]TGF-β1多種生物功能的發(fā)揮需要Smads蛋白的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及精準(zhǔn)調(diào)控。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，杜仲黃酮給藥組小鼠肺組織TGF-β1和smads表達(dá)量明顯降低，表明杜仲黃酮通過調(diào)節(jié)TGF-β/Smad信號(hào)通路，從而對(duì)ALI起保護(hù)作用。

綜上所述，杜仲黃酮對(duì)LPS所致的急性肺損傷具有較好的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)TGF-β/Smad信號(hào)通路有關(guān)。